全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2003 , 30 (5) : 530～534
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2002 - 12 - 13 ; 修回日期 : 2003 - 02 - 24
基金项目 : 国家自然科学基金资助项目 (39970516、30170646)3 通讯作者
低温对甘蓝逆境生理指标和蛋白质磷酸化的影响
吴能表1 ,2 　吴峻岩1 　朱利泉1 　王小佳1 3
(1 西南农业大学园艺系 , 重庆 400716 ; 2 西南师范大学生命科学学院 , 重庆 400715)
摘 　要 : 研究表明 , 低温 (5 ℃) 逆境处理 0～30 min 甘蓝体内的 MDA、脯氨酸、可溶性糖、ABA 含量
和 PK活性等指标在较短的时间内都有明显上升 , 然后下降。ABA 含量和 PK活性的峰值早于其他指标 , 同
时低温逆境引起的 PK活性对 Ca2 + 的存在有明显的依赖性 , Mn2 + 、Mg2 + 对其活性也有明显影响 , 且这两种
离子的影响机制可能不同。低温逆境信号引起 2219 kD 的蛋白质磷酸化。
关键词 : 甘蓝 ; 温度胁迫 ; 蛋白激酶活性 ; Ca2 +
中图分类号 : S 635 　　文献标识码 : A 　　文章编号 : 05132353X (2003) 0520530205
蛋白质磷酸化在对外界刺激信号传递和应答过程中起着重要的作用〔1〕, 几乎所有的生理和病理过
程都与蛋白质的磷酸化和去磷酸化有关〔2〕, 因而植物体内蛋白质磷酸化和去磷酸化正在成为植物信号
传导的研究热点。近年来 , 有关细胞受到外界刺激后胞内钙浓度的变化〔3〕和与钙有关的蛋白激酶
(Protein Kinase , PK) 的研究已有大量报道〔4 ,5〕。但关于植物对温度胁迫信号的接受、传导及其与逆境
指标的关系方面的报道还很少。作者以甘蓝 ( Brassica oleracea L. ) 为材料进行这方面的研究 , 为揭示
植物信号传导途径提供新的证据。
1 　材料与方法
111 　材料
采用甘蓝品种‘渝丰三号’ (重庆市渝丰科技服务部生产) 作为试验材料。2002 年 6 月 15 日将其播
种于西南师范大学植物生理学试验苗圃 , 7 月 15 日移栽于装满蛭石的盆钵中 , 浇灌 Hoagland 完全营养
液。9 月 5 日将其转入在光照培养箱 , 25 ℃, 光量子通量密度 13161μmol·m - 2·s - 1 , 光照时间 12 h/ d 进
行预培养 , 9 月 15 日将其温度迅速降为 5 ℃进行低温处理 , 取其第 5 叶位叶片进行下述测定。
112 　测定方法
丙二醛 (MDA) 含量采用硫代巴比妥酸 (TBA) 比色法〔6〕测定 ; 脯氨酸 (Pro) 含量采用磺基水杨
酸法〔7〕测定 ; 可溶性糖含量采用蒽酮硫酸水合热法〔8〕测定 ; ABA 含量按南京农业大学随药附试剂盒
说明书用 DG3022A 型酶联免疫检测仪测定。
可溶性蛋白质的提取参照郑朝军等〔5〕的方法略有修改 : 取叶片 012 g , 加入液氮迅速研磨 , 用预
冷细胞匀浆液 (终浓度为 Tris 20 mmol·L - 1 , EDTA 215 mmol·L - 1 , PMSF 5 mmol·L - 1 , pH 712) 冰浴充
分研磨 , 4 ℃15000 ×g 离心 15 min , 取上清液 , 40000 ×g 离心 30 min , 上清液即为酶液。蛋白质含量
测定采用 Bradford 法〔9〕。
PK活性的测定参照张来群等〔4〕的方法略有改动 : 取粗酶液 20μL 与反应缓冲液混合 , 使终浓度为
Histon Ⅲ1 mg·mL - 1 , Hepes 50 mmol·L - 1 (pH 712) 和表 1 所列 9 种组合之一的成分 (其中低温对 PK活
性的动态影响是按“②”的离子浓度测定的) , 最后加入 5μL 终浓度 215μmol·L - 1的ATP 〔内含 1815 kBq
(γ232P) ATP , (γ232P) ATP 的放比放射性 > 185 TBq·mmol - 1 , 放射纯度 95 % , 北京福瑞生物工程公司生
产〕启动反应 , 30 ℃水浴 10 min , 冰浴终止反应。吸取 20μL 加在用 20 %的 TCA 和 1 %的NaPPi 预处理的
P81 滤纸上 , 用 75 mmol·L - 1磷酸溶液冲洗 3 h , 中间换液 5 次 , 将未反应的 (γ232P) ATP 充分洗掉 , 然
后用乙醇∶乙醚 (1∶1) 10 mL 冲洗 2 次 , 每次 5 min , 60 ℃烘干 , 将充分干燥的 P81 滤纸片放入液闪瓶中 ,
加入闪烁液 (PPO 4 g , POPOP 015 g , 溶于 1 L 甲苯) 5 mL , 使滤纸片浸没在闪烁液底部中央 , 用
FJ22101G双道液体闪烁计数器 (国产) 进行计数测量。磷酸化活性以 cpm·μg - 1蛋白表示。
可溶性蛋白的体外磷酸化反应参照郑朝军等〔5〕的方法修改 : 在反应体系中加入 100μL 酶提取液 ,
1μL 1 mol·L - 1的MgCl2 和 1μL 011 mol·L - 1的 CaCl2 于 30 ℃保温 1～2 min 后加入 5μL 终浓度 215μmol·
L - 1 (γ232P) ATP 启动反应 , 10 min 后加入 10μL 甘油 , 25μL 10 %的 SDS 终止反应 , 并沸水浴 5 min ,
冷却后上样电泳。
SDS2PAGE电泳参照郭尧君〔10〕的方法 , 用 12 %的分离胶 , 恒流 40 mA 电泳。
2 　结果与分析
211 　低温处理对甘蓝主要逆境指标的动态影响
低温处理 3 min 后 , 甘蓝叶片内 MDA 含量基本没有变化 , 在处理 5 min 时出现第一个峰值 , 达到
对照的 104110 % , 10 min 出现低谷 , 仅为对照的 86127 % , 随后再次上升 , 处理 20 min 时接近对照值 ,
为对照的 98107 % , 30 min 时超过第一峰值 , 为对照的 113193 % (图 1) 。
低温处理对脯氨酸含量影响很大。低温处理 3 min 时脯氨酸含量达到对照的 316 倍 , 处理 5 min
达到对照的 23 倍之多 , 10 min 时又有较大幅度下降 , 但仍达到对照的 14179 倍 , 处理 15 和 20 min 时
分别只有对照的 89174 %和 84162 % , 处理 30 min 时又有一定上升。
处理 3 min 和 5 min 后 , 可溶性糖含量增加 , 5 min 时达到第一个峰值 , 为对照的 125100 % , 10
min 时迅速下降 , 为对照的 92168 % ; 而 20 和 30 min 逐渐上升 , 分别达到对照的 103173 %和
134152 %。
ABA 含量变化规律与前面的指标基本一致。它的第一个峰值 3 min 出现 , 为对照的 148143 % , 且
早于上述各指标峰值出现时间 , 随后略有下降 , 5 min 时为对照的 132168 % , 10 min 时又上升 , 呈第
二个峰 , 为对照的 177195 % , 此后变幅较小 , 30 min 时几乎与对照一致。
212 　低温处理对 PK活性的影响
从图 2 可以看出 , 低温处理 3 min 时甘蓝提取液的 PK活性达到第一个峰值 , 比对照高出 1 倍 , 5
min 时又有较大幅度的下降 , 但仍高于对照 , 随后又上升 , 15 min 时达到第二峰值 , 但第二峰值明显
低于第一峰值 , 20 min 时又下降 , 30 min 又有较大上升。
图 1 　低温条件下甘蓝部分生理指标的动态变化
Fig. 1 　The dynamic changes in physiological index
of Brassica oleracea L. at low temperature
图 2 　低温条件下甘蓝 PK活性的动态变化
Fig. 2 　The dynamic changes of PK activity of
Brassica oleracea L. at low temperature
213 　Ca2 + 、Ca2 +抑制剂及 Mn2 + 、Mg2 + 对 PK活性的影响
上述结果表明 , 低温处理 3 min 时 PK活性较高 , 为探讨不同二价金属离子对激酶活性的影响 ,
1355 期 　　　　　　　　　　吴能表等 : 低温对甘蓝逆境生理指标和蛋白质磷酸化的影响 　　　　　　　　　　　
取处理 3 min 的甘蓝叶片的蛋白酶提取液 , 进行
体外磷酸化反应 , 在其中分别加入 CAM、Mn2 + 、
Mg2 + 、不同浓度 Ca2 + 及钙离子螯合剂 ———EGTA
进行处理 , 以 1 mmol·L - 1 CaCl2 + 10 mmol·L - 1
MgCl2的活性为 100 % , 其他测定值与之比较 , 得
到相对活性值。结果表明 , 多个处理相互之间存
在极显著差异 (表 1) 。
21311 　Ca2 + 钙离子对 PK活性的影响
在反应体系不变 (表 1 中 ②) 的情况下 , 外
加钙离子螯合剂 EGTA 对低温下 PK活性有极显著
的影响 , 其活性只有对照的 29175 % (表 1 中 ⑨) 。
为了解这种活性下降是否由 EGTA 的直接作用引
起 , 作者设计了不加 Ca2 + 的验证 (即表 1 中 ⑧) ,
PK活性也大大降低 , 仅为对照的 57138 %。但此
活性仍高于加入 EGTA 者 , 可能是酶液中本身含
有一定浓度的 Ca2 + 。当对照体系中加入 6μmol·
L - 1的 CAM 后其磷酸化活性几乎没有变化 , 其活
性是对照的 97165 % , 说明 CAM 不能激活 PK的活
性。
反应体系中外加不同浓度的 Ca2 + , 结果发
现 , 1 mmol·L - 1为最佳浓度 , 不加钙或当 Ca2 + 浓
度超过 1 mmol·L - 1 , PK活性降低。说明该激酶对
钙离子浓度非常敏感。
21312 　Mn2 + 、Mg2 + 对 PK活性的影响
当在对照体系中加入 10 mmol·L - 1 MnCl2 时 ,
PK活性比对照高出 7180 % , 而除去 Mg2 + , 代以
10 mmol·L - 1 MnCl2 (表 1 中 ⑥) 时 , 其活性为对
照的 81126 % , 说明 Mn2 + 和 Mg2 + 对于增强 PK活
性皆是必需的。
214 　磷酸化蛋白的分离
SDS2PAGE结果如图 3 所示 , 低温处理 5 min
和 10 min 都清晰地出现了分子量为 2219 kD 左右
表 1 　不同离子对低温引起的甘蓝 PK活性的影响
Table 1 　Effects of ions on the activity of protein
kinase in Brassica oleracea L. at low temperature
外加离子及浓度
Ion and concentration (mmol·L - 1)
平均活性
Average activity
(cpm·μg - 1)
①1 CaCl2 + 10 MgCl2 + 10 MnCl2 5010(107180 %) A
②1 CaCl2 + 10 MgCl2 4648(100 %) B
③1 CaCl2 + 10 MgCl2 + 01006 CAM 4539(97165 %) C
④2 CaCl2 + 10 MgCl2 4259(91163 %) D
⑤5 CaCl2 + 10 MgCl2 3948(84194 %) E
⑥1 CaCl2 + 10 MnCl2 3777(81126 %) F
⑦10 CaCl2 + 10 MgCl2 2885(62107 %) G
⑧10 MgCl2 2667(57138 %) H
⑨1 CaCl2 + 10 MgCl2 + 2 EGTA 1383(29175 %) I
　　注 : A , B , C , D , E , F , G, H , I 为 1 %显著差异。
Note : A , B , C , D , E , F , G, H , I represent significant dif2
ference at 1 % level .
图 3 　低温胁迫甘蓝磷酸化蛋白 SDS2PAGE
的放射自显影图谱
1. 5 min ; 2. 10 min ; 3. 15 min ; 4. 15 min , 未加 CaCl2 ;
5. 20 min ; 6. 30 min ; 7. 对照 Control。
Fig. 3 　Autoradiogram of SDS2PAGE of phospholycated protein
in Brassica oleracea L. at low temperature stress
的放射条带 , 处理 15、20 和 30 min 也在相同的位置出现了一定亮度的放射条带 , 而未加 CaCl2 的处理
(泳道 4) 和对照 (泳道 7) 几乎看不见任何条带 , 说明 2219 kD 的蛋白质条带是低温磷酸化引起的特
征条带 , 其磷酸化过程对 Ca2 +存在明显的依赖性。从不同处理时间看来 , 随着低温处理时间的延长
磷蛋白的含量降低 , 这可能是由于体内磷酸酶活性增加 , 磷蛋白水解加剧所致。
3 　讨论
甘蓝体内 ABA、脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白含量和 PK活性变化是在较短的时间内完成 , 体
内快速的生理变化 , 有利于对环境的适应 , 避免生理反应过分滞后造成的伤害。蛋白质磷酸化的发生
与其对逆境的适应而进行自体调节有关 , 这些生理效应的表现都源于蛋白激酶的激活 , 而蛋白激酶的
激活又依赖于 Ca2 + 的存在〔11〕。大量研究证明胞内 Ca2 + 起着传递和放大信号的作用〔12〕, 在植物细胞中
235　　 　　　　　　　　　　　　　　　园 　　艺 　　学 　　报 　　　　　　　　　 　　　　　　　　　30 卷
存在有依赖 Ca2 + 的 PK, 它的活性是催化蛋白质发生磷酸化 , 缺乏 Ca2 +或 Ca2 + 不足时就会影响酶的活
性 , 从而降低磷酸化蛋白的量 , 植物的信号传导受阻。
可溶性糖、可溶性蛋白质和游离脯氨酸是植物细胞内重要的渗透调节物质 , 它们能够增加胞内溶
质浓度 , 降低细胞的冰点 , 防止细胞过度脱水 , 从而减少低温对细胞的伤害〔13〕。胁迫下植物体内可
溶性糖含量和游离脯氨酸含量与植物抗寒性之间存在相关性〔14〕。本研究结果也证明了植物对低温的
适应机制是通过提高胞内小分子物质浓度来实现的。MDA 是植物细胞膜脂过氧化产物之一 , 能强烈
地与细胞内的各种物质发生反应 , 因而引起对酶和膜的严重损伤〔15〕, 在正常生长的植株体内含量较
低 , 当植株处于不良环境时 , 会因不良环境的恶劣程度引起 MDA 含量的相应上升。本研究中 MDA 含
量增加的幅度并不大 , 可能与低温条件下体内糖分增加和氨基酸含量上升干扰了 MDA 的测定有
关〔16〕。植物在温度胁迫下内源激素 ABA 水平发生变化〔17〕, ABA 作为一种应急激素 , 可通过保护膜结
构 , 维护膜功能〔18〕, 和启动抗寒基因〔19〕而提高植物抗低温的能力。有研究表明 , 植物在经低温诱导
增强抗寒性的同时体内 ABA 水平明显增加 , 而不能合成 ABA 的变种拟南芥低温处理不能产生抗寒
性〔20〕。从本文研究来看 , 植物通过低温处理后 ABA 含量迅速升高 , 从而引发一系列的体内反应 , 提
高甘蓝的低温适应能力 , 而蛋白质磷酸化过程可能参与了 ABA 的生物合成〔21〕。
Ca2 + 、Mn2 + 、Mg2 + 、EGTA 都对 PK活性有极显著影响。不同钙水平下 PK活性差异极大 , 该激
酶能被 Ca2 + 激活 , 以 1 mmol·L - 1 CaCl2 为最佳效果。Mn2 + 、Mg2 + 分别都能提高激酶活性 , 但它们的
激活效果有差异 , 在体系内同时加入这两种离子的效果大于单独作用的效果 , 但小于两者分别之和 ,
说明这两种离子的作用机制是不同的 , 它们之间不能相互取代 , 这与李翠凤等〔22〕的研究结果一致。
Mn2 + 、Mg2 + 的作用很可能是作为 PK的活化剂而调节酶的活性 , 这有待进一步研究。EGTA 作为钙离
子螯合剂能够通过降低反应体系的 Ca2 + 浓度 , 从而降低 PK的活性。CAM 对此 PK活性影响并不明
显。综上所述 , 说明此激酶是一种对 Ca2 + 具有明显的依赖性 , 但对 CAM 并不依赖的激酶 , 有可能是
一种 CDPK (calcium2dependent protein kinase) 。
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Effects of Low Temperature Stress on Physiological Index and Protein Phospho2
rylation in Brassica oleracea L.
Wu Nengbiao1 ,2 , Wu Junyan1 , Zhu Liquan1 , and Wang Xiaojia1
(1 Horticulture Department , South2West Agriculture University , Chongqing 400716 , China ; 2 School of Life Science , South2West
Normal University , Chongqing 400715 , China)
Abstract : The contents of MDA , proline , soluble sugar , ABA , and the activity of PK in Brassica oleracea
L. rose remarkably in a short time at 5 ℃, then went down. And the peak of ABA content and the PK activity
were prior to other indexes. Low temperature , first of all , caused the activity of PK and the content of endogenesis
ABA increase through some signal matter. Then , activated or prohibited some genes expressing , and at last it
caused the content of other matter rising remarkably. The activity of PK had an apparently reliance on Ca2 + ,
Mn2 + and Mg2 + had obvious effect on the PK activity , too. The mechanism of the two ions to PK might be differ2
ent . A kind of phosphoprotein (2219 kD) caused by low temperature stress was separated.
Key words : Brassica oleracea L. ; Temperature stress ; The activity of PK; Ca2 +
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