全 文 ：© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
园 　艺 　学 　报 　2004 , 31 (5) : 593～597
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2003 - 11 - 04 ; 修回日期 : 2004 - 05 - 08
基金项目 : 国家自然科学基金资助项目 (30270921) ; 北京科技合同项目 (954830300) ; 北京市科技新星计划资助项目 (95382200)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail : zhangkaichun @baafs. net . cn)
桃分子连锁图的构建与分析
吴　俊1 ,3 　束怀瑞1 　张开春2 3 　姜立杰2 　周晓航2 　辛翠花2
(1 山东农业大学园艺学院 , 泰安 271018 ; 2 北京市农林科学院林业果树研究所 , 北京 100093 ; 3 南京农业大学园艺学
院 , 南京 210095)
摘 　要 : 以‘大久保’与‘兴津油桃’杂交的 F2代 109 株群体为试材 , 采用 AFL P、RAPD、SSR 分子
标记进行遗传分析。筛选扩增稳定、多态性丰富的 36 对 AFL P 引物、3 对 SSR 引物、2 对 RAPD 引物进行
群体分离分析 , 获得分离标记 136 个 , 卡方检验 27 个标记偏离孟德尔分离比例。应用 Mapmaker 分析软件
将符合孟德尔遗传分离比例的标记构建了包含 11 个连锁群的连锁图谱 , 每个连锁群包含 3～21 个标记 , 平
均为 8173 个标记。该图谱覆盖基因组 106118 cM , 11 个连锁群的平均长度为 9615 cM , 标记间平均图距为
1110 cM , 与果实毛/ 油桃 ( G/ g) 、白/ 黄肉 ( Y/ y) 连锁的 RAPD 标记、非酸/ 酸 (D/ d) 性状连锁的 AFL P
标记分别定位在第 3、7、9 连锁群上。
关键词 : 桃 ; 连锁图谱 ; AFL P ; RAPD ; SSR
中图分类号 : S 66211 　　文献标识码 : A 　　文章编号 : 05132353X (2004) 0520593205
Construction and Analysis of Peach Genetic Map
Wu J un1 ,3 , Shu Huairui1 , Zhang Kaichun 2, J iang Lijie2 , Zhou Xiaohang2 , and Xin Cuihua2
(1 College of Horticulture , S handong A griculture U niversity , Taipian 271018 , China ; 2 Institute of Forest ry and Pomology ,
Beijing Academy of A griculture and Forest ry Sciences , Beijing 100093 , China ; 3 College of Horticulture , N anjing A gri2
culture U niversity , N anjing 210095 , China)
Abstract : A linkage map of peach was constructed with AFL P , SSR and RAPD markers in 109 F2
population derived from the cross of‘Okubo’and‘Xingjin’nectarine. The selected primers including 36
AFL P , 3 SSR and 2 RAPD with rich polymorphism and steady bands were tested in progeny. 136 markers
were scored , of which 27 markers were skewed segregation by X2 test . Mapmaker were used to assigned
the expected segregation markers to 11 linkage groups , the number of loci mapped in the 11 linkage group
was 3 - 21 and there was 8173 (average value) loci per group . Whole length of linkage map was 106118
cM , The average length of 11 groups was 9615 cM , and average interval between markers was 1110 cM.
RAPD markers linked to G/ g , Y/ y and AFL P markers linked to D/ d gene were located in group 3、group
7 and group 9 respectively.
Key words : Peach 〔Prunus persica (L . ) Batsch〕; Linkage map ; AFL P ; RAPD ; SSR
关于桃的遗传连锁图国外已有多篇报道〔1～4〕, 但就目前发表的图谱来看群体数目都比较小 , 许
多标记不能定位在连锁图上。作者利用‘大久保’和‘兴津油桃’杂交的 F2 代 109 株群体 , 构建由
AFL P (扩增片段长度多态性 , Amplified Fragment Length Polymorphism) 、RAPD (随机扩增长度多态
性 , Random Amplified Polymorphic DNA) 、SSR (简单序列重复 , Simple Sequence Repeat) 标记组成的遗传
图谱 , 旨在丰富分子标记资料 , 构建较高密度的分子遗传图 , 为重要性状基因定位奠定基础。
1 　材料与方法
以‘大久保’〔Prunus persica (L . ) Batsch‘ Okubo’〕与‘兴津油桃’〔P. persica (L . ) Batsch
© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
var. nectari na Maxim‘ Xingjin’〕杂交获得 F1代植株京玉 , 京玉自交得到 F2代群体 350 株 , 随机选
取 109 株作为构图群体。取春梢或秋梢幼嫩叶片 , 采用 CTAB 法〔5〕提取基因组 DNA。采用本实验室
建立的桃 AFL P 分析体系〔6〕, 扩增产物用 6 %变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 , 银染法检测。AFL P 扩增引
物由上海生工生物工程有限公司合成 , 核心序列为 Mse Ⅰ: 5piGA TGA GTCCTGA GTAA2NNN3pi;
EcoR Ⅰ: 5piGACTGCGTACCAA TTC2NN3pi或 5piGACTGCGTACCAA TTC2NNN3pi (N 为选择性碱基) 。
RAPD 反应随机引物购自上海生工。扩增反应体系为 15μL , 包括 115μL dN TP (215 mmol·
L - 1) , 115μL 10 ×PCR buffer , 112μL MgCl2 (25 mmol·L - 1) , 115μL 随机引物 (715 ng·μL - 1) ,
20 ng 模板 DNA , ddH2O 补足体积。反应扩增条件为 : 94 ℃40 s , 36 ℃90 s , 72 ℃2 min , 39 个循
环 , 扩增产物用 115 %琼脂糖凝胶检测分析。
根据已发表的桃 SSR 引物序列合成引物 (在上海生工完成) 。扩增反应体系为 20μL , 包括 116
μL dN TP (215 mmol·L - 1) , 210μL 10 ×PCR buffer , 112μL MgCl2 (25 mmol·L - 1) , 正负链引物各
715μL (10 mmol·L - 1) , 20 ng 模板 DNA , ddH2O 1215μL 。94 ℃30 s , 55 ℃60 s , 72 ℃60 s , 35 个
循环 , 扩增产物先用 4 %琼脂糖凝胶检测 , 如检测不到多态性则用 6 %变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。
根据软件 Mapmaker/ Exp 310 的要求 , 将各标记的分析结果转换为符号形式。F2 单株带型按亲本
类型归类 , 用‘A’代表来源于父本 ( P2) 的隐性纯合标记 ,‘C’代表相应的显性纯合标记和杂合标
记 ,‘B’代表来源于母本 ( P1) 的隐性纯合标记 , ‘D’代表相应的显性纯合标记和杂合标记 , ‘H’
代表杂合标记 , 带型不清或数据缺失者记为‘ - ’。调用转换的数据文件。设定 LOD ≥310 , 重组率
≤014 , 使用 group 命令推测可能的连锁群 , 然后利用三点和多点分析构建连锁群 , 采用 compare 和
t ry 命令对连锁群的标记排序 , map 命令作图。作图后 , error detection 命令用以检测误差 , 错误检测
水平设为 1 %。使用函数 Kosambi〔7〕, 将重组率转成遗传距离 (cM) 。
2 　结果与分析
211 　亲本的多态性分析
采用 128 对 AFL P 引物在两亲本间扩增 , 所
有引物均可扩增出清晰可辨的带型 , 扩增条带总
数为 9867 , 平均每对引物产生 77 条扩增条带。
其中 94 对引物在两亲本间表现多态 , 比率为
7314 % , 获得多态性标记 273 个 , 包括与果实非
酸/ 酸性状连锁的 2 个 AFL P 标记〔6〕, 每对引物平
均多态检出率为 2190 条。85 个 RAPD 引物中 10
个引物在亲本中产生多态性 , 其中包括与果实白/
黄肉以及毛/ 油桃连锁的两个 RAPD 标记引物 ;
每个引物一般只有 1 条多态性带 , 多态性引物的
比率为 1118 %。16 对 SSR 引物中有 6 对在亲本
中产生多态性 , 其中 3 对引物在 4 %的琼脂糖凝胶
上检测出差异 , 且表现为共显性。本研究中选用扩
增带型清晰、多态性丰富的 36 对 AFLP 引物、3 对
SSR引物 (琼脂糖电泳检测) 、两个 RAPD 引物用
于遗传图谱的构建。图 1、2、3 分别显示了 AFLP、
SSR、RAPD 标记在后代群体中的分离。
图 1 　AFLP引物 E2AAG/ M2CAC在 F2 群体中的扩增图谱
M. Marker (pUC19 DNA/ Msp I) ; 1～66. 不同个体。
Fig. 1 　DNA band patterns amplif ied by primers combination
E2AAG/ M2CAC in F2 population
M. Marker (pUC19 DNA/ Msp I) ; 1 - 66 different individuals.
495 园 　　艺 　　学 　　报 31 卷
© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
　　选用的 36 对 AFLP 引物多态性选择性碱基组合如下 : M2CAC/ E2AAG (或 E2ACA、E2ACT、E2TG) ,
M2CAG/ E2ACA (或 E2ACG、E2AGG、E2AG、E2TA) , M2CTA/ E2ACA (或 E2ACC、E2AC、E2AA、E2AT) ,
M2CTG/ E2ACC (或 E2TA 、E2TT、E2AC) , M2CTC/ E2ACC (或 E2ACG、E2AGG、E2AC、E2AT、E2TA) ,
M2CA T/ E2ACC (或 E2AC、E2TT、E2TG、E2ACT、E2A GC) , M2CAA/ E2ACT (或 E2TA) , M2CTT/
E2ACT (或 E2AC、E2A T、E2TG) ; 与果实非酸/ 酸性状连锁的两个 AFL P 标记引物组合为 E2TA/ M2
CTC和 E2A T/ M2CTA。3 对 SSR 引物序列为 UDP962008 , 正链 5piTTGTACACACCTCA GCCTG3pi,
负链 5piTGCTGA GGTTCA GGTGA GTG3pi; UDP962018 , 正链 5piTTCTAA TCTGGGCTA TGGCG3pi, 负
链 5piGAA GT2TCACA TTTACGACA GGG 3pi; UDP962005 , 正链 5piGTAACGCTCGCTACCACAAA3pi,
负链 5piCCTGCA TA2TCACCACCCA G3pi。白/ 黄肉 RAPD 标记引物 OPU203 序列为 CTACGCCGAC , 毛
/ 油桃 RAPD 标记引物 OPP220 序列为 GACCCTA GTC。
212 　群体中分子标记的分离
36 对 AFL P 引物共获得标记 131 个 , AFL P 标记为显性标记 , 在 F2 代群体中应表现 3∶1 的遗传比
例 , 卡方检验结果有 26 个标记位点分离比率不符合孟德尔遗传分离比例 , 占标记总数的 1918 %。统
计 131 个 AFL P 标记的表现型分布 , 来自兴津油桃的位点占标记总数的 4311 % , 来自大久保的位点
占标记总数的 5619 % , 符合 1∶1 的分离比。表明两亲本在该杂交组合后代中占同等重要的比重 , 也说
明该杂交组合中后代基因的均衡性。果实的毛/ 油桃和白/ 黄肉 RAPD 标记为显性标记 , 统计结果表
明符合 3∶1 的分离比率。两个 SSR 标记为共显性 , 在 F2代群体中符合 1∶2∶1 的遗传规律。因此 , 在获得
的 136 个标记中 , 109 个符合遗传分离比率 , 有效位点率为 8011 %。
213 　遗传连锁图的构建
将符合遗传规律的 105 个 AFL P 标记、两个 RAPD 标记和两个 SSR 标记 , 使用 Mapmaker/ Exp
310 , 执行作图命令 , 推测可能的连锁群。109 个有效位点中 96 个标记构成 11 个连锁群 (如图 4) ,
有 13 个标记未能在连锁群上定位 , 作图位点率为 8811 %。在 11 个连锁群中 , 标记最多的连锁群含
有 21 个标记 , 标记数最少的连锁群只有 3 个标记 , 平均每个连锁群标记数为 8173 个 ; 最长的连锁群
长度为 19814 cM , 最短的连锁群长度为 2917 cM。平均间距最大的为第 8 连锁群 , 间距达 1814 cM ;
平均间距最小的为第 2 连锁群 , 间距只有 518 cM。96 个连锁标记覆盖基因组总长为 106118 cM , 大
约覆盖了基因组范围的 8815 %。连锁群的平均长度为 9615 cM , 标记间平均图距为 1110 cM。与果实
非酸/ 酸性状连锁的两个 AFL P 标记定位在第 9 连锁群上 ; 与果实毛/ 油桃性状连锁的 RAPD 标记定位
在第 3 连锁群上 , 而白/ 黄肉 RAPD 标记定位在第 7 连锁群上。
595　5 期 吴 　俊等 : 桃分子连锁图的构建与分析 　
© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
图 4 　桃分子遗传图谱
Fig. 4 　Molecular genetic map of peach
3 　讨论
本试验群体是从 350 株杂交后代中随机选择的 109 株个体 , 多态性分析表明 , 来自两亲本的位点
符合 1∶1 比例 , 总体上未出现严重的偏分离。从验证的多态性片段结果来看大多数符合孟德尔遗传规
律 , 表明群体的大小符合构建连锁图的要求。
本试验中 RAPD 标记在两亲本间表现出低水平的多态性 , 这与 Chaparro〔8〕等对桃的多态性研究
结果一致 , 与桃同工酶的低水平多态性也相符合。与 RAPD 标记相比 , AFL P 标记在亲本及后代群体
中则表现较高水平的多态性 , 但两种标记的多态性检出率均低于　果、苹果、杏等树种 , 这种低水平
的多态性主要是因为桃栽培品种中高度的近交所引起的。
在已发表的桃遗传连锁图上 , Dirlewanger 等〔1〕将控制果实毛/ 油桃 ( G/ g) 、非酸/ 酸 (D/ d) 性
695 园 　　艺 　　学 　　报 31 卷
© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
状基因定位在第 5 连锁群上 , 而本图谱中将与 G位点连锁的 RAPD 标记、D 位点连锁的 AFL P 标记
分别定位在第 3、9 连锁群上 , 推测这两个连锁群共同对应于 Dirlewanger 等构建的第 5 连锁群。War2
burton 等〔2〕曾将黄/ 白肉 ( Y/ y) 基因位点定位在其构建的第 3 连锁群上 , 本研究中将该位点的 RAPD
标记定位在第 7 连锁群上 , 这两个连锁群检测的可能是同一基因组区域。本研究中建立的连锁框架图
覆盖基因组 106118 cM , 与国外发表的桃连锁图相比 , 长度仅次于 Lu 等〔3〕发表的一张全长 1297 cM
的 AFL P 连锁图 , 这进一步体现了 AFL P 标记具有扩大图谱基因组覆盖范围的优越性。但是 AFL P 标
记一般为显性标记 , 不利于来自不同群体的图谱间交换 , 所以图谱的整合还依赖于共显性标记。
标记的偏分离在作图过程中是普遍存在的〔9 ,10〕。Foolad〔4〕等报道的利用桃 ×扁桃的杂交后代构图
时偏分离比例达到 37 %。本试验得到的 136 个标记中有 27 个在后代中的分离不符合孟德尔遗传 , 占
标记总数的 1919 % , 偏分离比例属于正常范围 , 并且低于种间杂交群体的偏分离比例。目前对于偏
分离的遗传机制尚不清楚 , 有研究者认为 , 与影响偏分离的遗传因子紧密连锁的分子标记则表现有严
重的偏分离〔11〕。另外 , 各种原因造成的带型缺失或模糊不清的数据、作图群体数量较小、染色体的
转位、某一位点的扩增片段代表几个基因位点、酶切不彻底、DNA 本身存在大量的断裂片段等也会
引起标记的偏分离。本研究中分子标记的偏分离是否是由上述原因引起 , 尚需进一步研究。
桃完整的基因组应包括 8 个连锁群 , 本研究得到了 11 个连锁群 , 这表明至少有 3 条染色体中存
在频繁交换或标记空缺区段。与已构建的桃遗传连锁图比较 , 本试验获得的连锁群跨度较大 , 多处存
在着较大空隙 ( > 25 cM) , 部分连锁群出现了标记密集区如第 1、3、10 连锁群。本研究建立的图谱
主要来自 EcoR Ⅰ- Mse Ⅰ酶切产生的 AFL P 标记 , 这种标记检测的位点多聚集在着丝粒两侧甲基化
较高的重复序列区域。利用其它内切酶产生的标记可以对其进行完善补充 , 例如 Pst Ⅰ- Mse Ⅰ内切
酶组合。与 EcoR Ⅰ相比 , Pst Ⅰ可以在非甲基化的常染色质区识别酶切位点 , 产生的 AFL P 标记表现
出较高的随机分布比例 , 但是多态性检出率有所降低 , 因此使用不同酶切的互补作用 , 有利于构建覆
盖全基因组的饱和连锁图。另外 , 分子标记分布的不均匀也可能是因为所用亲本之间在某些染色体区
段缺乏多态性 , 某些染色体结构发生大的变异 , 导致这一段染色体上分子标记不能用连锁规律定位。
因此 , 发展来源于不同杂交组合的作图群体 , 以及发展新型分子标记是填补图谱中的空缺、构建饱和
图谱的有效手段 , 这也是本研究进一步努力的方向。
参考文献 :
1 　Dirlewanger E , Pronier V , Parvery C , et al. Genetic linkage map of peach 〔Prunus persica (L . ) Batsch〕using morphological and
molecular markers. Theor. Appl. Genet . , 1998 , 97 : 888～895
2 　Warburton L M , Becerra2Velasquez V L , Goffreda J C , et al. Utility of RAPD markers in identifying genetic linkage to genes of economic
interest in peach. Theor. Appl. Genet . , 1996 , 93 : 920～925
3 　Lu Z X , Sosinski B , Reighard G L , et al. Construction of a genetic linkage map and identification of AFL P markers for resistance to root2
knot nematodes in peach rootstocks. Genome , 1998 , 41 : 199～207
4 　Foolad M , Arulsekar S , Becerra V , et al. A genetic map of Prunus based on an interspecific cross between peach and almond. Theor. Ap2
pl. Genet . , 1995 , 91 : 262～269
5 　Murry M G , Thompsom W F. Rapid isolation of high weight DNA. Nucl. Acids Res. , 1980 , 8 (19) : 4331～4235
6 　吴　俊 , 束怀瑞 , 张开春 , 等. 桃果实非酸/ 酸性状 AFL P 标记的筛选. 果树学报 , 2004 , 21 (4) : 298～301
7 　Kosambi D D. The estimation of map distance from recombination values. Ann. Eugen. , 1944 , 12 : 172～175
8 　Chaparro J X , Werner D J , O’Malley D , et al. Targeted mapping and linkage analysis of morphological isozyme , and RAPD markers in
peach. Theor. Appl. Genet . , 1994 , 87 : 805～815
9 　Gebhardt C , Ritter E. RFL P analysis and linkage mapping in Solam um t uberosum . Theor. Appl. Genet . , 1989 , 78 : 65～75
10 　Voorrips R E. Mapping of two genes for resistance to clubroot ( Plasmodiophora brassicas) in a population of doubled haplid lines of B rassi2
ca oleracea by means of RFL P and AFL P markers. Theor. Appl. Genet . , 1997 , 94 : 75～82
11 　Xu S J , Singh R J , Hymowitz T , et al. Establishment of a cytogenetic map soybean : progress and prospective. Soybean Genet . Newslet ,
1997 , 24 : 121～122
795　5 期 吴 　俊等 : 桃分子连锁图的构建与分析