全 文 ：园 艺 学 报 2002, 29 ( 2) : 141~ 144
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期: 2001- 05- 04; 修回日期: 2001- 07- 19
韭菜组织培养高频植株再生体系的研究
张 松 达克东 曹辰兴 曹淑荣 黄金丽
(山东农业大学园艺学院, 泰安 271018)
摘 要: 通过对韭菜组织培养过程中激素配比、外植体、基因型、苗龄及生根条件的研究, 建立了一
次性诱导成芽的高频植株再生体系。适于愈伤组织和不定芽分化的最佳培养基为 MS + NAA 1 mg/ L+ BA
2 mg / L, 在此分化培养基上 911、918、保定红根、寿光马蔺韭和兰州小韭根尖培养的芽分化频率分别为
78. 7%、83. 7%、81. 9%、76. 7 %和 73. 3 % , 平均出芽数分别为 40. 1 、46. 7、36. 3 、35. 4 和 44. 5 个,
苗龄为7~ 10 d 的根尖最适于组织培养。随苗龄增加, 芽的分化频率呈下降趋势。无任何激素的MS0培养
基最适于不定芽的生根, 生根率达 100% , 平均根数 14. 5条。卡那霉素 ( Km) 对植株再生有很强的抑制作
用, 在Km 为 20 mg/ L 时就完全抑制愈伤组织和不定芽的发生; 羧苄青霉素 ( Carb) 和噻孢霉素 ( Cef) 也抑
制韭菜根尖培养的植株再生, Cef的抑制作用更加显著, Carb 500 mg/ L 或 Cef 300 mg/ L 完全抑制不定芽的再
生; Timentin 对愈伤组织和芽的分化影响不大, 抑制性主要表现在出芽数随浓度升高而降低。当T imentin 浓
度为 500 mg/ L时, 平均出芽数仍可达到 23. 8 个, 为对照的 49. 4% 。
关键词: 韭菜; 根尖; 组织培养; 植株再生; 抗生素
中图分类号: S 633. 3 ; Q 813 文献标识码: A 文章编号: 0513353X ( 2002) 02014104
韭菜 ( Allium tuberosum Rottl. ex Spreng. ) 的组织培养研究较少, 植株再生频率较低1 , 制约了基
因工程技术在韭菜遗传改良上的应用。作者研究了影响韭菜组织培养植株再生的主要因素, 建立了高
频植株再生体系, 为今后进行基因转移奠定基础。
1 材料与方法
除基因型试验外, 其它均以 918为试材。韭菜种子先用 70%酒精浸泡 5 min, 再用 0. 1%升汞溶
液消毒10 min, 然后用无菌水冲洗 3遍, 置于MS 基本培养基2 上。培养基中蔗糖 30 g/L, 琼脂 7 g/
L, pH 5. 8。种子萌发后取 0. 5 ~ 1 mm 的根尖为外植体, 每个处理接种 30个左右, 3次重复。诱导
培养基为MS 附加不同浓度的 NAA和 BA。所有材料先在 ( 25 ! 1) ∀ 的黑暗条件下培养至出芽, 再移
入光照培养箱内, 光照 16 h/ d, 光照强度 3 000 lx。
2 结果与分析
2. 1 不同激素配比对918韭菜根尖培养不定芽分化的影响
种子萌发 10 d后取 0. 5 ~ 1 cm 根尖接种于附加不同浓度 NAA和 BA的 MS培养基上, 7 d后根尖
切段开始伸长, 10 d左右产生白色颗粒状愈伤组织 (见插页 3图版, 1)。接种 20 d后从愈伤组织上
再生不定芽 (插页 3图版, 2)。30 d 后调查不定芽的分化情况 (表 1) , 结果显示 NAA和 BA对韭菜
组织培养作用显著, 在MS+ NAA 1 mg/ L+ BA 2 mg/ L 培养基上, 不定芽诱导频率最高, 为 80. 6 %,
平均出芽数也最多, 达 46. 5个; MS+ NAA 2 mg/ L+ BA 1 mg/ L 和 MS+ NAA 2 mg/ L+ BA 2 mg/ L 次
之。试验结果还表明易产生愈伤组织的外植体芽分化频率和出芽率均较高。
2. 2 韭菜不同基因型不定芽分化的差异
在MS+ NAA 1 mg/ L+ BA 2 mg/L 培养基上接种不同品种的根尖外植体, 30 d后调查不定芽的分
化情况, 结果列入表 2。
接种 10 d后 911、918、保定红根、寿光马蔺韭和兰州小韭的外植体上有颗粒状愈伤组织产生,
20 d后, 开始分化不定芽。其余品种愈伤组织和芽分化较之晚 3~ 5 d。供试 14份材料均能产生愈伤
组织和分化不定芽, 产生愈伤组织的外植体多能再分化形成不定芽, 芽的分化数目也较多 (插页 3图
版, 3) , 愈伤组织分化频率较低的品种出芽率也较低。由表 1可见, 918愈伤组织和芽的分化频率最
高, 均达到 83. 7 %, 出芽数也最多, 平均为 46. 7个, 保定红根次之, 芽的分化频率为 81. 9% , 91
1、寿光马蔺和兰州小韭愈伤组织和芽的分化频率也较高, 均在 70%以上, 且平均出芽数多。
表 1 不同激素配比对 918韭菜根尖培养不定芽分化的影响
Table 1 Effects of hormones on adventitious shoot differentiation via root tip culture
激素配比
Hormone combination ( mg/L)
NAA BA
愈伤组织诱导率
Callus induct ion rate ( % )
不定芽诱导率
Shoot induct ion rate ( % )
平均出芽数
No. of shoots per explant
1 0 0 0 0
1 1 31. 0! 1. 8 26. 8 ! 1. 2 25. 9 ! 1. 5
1 2 80. 6! 2. 8 80. 6 ! 2. 8 46. 5 ! 3. 1
2 0 0 0 0
2 1 53. 3! 1. 2 48. 2 ! 1. 2 27. 4 ! 1. 2
2 2 46. 9! 1. 3 42. 9 ! 0. 8 34. 1 ! 1. 7
注: 3次重复的平均值 ! 标准差。Note: Average! standard deviat ion of 3 measurements.
表 2 韭菜不同基因型愈伤组织不定芽分化的比较
Table 2 Effects of genotypes on adventitious shoot differentiation
基因型
Genotype
愈伤组织诱导率
Callus induct ion rate ( % )
不定芽诱导率
Shoot induct ion rate ( % )
平均出芽数
No. of shoots per explant
911 78. 7! 5. 0 78. 7 ! 5. 0 40. 1 ! 3. 4
918 83. 7! 3. 7 83. 7 ! 3. 7 46. 7 ! 5. 7
791 60. 8! 5. 8 58. 3 ! 5. 8 13. 2 ! 2. 7
汉中冬韭 Hanzhong Dongjiu 56. 8! 1. 9 50. 8 ! 1. 4 20. 0 ! 3. 2
宽叶韭 Kuanyejiu 65. 4! 4. 1 65. 4 ! 4. 1 43. 3 ! 3. 7
天津大黄苗 Tianjin Dahuangmiao 58. 7! 3. 7 53. 3 ! 5. 8 23. 5 ! 6. 7
天津大青苗 Tianjin Daqingmiao 63. 3! 4. 3 60. 0 ! 5. 8 25. 1 ! 4. 4
寿光马蔺韭 Shouguang Malinjiu 73. 3! 3. 7 76. 7 ! 3. 7 35. 4 ! 3. 7
沈阳马蔺韭 Shenyang Malinjiu 46. 4! 3. 3 39. 3 ! 3. 3 10. 1 ! 1. 7
保定红根 Baoding Honggen 81. 9! 2. 5 81. 9 ! 2. 5 36. 3 ! 3. 3
兰州小韭 Lanzhou Xiaojiu 76. 6! 5. 4 73. 3 ! 6. 4 44. 5 ! 4. 6
甘肃马蔺韭 Gansu Malinjiu 63. 3! 3. 2 56. 3 ! 4. 4 13. 5 ! 4. 5
浙江雪韭 Zhejiang Xuejiu 53. 4! 4. 9 49. 6 ! 3. 7 11. 4 ! 3. 7
北京铁丝苗 Beijing Tiesimiao 58. 9! 2. 2 58. 9 ! 2. 2 11. 6 ! 3. 4
注: 3次重复的平均值 ! 标准差。Note: Average! standard deviat ion of 3 measurements.
2. 3 苗龄对 918韭菜不定芽分化的影响
种子萌发后 7、10、13、16、19 d分别取根尖培养, 30 d 后调查芽的分化情况。由图 1可见, 随
苗龄增加, 芽分化频率和平均出芽数呈下降趋势, 7~ 10日苗龄的根尖外植体最适于脱分化和再分
化, 芽分化频率达 83. 7% ~ 86. 4 %, 平均出芽数达 42. 2 ~ 46. 7个, 是最适宜的取材苗龄。
2. 4 918韭菜不定芽的生根培养
由表 3可见, 在MS+ NAA 0~ 1 mg/L 的培养基上均能生根, 但生根数和根的生长速度却有很大
差异。在MS0培养基上生根数最多, 生长速度最快, 在 MS+ NAA 1 mg/ L 上生根数虽然也较高, 但生
长速度慢; 在MS+ NAA 0. 5 mg/ L 上根少且短。因此, 以MS0为最佳生根培养基。
142 园 艺 学 报 29 卷
图 1 苗龄对 918韭菜不定芽分化的影响
Fig. 1 Effects of seedling age on shoot differentiation
表 3 918韭菜在不同生根培养基上的生根情况
Table 3 Rooting of regenerated shoots on root induction medium
培养基
Medium
NAA
( mg/L)
生根率 Root
diff erentiation
rate ( % )
根数
Root
number
根长
Root length
( cm)
MS 0 100 14. 5! 1. 4 4. 2 ! 1. 1
MS 0. 5 100 3. 8 ! 0. 7 3. 0 ! 1. 0
MS 1. 0 100 12. 8! 1. 7 2. 7 ! 1. 2
注: 3次重复的平均值 ! 标准差。
Note: Average! standard deviat ion of 3 measurements.
2. 5 抗生素对 918韭菜植株再生的影响
由图 2可见, 卡那霉素 ( Km) 对韭菜根尖培养有抑制作用。随 Km浓度升高, 根尖培养愈伤组织
和芽的分化频率以及平均出芽数逐渐降低。Km对芽的分化影响更大, 当 Km为 5 mg/ L 时, 芽的分化
率由对照的 89. 9 %降低到 55. 8 %, 平均出芽数由 48. 2个降低到 23. 6个; 当浓度达到 10 mg/ L 时,
出愈率迅速降低至 33. 5% , 芽的分化和出芽数也大幅度减少; 当 Km 为 15 mg/L 时, 根尖很少分化
愈伤组织, 愈伤组织上几乎没有芽产生; 当 Km#20 mg/L 时, 完全抑制根尖脱分化和再分化。羧苄
青霉素 ( Carb) 和噻孢霉素 ( Cef ) 对韭菜的植株再生也有很大的抑制作用, 表现为随着抗生素浓度的
提高, 愈伤组织和芽的分化频率逐渐降低, Cef的抑制作用更加显著, 当 Carb 为 500 mg/ L 时, 虽然
能够产生少量愈伤组织, 但是愈伤组织不能脱分化形成芽; 当 Cef为 300 mg/ L 时, 完全抑制不定芽
的再生。结果表明在所取浓度范围 ( 100~ 500 mg/ L) 内, T imentin对韭菜根尖培养中愈伤组织的诱导
和芽分化影响不大, 但是出芽数量随Timentin浓度的升高而有所下降。当 Timentin为 500 mg/L 时, 平
均出芽数仍可达到 23. 8个, 为对照的 49. 4 % 。所以可以选择Timentin作为农杆菌的生长抑制剂。
图 2 抗生素对韭菜根尖培养植株再生的影响
Fig. 2 Effects of antibiotics on plant regeneration
2. 6 918韭菜再生植株的驯化移栽
当根长至 3~ 4 mm时可进行再生植株的驯化移栽 (插页3图版, 4)。先在培养室内揭开封口膜驯
化培养2~ 3 d, 再用镊子将植株从三角瓶中取出, 洗去根部附着的培养基, 移栽于盛有消毒蛭石的培
养钵中, 每天浇灌少量 1/ 2MS0营养液, 保湿培养 7 d后, 即可移入土壤中进行正常栽培管理。
1432 期 张 松等: 韭菜组织培养高频植株再生体系的研究
3 讨论
本研究证明韭菜根尖是培养植株再生的优良外植体, 在 MS+ NAA 1 mg/L+ BA 2 mg/ L 培养基上
可一次成芽, 芽分化频率高达 65. 4 %~ 83. 7 %, 出芽数达 40. 1 ~ 46. 7个, 在 2~ 3个月的时间内可
以获得大量的再生植株。Km对韭菜根尖培养植株再生具有很强的抑制作用, Km为 20 mg/L 完全抑制
再分化, 不能诱导产生不定芽。抑菌性抗生素中, Carb和 Cef对植株再生具有抑制作用, 主要表现为
抑制愈伤组织和芽的发生, 特别是出芽数随 Carb和 Cef浓度升高而迅速减少, 当Carb 500 mg/L 或Cef
300 mg/ L 时不能诱导成芽。Timent in对韭菜根尖培养愈伤组织和芽的分化频率的影响较小, 抑制作用
主要表现在出芽数降低上, 当 Timentin为 500 mg/L 时, 出芽数达23. 8个, 为对照的 49. 4%。
Dommise等3 认为与韭菜同属的洋葱是农杆菌的天然寄主, 酚类物质, 如乙酰丁香酮在农杆菌侵
染中的作用被发现后, 利用农杆菌介导法将外源基因导入单子叶植物成为可能4 , Barandiaran等5 则
用粒子轰击法将 uidA 基因导入大蒜中。本研究建立的韭菜高频植株再生体系可作为基因转移的受体
系统, 转基因工作正在进行中。
参考文献:
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Rep. , 1998, 17: 737~ 741
Efficient Plant Regeneration Via Root Tip Culture of Allium tuberosum Rottl.
ex Spreng.
Zhang Song, Da Kedong, Cao Chenxing, Cao Shurong, and Huang Jinli
( College of Horticulture, Shandong Agricultural University , Tai ∃ an 271018, China)
Abstract: An efficient plant regeneration system was established through optimization of hormone combinat ion,
genotype, seedling age and root induction medium in root tip culture of Chinese chive. Data showed that the best
medium for callus and adventitious shoot differentiation was MS medium supplemented with 1 mg/ L NAA and 2 mg/
L BA. Shoot induction rate of 911, 918, Baoding Honggen, Shouguang Malinjiu and Lanzhou Xiaojiu were 78. 7
%, 83. 7 % , 81. 9 %, 76. 7 % and 73. 3 %, while the average shoot number per explant were 40. 1 , 46. 7 ,
36. 3 , 35. 4 and 44. 5 respect ively. Root t ips taken from plantlets 7 to 10 dayold seedlings showed the highest re
generation ability. MS medium without growth regulators was optimum for root formation of regenerated shoots with
100% root induction rate and 14. 5 roots per shoot. Kanamycin inhibited callus and shoot induction definitely at 20
mg/ L. Carbenicillin and Cefotaxime had inhibit ing effects on callus induction and shoot regeneration at Carbenicillin
500 mg/ L and Ceftaxime 300 mg/ L respectively. The effect of Timent in was not obviously, with the inhibition ef
fect only lying in the reduction of shoot number induced from callus.
Key words: Chinese chive ( Allium tuberosum Rottl. ex Spreng. ) ; Root tip; T issue culture; Plant regenera
tion; Antibiotics
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