全 文 ：园 艺 学 报 2003，30(4)：389～393
Acta Horticuhurae Sinica
两种柑橘线粒体 DNA的获得与 AFLP分析
曹庆芹 伊华林 邓秀新
(华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室，园艺林学学院，武汉 430070)
摘 要 ：为了研究柑橘种属间线粒体基因组的遗传多样性以及温州蜜柑胞质雄性不育的分子基础，采
用了两个柑橘品种 ‘国庆 1号’温州蜜柑和无核 ‘冰糖橙 ’的胚性愈伤组织作为提取线粒体的材料。不连
续蔗糖梯度超速离心法纯化线粒体。提取的线粒体完整 ，具很强 的荧光活性。mtDNA片段在 20 l【b左右 ，
且无降解。叶绿体探针 rub／sco L、核探针 45 s rRNA Southem bloting没有检测到叶绿体 DNA与核 DNA，而线
粒体探针 apt6杂交获得一条 5 kb大小的带，说明用此提取方法可获得无污染的 mtDNA。4对 AFLP引物共
得到 98条带 ，其中 14条带有多态性。
关键词：柑橘；线粒体 DNA；Southem bloting； 1IJP
中图分类号 ：S 666 文献标识码 ：A 文章编号：0513．353X (2003)04-0389-05
线粒体有 自己的一套基因组，为半 自主的遗传系统 ，能够编码呼吸传递链上一些重要酶的组分及
膜蛋白等。模式植物拟南芥的线粒体基因组 DNA测序已经完成，且现已知有52种酶是线粒体 DNA编
码的⋯1。除拟南芥线粒体基因组研究较为清楚外，其它植物，尤其是木本植物线粒体基因组的研究，
出于生态学或驯化瓶颈的目的，主要是追踪树木线粒体遗传物质的漂流【2 J，以及研究胞质基因组的
遗传分化。而其它农作物的研究大多集中于线粒体 DNA与胞质雄性不育的关系这一领域【5j。大部分
被子植物线粒体属母性遗传，线粒体 DNA相对于核基因组来说要稳定得多，作为分子进化研究的手
段具有重要作用。在柑橘等果树植物中曾有关于温州蜜柑的雄性不育是由核质互作引起的报道【6J。由
于木本植物黄化苗不易获得 ，无疑为提取线粒体 DNA增加了难度。因而作者着重于探讨线粒体 DNA
提取材料的选择及线粒体 DNA的提取和纯化 ，并分析柑橘不同品种线粒体基因组之间的差异。
1 材料和方法
1．1 材料
国庆 1号 (Citrus unshiu Marc．‘Guoqing 1’)、冰糖橙 (C．sinensis Osbeck‘Bingtang Cheng’)胚性
愈伤组织为华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室细胞分室诱导培养。
1．2 线粒体的提取和纯化
柑橘胚性愈伤组织线粒体的分离、纯化参照 Mignouna等【 ]的方法并加以改进。取培养 20 d左右
正处于分裂期的胚性愈伤组织 30 g左右，按 3 m_IJg加入研磨缓冲液 (Tris．HC1 0．05 mol／L，蔗糖
0．5 mol／L，EDTA 0．005 mol／L，BSA 0．1％，巯基乙醇0．1％，pH 7．5)，用预冷的高速组织捣碎器捣碎
至糊状，尼龙纱布过滤，收集滤液。滤液于 1 200 g，4℃离心 15 min。收集上清液后，再于 4~C，
16 000 g离 心 20 min。加 少 量 的 预 冷 的 悬 浮 缓 冲液 (Tris．HC1 0．05 mol／L，蔗 糖 0．3 mol／L，
MgC12 0．01 mol／L，pH 7．5)，用 毛笔轻搅沉 淀。补加悬浮缓 冲液至 1／5体 积，4~C，1 200 g离 心
15 min。取上清液至另一离心管，16 000 g离心 20 min，用 2 mL悬浮缓冲液悬浮沉淀，按 25 t,e,／g鲜
样加入 DNase I，冰浴 2 h以去除核基因组 DNA。加入 EDTA·Na2，终浓度 0．2 mol／L，终止反应。
收稿日期 ：2002—11—11；修回日期：2003—03—31
基金项目：国家自然科学基金项目 (30070079，30170472)
★通讯作者
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配制蔗糖 梯度溶液，按 由高到低 的顺 序将 蔗糖溶 液 60％ (330 t,L)，52％ (830 t,L)，36％
(1 mL)，20％ (830 tL)，依次铺人 6个 5 mL透明管中，室温放置 1 h，然后将 2 mL粗制线粒体悬浮
液平均铺于斜面上。100 000 g，4cI二水平离心 50 min(Beckman SW55)。收集分层于 36％ 52％界面的
线粒体，置于冰上，小心滴加4倍体积的匀浆缓冲液 (未加巯基乙醇和BSA)，混匀，16 000 g 4~C离
心 10 min，沉淀即为纯化的线粒体。
1．3 线粒体裂解及 DNA纯化
线粒体沉淀加入 1 HlL裂解缓冲液 ( s．HC1 0．05 mol／L，EDTA·Na2 0．001 mol／L，pH 8．0)悬浮
沉淀。加蛋白酶 K至终浓度 0．5 ms／mE，10％ SDS至终浓度 1％，摇匀，37~C反应 90 min裂解线粒
体。加入等体积的苯酚：氯仿：异戊醇 (25：24：1)，缓慢混匀 10 min，10 000 g离心 10 min，使两相分
开，取上层水相，加入 10 10 nc／mL RNase A，37~C保温 1 h。重复这一步骤。取上层水相，加水饱
和乙醚至满管 ，除去残留的苯酚、氯仿。水相中加入 1／10体积的 5 mol／L(NH4)2 Ac及 2．5倍体积的
无水乙醇沉淀线粒体DNA。70％乙醇浸泡2次。自然干燥，溶于30 TE溶液中，一20~C保存备用。
1．4 荧光素染色
取2 纯化后的线粒体稀释一定倍数后取少量于 40倍物镜下观察。其余稀释液加人荧光素
(FI)A)染色，吸少许滴到载玻片上，轻覆盖玻片，置于万能显微镜下进行荧光激发，观察照相。
1．5 mtDNA纯度检测
1．5,tg mtDNA，EcoRI(MBI公 司生产 )酶切 12 h，0．8％琼脂糖凝胶，1．5 V／cm 电泳 18 h。
Southem印迹参照分子克隆实验手册【8]。用玉米线粒体探针 atp6，长 2．7 kb；柑橘叶绿体探针 rub／sco
L，长 1．3 kb；柑橘 45 S rRNA，长 0．7 kb。
1．6 AFLP分析
EcoRI接头：Ead5 5．CTCGTAGA Cr]GCGTACC，Ead3 5．AAT1W_,GTACGCAGTCTAC；
MseI接头：Mad5 5．GACGATGAGTCCTGAG，Mad3 5-TACTCAGGACIVAT；
前扩增引物：EA00 5 ．GTA GAC TGC GTA CCA ATrC A．3’；MC00 5’．GAC GAT GAG TCC TGA
GTAA C-3 ；
选择性扩增引物 ：CMC02 5-GAT GAG TCC TGA GTAA CTA．3 ：EA03 5 ．GAC TGC GTA CCA
ATrC ACG-3 ； E01 5-GAC TGC GTA CCA ATrC AGC-3 ； E02 5-GAC TGC GTA CCA ATrC ACC．3 ；
E05 5 -GAC TGC GTA CCA ATrC A 3 ：
EcoRI和 MseI酶切目的基因组 DNA；常温下连接接头；将连接产物稀释 10倍。预扩增反应程
序：94cI二30 S，56cI二1 min，72~C 1 min，20 个循环。然后将预扩增产物稀释 50倍用于下一轮的扩增
模板。选择性扩增 PCR反应程序：第一轮循环 ，94℃ 30 S，65℃ 30 S，72~C 1 min；第 2 13轮循环，
DNA退火温度每次递减 0．7~C，其余步骤同第一轮；第 14—36循环，退火温度 56~C，其余步骤同第
一 轮循环。6％聚丙烯酰胺变性凝胶电泳分离选择性扩增产物后银染显示【引。
2 结果与分析
2．1 线粒体活性
40倍光学显微镜下可观察到椭圆形的线粒体。线粒体荧光素染色后荧光激发呈绿色 (图 1)，说
明提纯后的线粒体是完整的，具有一定的活性。
2．2 柑橘 mtDNA纯度
琼脂糖凝胶电泳 EB染色后紫外灯下观察到 20 l【b左右的 mtDNA带，所含杂质少 ，没有出现降解
现象，说明通过上述提纯方法，能得到大片段线粒体 DNA片段。
提取高纯度的 mtDNA是利用分子手段研究线粒体的前提。利用差速离心去掉核、质体及碎片，
过量的 DNase处理可以酶切掉破裂的核 DNA、mtDNA、质体 DNA。不连续蔗糖梯度离心对线粒体进一
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4期 曹庆芹等 ：两种柑橘线粒体 DNA的获得与 AFLP分析 39l
步纯化，理论上能完全排除其它基因组 DNA的污染。利用叶绿体 rubisco L、核探针 45 s rRNA杂交结
果 (图2)可以看出没有得到相应的杂交带 ，而用线粒体探针 atp6杂交得到一条亮带，说明所提取的
DNA即为mtDNA，且无质体和核 DNA的污染。
2．3 mtDNA AFLP扩增
采用4对引物组合检测了柑橘品种国庆 1号和冰糖橙线粒体 DNA之间的差异，如图 3所示，上
述方法所提纯的线粒体 DNA经 砌、MseI双酶切，预扩增和选择性扩增，聚丙烯酰胺凝胶电泳可
以得到几十条清晰的亮带。由于植物线粒体基因组小，大小在 200～2 000 kb，扩增得到带的总数远
远小于总 DNA的数目，在柑橘基因组中可以得到平均 100条以上的带【m]。4对引物共产生98个 AFLP
标记，其中 15个标记有多态性。引物对 CMC02／EA03、CMC02／E01以及 CMC02／E05可以检测出冰糖
橙和国庆 1号线粒体基因组之间比较丰富的差异。国庆 1号、冰糖橙分属于宽皮柑橘、甜橙两个不同
的柑橘种，尽管柑橘线粒体属母性遗传，但这也说明柑橘线粒体基因组在进化过程中可能发生了基因
重排或突变等现象。
图 1 ‘国庆 1号’线粒体荧光素 (FDA)染色
箭头所示为线粒体
．
1 Fluorescent dyeing of ‘C,uoqing1’mitodaomtria
The arrow head indicated the mitochondria
C
图2 ‘国庆 1号’线粒体 DNA中叶绿体 DNA
‘ 和核 DNA的 Southern检测
A．线粒体探针 apt6；B．叶绿体探针 rub／sco L；
C．核探针 45 s rRNA；
1．标准分子量 L／H／rid II；2．EcoRI酶切的 mtDNA。
． 2 cpDNA and nuclearDNA Southei3n detectionin purified
mitochondriai DNA of‘C,uoqing 1’ ltgⅡm
A．Mitochondrial probe apt6；B．Chloroplast probe rubLwo L；
C． Nuclear probe 45 s rRNA；
1．Standard molecularweight L／H／rid III；
2． EcoRI-digested mtDNA．
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A B C D
图3 mtDNAAFLP分析结果
A，B，C，D分别为引物对 CMC02／EA03，CMC02／EO1，
CMC02／E02。CMC02／E05；
1．国庆 1号．2．冰糖橙。
№ ．3 AFLP analy~ ofmtDNA
Lanes maiked A—D are CM002／EA03．CMC02／EO1．
CMC02／E02，C,MC02／Eft3；respectively；
1． ‘Cumins 1’satsuma．2． ‘Bingtang Cheng’
sweet orange respectively．
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392 园 艺 学 报 30卷
3 讨论
植物线粒体基因组的结构比较复杂，存在大量的内含子 、重复序列及非编码序列 ，不同于动物中
只含有调控区和编码序列的线粒体基因组。近年来在玉米、黄瓜等作物线粒体的研究中还发现类质粒
的存在u 。大多数被子植物线粒体属于母性遗传，从分子水平上对线粒体进行研究不仅能寻找出不
同物种之间的亲源关系，还可以克隆与自然界某种特异现象有关的线粒体基因，如玉米胞质雄性不育
基因。 38，柑橘抗黑星病基因ACRS J等。柑橘等木本植物线粒体基因组的研究较其它农作物起步
晚，进展缓慢，主要是由于木本植物有性杂交后代繁殖选育以及分离高纯度、足够量的线粒体细胞器
等不易，阻碍了线粒体基因组的研究。无性繁殖的少核、无核木本植物无法通过获得种子培养黄化
苗。采用成熟叶片获得的线粒体 DNA量少，杂质多，又极易降解，用传统的纯化线粒体的方法 Csa’
超速离心，仍然很难避免叶绿体 DNA的污染n引。柑橘果实在发育过程中可以产生未发育的胚珠，利
用诱导未发育胚珠获得的胚性愈伤组织作为提取线粒体的材料，优点在于可大量获得丰富的幼嫩组
织，不受田间生长的限制，且能排除叶绿体 DNA的污染。
线粒体基因是比较保守的，通常只在基因的 5 或 3 侧翼序列表现出异质性n引，且由于 自身高度
重组等特性 ，内含子区域变异很大。xu等 ¨J认为由于分离线粒体非常困难，建议用胞质基因特异性
探针与总 DNA进行 RFLP分析。R兀【P结果虽然可靠，但能检测的酶切位点有限。Sane等【l6J用 16个
线粒体探针没有发现两个包含相同胞质的水稻品系的多态性，而 4o条 RAPD引物中的 25条均检测到
了这两个品系的线粒体 DNA的差异。Jaiswal等 17)对 7个高粱恢复系的线粒体 DNA RAPD分析结果表
明能够按照恢复系能力的不同区分它们。RAPD检测效率虽高，但重复性差，对后续工作的开展，如
克隆测序等十分不利。本试验采用的 A兀P技术具有以上两种分子标记的优点。凌杏元等【lsJ将 A兀P
技术应用到水稻线粒体的研究，从 M／P^ 引物对中筛选到了不育系与保持系差异带 ZA1，ZA2，ZA3，
Northern分析表明 zA2、ZA3两片段在不育系、保持系和 F。杂种中的转录有差异【19]。国庆 1号与冰糖
橙线粒体 DNA的 Af’L．P分析表现出差异，与电镜观察和限制性内切酶图谱结果是一致的 J。
国庆 1号为雄性不育类型，多年的杂交、回交试验已证明为细胞质雄性不育l6J。摸清不同柑橘品
种胞质的分子基础，无疑为利用原生质体融合的方法H 20J转移胞质创造新的雄性不育种质及寻找新
的柑橘胞质类型，避免单一胞质类型的遗传脆弱性带来曙光，也为研究柑橘不同属种问 mtDNA之间
的变异和柑橘品种的分子演化研究提供依据。
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Obtaining mtDNA of Two of C／trus and the AFLP Analysis
Cao Qingqin，Yi Hualin，and Deng Xiuxin
(National Key Laboratory of Crop Genetic Improtemem，and Colege of Hort／o．dt~e and Forestry，Huazhong Agr／ctdatra／U,av~uy，
Wuhan 430070，Ch／na)
Abstract： To study the genetic diversity of mitoehondrial genome in C／trus and molecular mechanism of
cytoplasmic male sterility in Satsuma mandarin (C．unshiu)，we present a method for isolation of mitochondrial
DNA from embryogenic callus of C／trus． The results showed that discontinuous sucrose density s~ lient
centrifugation method was efective for purifying mitochondria which possessed fluorescent activity． Southem blotting
showed no contamination of cpDNA and nuclear DNA using chloroplast probe rubisco L， nuclear probe45 s rRNA
respectively where as a 5 kb size fragment was gained after being hybridized by mi toehondrial probe apt6．
Consequently we acquired high pure， not contaminated big segment of mtDNA． Th e fragments of polymorphic
mtDNA extracted from Guoqing 1 Satsuma mandarin and Bingtang Cheng sw6~t orange were found by AFLP assay．
Key words：C／trus：mtDNA；AFLP (amplifed fragment length polymorphism)；Hybridization；Extmction
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