全 文 ：© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
园 　艺 　学 　报 　2004 , 31 (5) : 685～687
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2004 - 03 - 17 ; 修回日期 : 2004 - 07 - 20
河南 17 个桂花品种的 RAPD 分析
尚富德　伊艳杰　张　彤
(河南大学生命科学学院 , 开封 475001)
摘 　要 : 采用改良 CTAB 法提取河南 17 个桂花品种的基因组 DNA , 利用 RAPD 技术对其进行鉴定和
分类研究。从 100 个 10 bp 的随机引物种筛选出 15 个扩增效果较好的引物进行扩增 , 共产生 121 条带 , 其
中 87 条为多态性带。根据扩增结果进行聚类分析 , 得出反映各品种间亲缘关系的树状图。各个品种群内的
不同品种间的亲缘关系接近 , 而不同品种群间亲缘关系较远。RAPD 对基因组的分析结果与传统分类学的
结果基本相符。
关键词 : 桂花 ; RAPD ; 品种 ; 分类
中图分类号 : S 685113 　　文献标识码 : A 　　文章编号 : 05132353X (2004) 0520685203
The RAPD Analysis of 17 Osmant hus f ragrans Cultivars in Henan Province
Shang Fude , Yi Yanjie , and Zhang Tong
( College of L if e Sciences , Henan U niversity , Kaif eng 475001 , China)
Abstract : Applying an improved CTAB method to extract DNA from leaves of Osmanthus f ragrans , studied
the classification and identification of 17 Osmanthus f ragrans cultivars in Henan province by the technique of ran2
dom amplified polymorphic DNA ( RAPD) . Fifteen better 10 bp primers which were selected from one hundred ar2
bitrary primers were applied to be amplified. Total 121 bands were produced , with which 87 bands were polymor2
phic. Genetic distance between each of the cultivars were calculated from simple matching coefficies. A dendrogram
showing genetic relationships was constructed through an unweighted pair2group method. The genetic relationship of
cultivar among different cultivar groups is farther than that in the same cultivar group . This conclusion is consistent
with traditional cultivar classification. RAPD technology provides a few of new evidences for cultivar identification
and classification to Osmanthus f ragrans cultivars in Henan province.
Key words : Osmanthus f ragrans Lour. ; RAPD ; Cultivar ; Classification
1 　目的、材料与方法
桂花 ( Osm anthus f rangrans Lour. ) 原产我国。90 年代初朱长山等就对河南省桂花品种资源进
行了较为系统的调查 , 并根据生理学和形态学特征对其进行分类〔1〕。1995 年陈建业等利用同工酶技
术研究了河南部分桂花品种〔2〕。近年来 RAPD 技术被应用于桂花品种分类〔3〕。本研究利用 RAPD 技
术对在河南省栽培较为广泛的 17 个桂花品种进行亲缘关系的分析 , 旨在进一步明确河南的桂花品种 ,
为引种和育种材料选择提供参考。
试验材料为 4 个品种群的 17 个品种 (表 1) , 均于 2003 年初夏在河南各地采集。将新鲜嫩叶用
硅胶快速干燥后带回实验室 , 用双蒸去离子水冲洗干净 , 放入塑料袋中置于 - 70 ℃冰箱备用。
DNA 的提取和扩增参见文献 〔3〕和 〔4〕。扩增后产物用 2 %琼脂糖凝胶走电泳 , 电泳缓冲液为
1 ×TAE , 用 100 bp DNA ladder 做分子量标记 , 在凝胶中加入 015μg/ mL EB , 电泳完毕后在紫外灯
下观察照相。选择重现性好且稳定的扩增反应谱带进行系统分析 , 每条谱带作为一个性状 , 重现性强
或亮度强的记为 1 , 重复性弱 , 亮度差或无带的记为 0 , 根据公式 F = (2 X ab/ X a + Xb) ×100 %(其中
X ab表示品种 a 和品种 b 共有片段总和 , X a 表示品种 a 片段总数 ; Xb 表示品种 b 片段总数) 计算出
© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
不同品种间的相似系数 , 各个品种之间的遗传距
离 P = 1 - F , 根据遗传距离利用计算机程序
STA TISTICA 进行各品种间的聚类分析 , 得出树
状系统聚类图 , 作为桂花品种分类的依据。
2 　结果与分析
211 　不同引物的扩增结果
用筛选出的 15 个引物对 17 个品种进行扩增 ,
每个引物至少重复扩增 1 次以肯定重现性。共扩
增出 121 条重复性好、谱带清晰的 DNA 带 , 其
中 87 条具多态性 , 占总带数的 7119 %。平均每
个引物扩增的 DNA 带数为 8107 条 , 多态性 DNA
的带数为 518 条。在 121 条扩增带中 , 有 7 条为
全部检测产品所共有 ( S72900 bp , S9221800 bp ,
S1932800 bp , S40821031 bp , S51321200 bp , S11422
1500 bp , S21102950 bp) 。这在一定程度上表明了
各品种间的同源性。不同引物扩增的各品种 DNA
表 1 　用于 RAPD 分析的桂花品种
Table 1 　The cultivars of O. f ragrans used in RAPD analysis
品种群
Group
编号
No.
品种名
Cultivars
来源
Origin
四季桂 1 月月桂 Yueyuegui 潢川 Huangchuan
Fragrans 2 日香桂 Rixianggui 漯河 Luohe
3 四季桂 Sijigui 舞钢 Wugang
4 皱叶四季桂 Zhouye Sijigui 潢川 Huangchuan
银桂 5 籽银桂 Ziyingui 许昌 Xuchang
L atif olius 6 大叶黄银桂 Dayehuang Yingui 潢川 Huangchuan
7 小叶银桂 Xiaoye Yingui 漯河 Luohe
8 山银桂 Shan Yingui 漯河 Luohe
9 柳叶银桂 Liuye Yingui 舞钢 Wugang
10 晚银桂 Wan Yingui 潢川 Huangchuan
丹桂 11 籽丹桂 Zidangui 漯河 Luohe
A urantiacus 12 齿丹桂 Chidangui 舞钢 Wugang
13 朱砂丹桂 Zhusha Dangui 潢川 Huangchuan
金桂 14 大花金桂 Dahua Jingui 潢川 Huangchuan
Thunbergii 15 潢川金桂 Huangchuan Jingui 漯河 Luohe
16 金桂 Jingui 漯河 Luohe
17 圆叶金桂 Yuanye Jingui 漯河 Luohe
片断大小从 400 bp 到 2500 bp , 其中尤以 500～1200 bp 之间最多。不同引物扩增出的带数不同 ; 同一
引物 , 不同供试材料间扩增带数也不相同 ; 这充分表现了桂花遗传背景的复杂性和 DNA 的多态性。
212 　供试材料特有的 RAPD 标记
在不同引物的扩增产物中 , 仅个别品种在某一片段长度有条带出现。例如 , 丹桂品种群在 S21102
480 bp 处均有扩增产物 , 而其他品种群都无扩增。因此这一条带可作为丹桂品种群的特殊标记。目前 ,
品种的特殊谱带标记已作为重要的分子性状用于品种鉴定〔4〕。在供试的 17 个材料中 , 有 14 个产生了特
征带 , 占 8213 %。仅利用引物 S1142、S2110 (图 1) 的扩增结果就可区分出河南 17 个桂花品种。
图 1 　引物 S1142 和 S2110 扩增的 RAPD 反应结果
M : DNA marker , 100 bp DNA ladder ; N : 阴性对照 ; 数字分别与表 1 品种对应
Fig. 1 　RAPD patterns amplif ied by primer S1142 and S2110
M : DNA marker , 100 bp DNA ladder ; N : Negative control ; Numbers refer to the cultivars listed in table 1
686 园 　　艺 　　学 　　报 31 卷
© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
213 　桂花品种的聚类分析
　　对基于 RAPD 标记建立起来的桂花品种亲缘
关系树状图进行分析 (图 2) , 所有供试材料的遗
传距离都大于零 , 又都能够聚类在一起。这表明
桂花品种之间既有相同遗传背景 , 但相互之间又
存在一定差异。在遗传距离 0125 处做结合线 l1 ,
在 01175 处做 l2 , 在 0105 处做 l3 。在结合线 l1 处
将各品种划分为四季桂类和秋桂类两大类 ; 在结
合线 l2 处 , 秋桂类又分为金桂、银桂、丹桂 3 个
品种群 ; 在结合线 l3 处 , 可区分出 17 个不同桂
花品种。从树状图上看 , 四季桂和皱叶四季桂的
遗传距离仅为 010616 , 亲缘关系非常近。从形态
上讲 , 二者差别主要在于叶片。这与刘玉莲〔5〕提
出的五级分类标准中将营养器官性状作为最后一
级分类标准相符。
3 　讨论
从演化的观点分析 , 四季桂类应比秋桂类原
始 , 而秋桂类中又以银桂品种群较为原始 , 丹桂
图 2 　根据 RAPD 结果构建的 17 个桂花品种亲缘关系树状图
Fig. 2 　The dendrogram of 17 Osmanthus f ragrans
cultivars based on RAPD results
品种群出现最晚〔6〕。从 17 个桂花品种的亲缘关系树状图来考察 , 3 个秋桂类品种群首先聚在一起 ,
与四季桂的遗传距离较远。在四个品种群中 , 丹桂品种群和金桂品种群的遗传距离最为接近 , 推断丹
桂可能是由金桂芽变而来 , 而且在南京雨花台和苏州留园也发现有金桂芽变而成丹桂的现象。
本试验的供试材料之一小叶银桂 , 属于银桂品种群 , 将其定为标准株后 , 观察到的形态和生理特
征明显不同于该品种群的其他品种。经上述 RAPD 分析 , 的确在基因组水平上同其他品种存在差异 ,
因此确立为是一个新品种 , 并将其定名为小叶银桂。由此可见 , 将形态分类和 RAPD 技术相结合 ,
能更有效地进行品种分类。赵小兰等分别用数量分类和 RAPD 方法对湖北的桂花品种进行研究 , 并
将两种方法进行比较 , 也认为 RAPD 方法优于数量分类方法〔3 ,7〕。
但应该注意的是 RAPD 所能提供的是显性标记 , 部分遗传信息难以表达。虽然品种群间的遗传
差异远远大于品种群内各品种之间的差异 , 品种群内个体差异对反映品种群间的关系影响不大 , 但若
能增加各品种群内的取样数目 , 对部分在全国广泛分布的品种适当考虑分居群取样 , 将会有助于更为
清晰准确地把握其系统发育关系。Nei 认为 , 对所用样本数较少的群体 , 通过分析大量的基因位点可
以抵消由样本数较少引起的误差〔8〕。而增加引物的数目 , 是 RAPD 获得大量基因位点的重要措施。
本试验中所取的引物数目相对来说还显不够 , 不足以反映整个群体的实际情况。因此 , 对河南桂花品
种间亲缘关系的认识还应增加引物的数量来做进一步的探讨。
参考文献 :
1 　朱长山 , 李瑞付. 河南桂花品种的分类研究. 河南农业大学学报 , 1992 , 26 (2) : 194～201
2 　陈建业 , 宁玉霞. 河南桂花品种过氧化物同工酶研究. 园艺学报 , 1995 , 24 (5) : 310～311
3 　赵小兰 , 姚崇怀. 桂花部分品种的 RAPD 分析. 华中农业大学学报 , 1999 , 18 (5) : 484～487
4 　Schnell R J , Ronning C M , Knight J T R J . Identification of materials and validation of genetic relationships in M angif era indica L . using
RAPD markers. Theor. Appl. Genet . , 1995 , 90 : 269～274
5 　刘玉莲. 桂花品资源及其分类研究. 江苏林业科技 , 2000 , 27 : 27～31
6 　向其柏. 中国桂花 (申报桂花品种国际登陆权论文集Ⅱ) . 吉林 : 吉林科学技术出版社 , 2002. 10 , 1～12
7 　赵小兰 , 陈振锋. 武汉地区桂花品种的数量分类研究. 湖北民族学院学报 (自然科学版) , 1998 , 16 (6) : 11～15
8 　Nei M. Estimation of average heterozygosity and gentic distance from a small number of individuais. Genetics , 1978 , 89 : 405～419
786　5 期 尚富德等 : 河南 17 个桂花品种的 RAPD 分析