全 文 ：第 17 卷
第 3 期

Vol. 17
No . 3
草
地
学
报
ACTA AGRESTIA SINICA



2009 年
5 月

May

2009
陇东野生紫花苜蓿的遗传特异性分析
张雪婷 , 师尚礼*
(甘肃农业大学草业学院,草业生态系统教育部重点实验室, 中
美草地畜牧业可持续发展研究中心, 甘肃 兰州
730070 )
摘要: 为初步判定陇东野生紫花苜蓿( Native Medicago sativa L. cv . Longdong )的遗传特异性, 及与其他苜蓿材料的
亲缘关系, 借助垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳技术, 对包括该材料在内的 41个紫花苜蓿材料进行 POD同工酶酶谱特征
分析。结果表明:供试材料共出现 22 条酶带, 最多9 条, 最少5 条; 陇东野生紫花苜蓿出现 6条酶带, 其特征谱带为 Rf
0. 26; 将 0, 1 二态性矩阵转化为遗传距离矩阵进行聚类, 陇东野生紫花苜蓿单独聚为一类。聚类分析的结果表明, 陇
东野生紫花苜蓿与其他 40 个材料存在较大的遗传差异, 为其在形态学上与其他苜蓿的差异提供了有利支持。
关键词: 陇东野生紫花苜蓿; POD 同工酶;酶谱分析; 特异性;聚类分析
中图分类号: S812




文献标识码: A




文章编号: 1007
0435( 2009) 03
0343
06
Genetic specificity in Native Medicago sativa L. cv. Longdong
ZHANG Xue
t ing , SH I Shang
li*
( Pratacul tu ral College, Gan su Agricul tu ral Un iversity; Key Lab oratory of Gras sland E cosystem of M inist ry of Educat ion;
Sino
U. S. Centers for Graz ingland E cosystem Sustainab ilit y; Lanzh ou , Gan su Provin ce 730070, C hina)
Abstract: For analyzing the genet ic specificity o f Longdong nat ive alfalfa ( Med icago sat iv a L. cv. Long

dong) and est imat ing the genetic relat ionship betw een it and other alfalfa cult iv ars, the POD iso zyme o f 41
alfalfa cultivars including Longdong nat iv e cultivar w ere analyzed using the poly lamide gel elet rophoresis
technique. The r esults show that 22 enzyme bands in total appeared f rom the experimental materials w ith
the largest number of enzymes at 9 and the least at 5. Nat iv e Longdong alfalfa had 6 enzyme bands and the
one on Rf 0. 26 as the specif ic enzyme band. Cluster analy sis by t ransformat ion of the 0
1 matrix to g enetic
distance matrix show that Longdong nat ive alfalfa w as classified into a separ ated category . In conclusion,
there is a big genet ic difference betw een Longdong native alfalfa and the o ther 40 alfalfa cult iv ar s, w hich
pro viding a pow erful suppor t to the mo rpholo gical part icularity o f Longdong nat ive alfalfa.
Key words: Longdong native alfalfa (Medicago sativa L. cv. Longdong) ; Perox idase ( POD) isozyme; Zy

mogr am analy sis; Specificity; Cluster analy sis


陇东野生紫花苜蓿 ( Nat iv e Medicago sativa
L. cv. Longdong )分布于甘肃清水、定西, 耐旱耐
寒,水平或斜生侧根, 水平根具有茎、茎节及退化的
鳞片叶,可产生芽和根,发育为新枝、新根,水平根解
剖结构为茎结构,是茎的变态器官,入土深度一般达
70~ 100 cm, 根系强大, 无主根, 扩展性强。茎细硬
且平卧或斜生, 株高低矮,分枝能力强[ 1]。依据美国
H. T. 哈特曼 D. E.凯斯特所著的
植物繁殖原理和
技术
[ 2]及内蒙古农业大学王立群等人对根部划分
的原则[ 3] ,陇东野生紫花苜蓿根系依据其形态特征和
解剖结构特征,属根茎型。
过氧化物酶( POD)是一种以过氧化氢( H 2O 2 )
作为电子受体催化底物的氧化酶。该酶普遍存在于
生物体的不同器官、组织, 以及发育的不同时期[ 4] ,
并参与呼吸作用、光合作用及生长素氧化等生理活
动,且酶活性较高[ 5] 。过氧化物同工酶是基因表达
的产物,该酶的基因编码、调控与基因活动的差异,
反应了基因型和表现型的相互关系[ 6]。同工酶分析
收稿日期: 2008
09
10;修回日期: 2009
03
02
基金项目:
十一五
国家科技支撑计划 ( 2006BAD01A19) ( 2006BAD04A04
03 ) ( 2007BAD52B06 )、农业部公益性行业 (农业 )科研专项
( nyh yzx07
022)资助
作者简介:张雪婷( 1984
) ,女,甘肃兰州人,硕士研究生,研究方向为牧草种质资源, E
mail: 852540883@ qq. com ; * 通讯作者 Author for
cor resp on dence, E
m ail: sh ishl@ gsau. edu. cn
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报 第 17卷
技术主要通过凝胶电泳分离出来的各条谱带, 经过
染色形成酶谱, 酶谱中不同迁移率的同工酶谱带被
看作是由不同基因控制的酶蛋白分子, 从而揭示同
工酶基因与性状表达的关系[ 7]。该技术将宏观的遗
传现象联系微观的分子水平, 并作为一种便捷的分
子标记手段,在植物的性状、遗传、亲缘关系、种子纯
度检测、杂种优势等研究中得到广泛应用[ 8, 9]。
本文采用垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳技术, 对
陇东野生紫花苜蓿以及其它 40 个苜蓿材料进行
POD酶谱检测。通过不同迁移率的谱带特征比较,
分析陇东野生紫花苜蓿的遗传特异性。
1
材料与方法
1. 1
供试材料
陇东野生紫花苜蓿属根茎型, 与绝大多数轴根
型、根孽型苜蓿不同。


本试验共 41个苜蓿材料,包括陇东野生紫花苜
蓿在内 14个国内材料, 27个国外材料(表 1)。
1. 2
试验方法
1. 2. 1
酶液提取
取真叶期苜蓿根1 g,加入 4 mL
0. 1 mol/ L T ris
HCl电极缓冲液于冰浴研磨。研后
迅速倒入离心管, 8000 r/ min离心 10 min后取上清
液,加入等体积 40%的蔗糖溶液混匀,放入- 80

冰箱以备点样。
1. 2. 2
凝胶制备
采用 7%的 1 mo l/ L Tr is
HCl
( pH 8. 8) 分离胶, 4% 的 1mol/ L Tris
HCl ( pH
6. 8)浓缩胶。
1. 2. 3
点样和电泳
用移液枪吸取15
L 酶液, 并
加入小微滴 2%的溴酚蓝, 混匀后加入点样槽。选
用北京六一公司生产的 DYY
12B 型稳压电泳仪。
当前沿指示剂在浓缩胶中移动时, 电压为 120V, 前
沿指示剂进入分离胶后, 电压升为 200V。
1. 2. 4
染色
剥离的胶片采用改良联苯胺法染
色[ 10, 12] , 浸泡 8~ 10 m in 显带, 置于自来水漂洗1 d,
照相。
1. 3
数据处理
首先,计算各谱带的迁移率( Rf) , Rf= I/ L, I 为
分离胶始端到前沿指示剂的距离, L 为各酶谱带到
分离胶始端的距离[ 11, 12] ; 其次, 酶带颜色的深浅反
应了酶活性的强弱, 将全部酶带的酶活性分为 4 个
级别:酶带不出现为 0 级; 酶带出现且颜色较浅, 酶
活性较弱, 为 1级; 颜色较深, 酶活性较强,为 2级;
颜色深, 酶活性强, 为 3级 [ 12~ 15]。根据以上分级绘
制酶谱迁移率图; 并将酶带的有无,转化为 0, 1二态
性数值(酶带出现为 1, 不出现为 0) , 得到二态性状
矩阵[ 14~ 17] ; 采用 DPS 3. 0 软件类平均法 ( U PG

MA) ,对 41组二态性状数据进行聚类。
2
结果与分析
2. 1
POD酶谱带迁移特征
如图 1所示, 供试材料共出现 22条酶谱带, 各
材料中出现 9条、8条、7条、6条、5条酶谱带数的苜
蓿材料, 依次占全部供试材料的 14. 7%、39%、
36. 5%、7. 3%和 2. 4% ,其中陇东野生紫花苜蓿出
现 6条带,酶谱带数相对偏少。根据酶带在胶版上
的分布,将 22条带分为 A、B、C、D四个区。
A 区( 0. 00
Rf
0. 19) : 只有 Rf 0. 07一条谱
带,且全部供试材料均出现该谱带,故为苜蓿的共有
谱带。但谱带颜色深浅不同,除皇后 2000(M . sati

va L. cv. Regina2000)、牧歌 401+ Z(M. sativa L.
cv. Bucolicaor um 401+ Z)、佳木斯( M . sat iv a L.
cv. Jiamusi)、大西洋( M. sativa L. cv. At lant ic )、
沃库(M . sativa L. cv. Wookoo )、德宝( M. sativa
L . cv. Derby)、德福 (M. sativa L. cv. Def t ) 7个材
料酶带的酶活性呈 2级外,陇东野生紫花苜蓿和其
它 33个材料的酶带酶活性均呈 3级。


B区( 0. 19< Rf
0. 53) :共有 12条谱带,在 Rf
0. 22、Rf 0. 32、Rf 0. 39出现谱带的材料, 分别占全
部供试材料的 55% , 78. 05% , 75. 6% , 出现几率较
高,应为苜蓿的共有谱带。陇东野生紫花苜蓿仅在
Rf 0. 32和 Rf 0. 39出现酶带,且 Rf 0. 32谱带酶活
性较低,呈 2级。在 Rf 0. 18、Rf 0. 26、Rf 0. 47、Rf
0. 52出现酶带的材料, 分别占供试材料的2. 44%、
7. 31%、4. 88%、7. 32% ,出现几率较低,应为特征谱
带,即 Rf 0. 18 谱带为苜蓿王 ( M . sativa L. cv.
Alfakin)特征谱带, Rf 0. 26谱带为肇东( M. sativa
L. cv. Zhaodong )、公农 1 号 ( M. sat iva L. cv.
Gongnong N o. 1)和陇东野生紫花苜蓿的特征谱带,
Rf 0. 47谱带为大西洋和沃库苜蓿的特征谱带, Rf
0. 52谱带为维多利亚( M. sativa L . cv. Victor ia)
和 Pick8925苜蓿( M. sativa L. cv. P ick8925)的特
征谱带。故陇东野生紫花苜蓿在 B区的特征谱带
为 Rf 0. 26,且酶活性较强,呈 2级。
344
第 3期 张雪婷等: 陇东野生紫花苜蓿的遗传特异性分析
表 1
供试材料
Table 1
Materials used in this study
编号与材料
Material number
来源
Source
编号与材料
Materia l number
来源
Source
1* 肇东
(M. sat iva L . cv . Zhaodong)
黑龙江
Heilong jiang
22 巨人
(M. sat iva L. cv . AmeriStand)
美国
USA
2 皇后2000
(M. sat iva L . cv . Reg ina2000)
美国
USA
23* 公农 2号
( M. sativ a L. cv. Gongnong N o. 2)
吉林农科院
Jilin Academy of Ag ricultura l Sciences
3 皇后
(M. sat iva L . cv . Reg ina)
美国
USA
24 维多利亚
( M. sativ a L . cv. Victor ia)
法国
F rance
4 金皇后
(M. sat iva L . cv . Reg ina)
美国
USA
25 杜普梯
( M. sativ a L . cv. Locpuits )
美国
USA
5* 新疆大叶
(M. sat iva L . cv . Xinjiangdaye)
新疆
Xinjiang
26* 中农 32 号
( M. sativ a L . cv . Zhongnong No. 32)
中国农大
China Agricult ural China A gricultural
6三得利
(M. sat iva L . cv . Sanditi)
荷兰
Ho lland
27 Pick8925
(M. sat iva L. cv . Pick8925)
加拿大
Canada
7* 中牧 3号
(M. sat iva L . cv . Zhongmu No. 3)
中国农大
China Agricult ure U niv ersity
28 博来维
( M. sativ a L . cv. Beaver )
加拿大
Canada
8 捷克
(M. sat iva L . cv . Czech)
捷克
Czech
29 沃库
(M . sativ a L . cv .Wookoo )
加拿大
Canada
9* 公农 1号
(M. sat iva L . cv . Gongnong No . 1)
吉林农科院
Jilin Academy of Ag ricultural Sciences
30 阿尔岗金
(M. sat iva L. cv. Alg oquin )
加拿大
Canada
10 牧歌
(M. sat iva L . cv . Bucolicaorum)
美国
USA
31 德宝
( M. sativ a L . cv. Derby)
荷兰
Ho lland
11 牧歌 401+ Z
(M. sativ a L. cv. Bucolicaorum 401+ Z)
美国
USA
32 润不勒
(M. sat iva L. cv . Rumble)
加拿大
Canada
12* 陇东
(M. sat iva L . cv . L ongdong)
甘肃陇东
Longdong , Gansu
33 德福
(M. sati va L. cv. Deft )
加拿大
Canada
13* 陇东野生
(M. sat iva L . cv . L ongdong Native)
甘肃清水
Qingshui, Gansu
34 放牧型苜蓿
(M. sat iva L. cv . Alfag raze )
美国
USA
14* 中兰 1号
(M. sat iva L . cv . Zhnglan No . 1)
兰州畜牧所
L anzhou Inst it ut e o f Husbandry
35 Pick3006
(M. sat iva L. cv . Pick3006)
荷兰
Ho lland
15 飞马
(M. sat iva L . cv . Grandeur )
荷兰
Ho lland
36 苜蓿王
( M. sativ a L . cv . A lfakin )
美国
USA
16* 佳木斯
(M. sat iva L . cv . Jiamusi)
黑龙江
Heilong jiang
37 雷达克
( M. sativ a L . cv . Ladak)
美国
USA
17* 同心
(M. sat iva L . cv . T ongx in)
宁夏
Ningx ia
38 游客
(M. sati va L. cv. Eureka)
荷兰
Ho lland
18* 甘农 1号
(M. sat iva L . cv . T ongx in)
甘肃农大
Gansu A gricultural University
39 哥萨克
(M. sati va L. cv. Cossak)
俄国
Russia
19* 甘农 3号
M. sativ a L. cv. Gannong No. 3)
甘肃农大
Gansu A gricultural University
40 苏联 1号
( M. sati va L. cv. Russia N o. 1)
俄国
Russia
20 大西洋
(M. sat iva L . cv . Atlantic )
美国
USA
41 格林
(M. sat iva L. cv. Grimm )
美国
USA
21* 河西
(M. sat iva L . cv . Hex i)
甘肃河西
Hex i, Gansu


注: * 代表国内材料
Not e: T he aster isk represent s the nat iv e mater ials


C区( 0. 53< Rf
0. 72) :有 6条带。在 Rf 0. 61
和 Rf 0. 65 出现谱带的材料, 分别占供试材料的
68. 29%、63. 14%,亦为苜蓿的共有谱带。陇东野生
紫花苜蓿在 Rf 0. 65出现谱带, 且酶活性较强,呈 2
级。在 Rf 0. 58、Rf 0. 62、Rf 0. 63、Rf 0. 67出现酶
谱带的材料, 分别占供试材料的 12. 2%、14. 63%、
12. 2%和 7. 32%。表明 Rf 0. 67 谱带是新疆大叶
(M . sativa L. cv. Xinjiangdaye)、润不勒( M. sati

va L. cv. Rumble)、雷达克 ( M. sat iva L. cv.
Ladak)的特征谱带。在 Rf 0. 58处陇东野生紫花苜
蓿出现次特征谱带,且酶活性强,呈 3级。
D区( 0. 72< Rf
1. 00) : 有 3 条带, 分别为 Rf
0. 75、Rf 0. 77 和 Rf 0. 89, 对应谱带材料分别占供
试材料总数的 4. 88%、46. 34%、80. 49%。Rf 0. 89
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谱带是供试材料的共有谱带, Rf 0. 75 谱带是沃库、
德宝苜蓿的特征谱带。陇东野生紫花苜蓿在该区未
出现谱带。
图 1
41份苜蓿材料的 POD 同工酶酶谱模式图
Fig. 1
POD iso zyme zymog rame of 41 alfalfa cultivar s
表 2
22 条酶谱带 Rf 的值及出现在该谱带上的材料
Table 2
Rf values of 22 enzyme bands and cor responding cult ivar s
酶谱区段


Zym og ram region


Rf 值
Rf value
出现谱带的材料编号
Material number of corresponding cul tivar
A 区 0. 07* 1~ 41
A Region
( 0. 00
Rf
0. 19)
0. 18 36
B区 0. 21 26 30 32 35 41
B Region 0. 22 2 3 4 6 8 10~ 12 16 20 22 24 25 27~ 29 31 33 34 37 38 40
( 0. 19< Rf
0. 53) 0. 24 5 14 15 17~ 19 21 23 27
0. 26* 1 9 13
0. 28 7 8 10 12 16 19 20 37
0. 32* 2 4~ 6 9 11 13~ 18 21~ 35 38~ 41
0. 39* 2~ 6 8 10~ 13 15 17~ 19 21 23~ 26 28~ 31 33~ 37 39~ 41
0. 42 1 3 7 9 14 20 22 27 32 36 38
0. 47 20 29
0. 49 5 6 10 12 14 17 23 25 26 28 37 39 40
0. 52 4 27 41
C区 0. 58* 10 13 16 26 30
C Region 0. 61 5~ 9 12 14 15 17~ 25 27 29 32 34~ 412
( 0. 53< Rf
0. 72) 0. 62 1 4 11 28 31 34
0. 63 1 15 17 23 39
0. 65* 1~ 3 5 7 9 10 13 14 16 18~ 22 25 27 30 34~ 36 38 40 41
0. 67 27 32 37
D 区 0. 75 29 31
D Region 0. 77 1 3 5 9 10 14 17~ 22 25 27 30 34~ 36 38 40
( 0. 72< Rf
1. 00) 0. 89 1~ 12 14~ 17 19 22~ 28 30 32 34~ 37 39~ 41


注: * 代表陇东野生紫花苜蓿的谱带
Note: Th e asterisk represents the enzyme b ands of Nat ive Med icago S ati v a L. cv. Longdong
346
第 3期 张雪婷等: 陇东野生紫花苜蓿的遗传特异性分析


22条酶谱带的分布( Rf值)及各酶谱带出现的
材料如表 2所示。从各区各材料最先和最后出现的
酶带迁移率差值 | Rf | = | Rf 最后- Rf 最先 | 来
看[ 10, 11] : A 区,均有 1条酶带,不存在迁移率差值; B
区,各材料最先与最后出现的酶带差值为 0. 1
| Rf
|
0. 31, 其中 0. 2
| Rf |
0. 31的材料占 68. 3% ,
而陇东野生紫花苜蓿仅为| Rf| = 0. 13; C区,有 8份
材料仅出现 1条酶带,其余材料迁移率差值为 0. 03

| Rf |
0. 07, 陇东野生紫花苜蓿| Rf | = 0. 07; D
区,有60. 98%的材料迁移率差值为 0. 12
| Rf |

0. 14,其余包括陇东野生紫花苜蓿在内 39. 02%的
材料,仅出现 1条带,不存在迁移率差值。
2. 2
POD酶谱的二态性矩阵及聚类分析
依据供试材料在 22个迁移位点上谱带的有无,
转化为 0, 1二态性数值,得到 41个供试材料的二态
性状矩阵。采用类平均法( U PGMA ) , 将 0, 1二态
性矩阵转化为遗传距离矩阵后, 作聚类分析树状图
(图 2) , 41个材料的遗传距离在 0. 00~ 0. 75之间,
当遗传距离为 0. 75 时, 分为 2 大类, 陇东野生紫花
苜蓿单独聚为一类, 其它 40 个苜蓿材料聚为一大
类。表明陇东野生紫花苜蓿 POD同工酶谱带特征
明显,与其他供试材料存在明显的遗传差异性。
图 2
聚类分析树状图
F ig. 2
Cluster analysis of 41 alfalfa cultivars


聚为一大类的另外 40个苜蓿材料又可分为两
个亚类, 金皇后 ( M. sat iv a L. cv. Reg ina)、牧歌
401+ Z、博来维(M . sat iv a L. cv. Beaver )、公农 2
号(M . sativa L. cv. Gongnong No. 2)、德宝、沃库
为一亚类,其余为一亚类。
3
讨论
3. 1
本试验通过 41个苜蓿材料的 POD 同工酶分
析,共检测出 22条谱带,其中, Rf 0. 07、Rf 0. 22、Rf
0. 32、Rf 0. 39、Rf 0. 61、Rf 0. 65和 Rf 0. 89 共 7条
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酶带为苜蓿共有谱带,所有供试材料均有,揭示陇东
野生紫花苜蓿和大多数苜蓿材料具有共同起源 [ 19] ;
22条谱带中有 Rf 0. 18、Rf 0. 26、Rf 0. 47、Rf 0. 52
和Rf 0. 67的5条特殊谱带,其中 Rf 0. 26谱带只有
陇东野生紫花苜蓿出现, 且频率最低, 仅为 7. 31% ,
故为陇东野生紫花苜蓿的特征谱带。这可能是陇东
野生紫花苜蓿发生了遗传分子水平上的变异, 从而
导致同工酶的表达与大多数苜蓿材料具有差异[ 20]。
3. 2
在 B区, 陇东野生紫花苜蓿最先和最后出现
的酶带迁移率差值, 仅为| Rf | = 0. 13, 反应了酶带
跨度小,且在该差值上有且仅有这一份材料; C区,
该材料最先和最后出现的酶带迁移率差值| Rf | =
0. 07,为此区的最大差值, 故其酶带跨度大, 且由图
1可知酶带排列疏松; 而 A、D 两区各仅有一条带,
不存在酶带跨度。陇东野生紫花苜蓿在 B, C 两区
呈现的酶带差异性, 可能是植物受不同环境影响, 发
生了遗传分子水平上的改变, 从而导致同工酶的表
达有所差异[ 7, 20]
3. 3
聚类分析表明, 41 个苜蓿材料在遗传距离
0. 75处分为两大类: 陇东野生紫花苜蓿单独成类, 其
它 40个材料聚为一类, 由于遗传距离值越大, 亲缘
关系越远,说明单独成类的陇东野生紫花苜蓿与其
它苜蓿材料存在较大的遗传差异。
4
结论
4. 1
41份材料, 共检测出 22条 POD同工酶谱带,
最多出现 9条带, 最少出现 5条带。全部供试材料
出现 7条共有谱带, 分别为: A 区 Rf 0. 07 一条; B
区Rf 0. 22、Rf 0. 32、Rf 0. 39三条; C区 Rf 0. 61、Rf
0. 65两条; D区 Rf 0. 89一条。22条谱带中有 5条
特征谱带, 分别为: A 区 Rf 0. 18 一条; B 区 Rf
0. 26、Rf 0. 47、Rf 0. 52 三条; C 区 Rf 0. 67 一条, D
区未出现。
4. 2
陇东野生紫花苜蓿检测出 6 条带, 分别为: A
区 Rf 0. 07一条, B区 Rf 0. 26、Rf 0. 32、Rf 0. 39三
条, C区 Rf 0. 58、Rf 0. 65两条, D区未出现。其中,
Rf 0. 26带是陇东野生紫花苜蓿独有的特征谱带。
4. 3
在遗传距离 0. 75处, 41个紫花苜蓿材料聚为
2大类: 陇东野生紫花苜蓿单独成类, 其他 40 个材
料归为一类。陇东野生紫花苜蓿与其他材料存在较
大的遗传差异,为其在形态学上与其他苜蓿的差异
提供了有利支持。
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