全 文 ：园 艺 学 报 2004，31(2)：215—216
Acta Horticu／turae Sinica
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柑橘体细胞杂种超低温保存后的植株再生
王子成 邓秀新”
(华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室，武汉430070)
摘 要：对9年生印度酸橘 (Citrus reticaulata)和飞龙枳 (Poncirus trifoliata)的体细胞杂种的茎段进
行离体培养得到再生植株，用改良的玻璃化法对再生植株茎尖进行超低温保存后获得92％的再生率。这是
柑橘体细胞杂种茎尖超低温保存的首例报道。
关键词：柑橘；体细胞杂种；离体培养；超低温保存
中图分类号：S 666 文献标识码：A 文章编号：0513-353X (2004)02-0215-02
Plant Regeneration from the Cryopreserved Somatic Hybrid of Citrus
Wang Zicheng and Deng Xiuxin
(The National Key Laboratory ofCrop Genetic Improvement，Huazhong Agricultural University，Wuhan 430070，China)
Abstract：The aUotetraploid citrus somatic hybrid is a new kind of germplasm created via protoplast fu—
sion． We have succeeded in culturing the stems of 9 year—old tree of the somatic hybrid of Cleopatra Mandarin
(Citrus reticaulata)and Flying Dragon(Poncirus trifoliata)in vitro，later cryopreserved its shoot tips from
in vitro and got regeneration rate by 92％ of the cryopreserved shoot—tips． This is the first report on the cryopr—
eservation of citrus somatic hybrid shoot—tips．
Key words：Citrus；Somatic hybrid；Culture in vitro；Cryopreservation
1 目的、材料与方法
迄今全世界通过PEG或电融合法已获得200多例柑橘种间、属间甚至族间的体细胞杂种植株 J。
有些杂种由于双亲遗传物质的不协调，生长势较弱，在田间易受到不良环境因素的影响而使其生存受
到威胁。本文报道对柑橘体细胞杂种离体培养并进行超低温保存的研究结果。
材料为9年生飞龙枳与印度酸橘 (Citrus reticaulata+Poncirus trifoliata)的体细胞杂种，由美国佛
罗里达大学Grosser教授提供。取田间植株半木质化新梢，用10％次氯酸钠消毒15 min，无菌水冲洗
4次，然后于无菌条件下在培养室内放置2 d再用10％次氯酸钠进行二次消毒，无菌水冲洗4次后接
种于MT培养基 (附加不同配比的植物生长调节剂)。待芽体萌生以后继代培养。培养3～4代的材料
接种于1／2 MT附加不同植物生长调节剂的生根培养基上生根，或取继代20 d左右的试管苗，切取带
3～4个叶片的梢端，在预培养基上分别进行暗培养和光培养，然后切取2～2．5 mm长的茎尖，在预
处理溶液中处理30 m_in，转人PVS2中进行不同时间脱水处理，投人液氮至少24 h后，在40℃水浴中
迅速化冻，在1．2 mo]／L蔗糖+MT溶液中洗涤4次，每次 10 min，再接人添加不同浓度还原型谷胱
甘肽 (GSH)的培养基上暗培养1 d后转移至相同的培养基上，6 d后转人光下培养。待材料恢复生
长至2～3 cm高时转人生根培养基。再生率=再生植株数／处理茎尖数×100％。
2 结果分析与讨论
2．1 离体培养
收稿日期：2003—05—27；修回日期：2003—07—28
基金项目：国家自然科学基金资助项目 (30123001)；国家博士点基金项目
现在工作单位：河南大学生命科学学院475001； 通讯联系人 Corresponding author
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2l6 园 艺 学 报 3l卷
该体细胞杂种初代培养时，最佳的植物生长调节剂配比为BA 1．5 ms／L+IBA 0．1 ms／L+GA3 0．5
m L。3周后需进行继代。此时如果将萌发的新梢直接切割下来继代，则大多数的新梢会从生长点开
始发生愈伤化，继代无法进行，但如果新梢带一部分老组织继代，则发生愈伤化的几率减小。如果用
葡萄糖代替蔗糖，材料生长较好，添加酸性水解干酪素亦有利于材料的生长。BA和KT合用 (各为
0．5 ms／L)，有利于该体细胞杂种的快速繁殖，最高繁殖系数可达l2芽／50 d。含2．5 ms／L NAA的培
养基利于该体细胞杂种的生根，生根率达到90％(45／50)。
2．2 飞龙枳与印度酸橘体细胞杂种的超低温保存及植株再生
2．2．1 预培养时间对成活率的影响 在以前的研究中 发现，用添加5％DMSO (二甲基亚砜)的培
养基进行预培养，由于DMSO易对材料造成毒害，因而不利于超低温保存，所以本试验中改用0．5
mol／L甘油+5％蔗糖，附加不同浓度GSH的培养基进行预培养。结果表明，预培养时间以3 d为好
(图1)，GsH浓度以40 ms／L为佳 (图2)。
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图1 预培养时间对成活率的影响
Fig． 1 Efect of pre-culture tinle on survival
0 20 40 60
GSH(mgm)
图2 预培养时GSH浓度对成活率的影响
Fig． 2 Efect of GSH concentration medium Oil survival
2．2．2 PVS 处理时间对成活率的影响 PVS 处理时间长短直接影响超低温保存的成败，处理时间
短则脱水不足，在保存中不能形成玻璃化状态，处理时间过长则由于玻璃化溶液的毒害作用而使材料很
难存活或不易再生。本试验中PVS 处理时间以60 min为佳，与幼年态枳壳茎尖的处理结果 一致。
2．2．3 恢复生长培养基中GSH浓度对成活率的影响 在恢复生长培养基中添加自由基清除剂GSH
有利于超低温保存后的恢复生长，提高成活率和再生率，20 ms／L成活率最高 (图3)。但浓度增高
(超过10 ms／L)会使茎尖产生愈伤组织，因此以
10 ms／L为好。
2．2．4 超低温保存后体细胞杂种的再生 用改良
的超低温保存方法进行保存后的体细胞杂种茎尖
在添加 GSH 10 ms／L的恢复培养基上进行培养，
3周后统计 60个芽，成活率达 95％ (保持绿
色)，再生率达92％ (芽萌发并继续生长)，将恢
复生长的植株移至生根培养基上，2周后统计，
生根率达到 100％，没有发生形态上的变异。将
再生植株移栽，很易成活。取其叶片用流式细胞
仪进行倍性测定，表明再生植株仍然为四倍体。
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图3 恢复培养基中GSH浓度对成活率的影响
Fig．3 Efect of GSH concentration in the recovery
mediuin oil survival
参考文献：
1 Liu Jihong，Deng Xiuxin．Production of somatic hybrid plants between soar orange and sweet orange via electrofusion for creation of CTV
— re—
sistant rootstock． Acta Phytophysiologica Sinica
， 2001，27 (6)：473～477
2 王子成，邓秀新．玻璃化法超低温保存柑橘及植株再生．园艺学报，2001，28(4)：301～306
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