全 文 ：第 17 卷 第 3 期
Vol. 17 No . 3
草 地 学 报
ACTA AGRESTIA SINICA
2009 年 5 月
May 2009
冰草 ISSRPCR反应体系的建立与优化
王 方1 , 袁庆华1, 2*
( 1.兰州大学草地农业科技学院, 兰州 730020; 2.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所, 北京 100193)
摘要 :为进一步开展冰草属植物种质资源遗传多样性研究, 寻找可用于冰草( Ag rop y r on cr is tatum ( L . ) Gaertn. )
的 ISSRPCR最适反应体系并建立与优化,具有重要的意义。通过优化影响 ISSRPCR体系的主要参数, 最终确定
在 20 L 体系中各反应物的最适含量为: 40 ng 模板 DNA, 0. 2 mmo l L- 1 dNTP, 0. 5 mo l L - 1 ISSR 引物, 1U
Taq DNA 聚合酶, 2 L 10 PCR Buffer , 2. 5 mmo l L - 1 MgCl2; 引物 815 号的最适退火温度为 50 。该体系的建
立为今后利用 ISSR技术进行冰草属种质资源的遗传多样性分析奠定了技术基础。
关键词:冰草; ISSR ; PCR 反应体系;优化
中图分类号: S812; Q943 文献标识码: A 文章编号: 10070435( 2009) 03035404
Establishment and Optimization of ISSR Reaction System for
Agrop yron cristatum ( L. ) Gaertn.
WANG Fang1 , YUAN Qinghua1, 2*
( 1. C ol lege of Pastoral Ag riculture S cience and Techn ology, Lanzhou University, Lanzhou, Gansu
Province 730020, China; 2. Insf itute of Animal Science, CAAS, Bei jing 100193, china)
Abstract: It is necessary to establish and opt imize the ISSRPCR r eact ion system for genet ic div er sity study
of A grop y ron cr istatum ( L . ) Gaertn. Results show that the opt imum concentrat ion of seven reactants in
20 L react ion mixture w ere as follow s: 40 ng genomic DNA, 0. 2 mmol L- 1 dNTP, 0. 5 mol L - 1 IS
SR primer, 1 U T aq DNA polymerase, 2 L 10 PCR buffer, 2. 5 mmo l L- 1 MgCl2 . The suitable an
nealing temperature o f primer 815 w as 50 . T his reaction system w ould prov ide the basis fo r the div ersity
analysis of A. cr i statum w ith ISSR markers.
Key words: Wheatg rass; ISSR; PCR react ion sy stem ; Opt im ization
冰草( A gr op y ron cr istatum ( L . ) Gaertn. )是
禾本科小麦族冰草属的多年生草本植物, 分布于欧
亚大陆温带草原区。冰草是具有重要饲用价值、生
态价值和遗传价值的牧草资源, 研究和开发冰草属
植物的种质资源具有十分重要的现实意义。以往对
于冰草属种质资源遗传多样性的研究, 主要依据生
态学和细胞学特征、染色体组型分析、RAPD 技术
等[ 1~ 3] , 侧重于冰草属植物 ISSR分子标记的研究尚
未见报道。因此, 本试验旨在通过研究 ISSRPCR
反应中各项参数变化对实验结果的影响, 并对反应
体系进行优化, 建立适用于冰草的 ISSR反应体系,
为进一步研究冰草种群遗传多样性奠定基础。
ISSR( Intersimple Sequence Repeats) 是一种
建立在 PCR反应基础上的 DNA 分子标记技术, 由
Zietkiew icz
[ 4] 等人于 1994 年创建。其基本原理是
利用基因组中存在的众多 SSR 本身设计引物, 在
SSR的 3或 5加上 1~ 4个碱基锚定, 对两侧具有
反向排列的 SSR序列间的基因组片断进行扩增,扩
增产物在琼脂糖凝胶电泳中分离,从中鉴定多态性。
ISSR和 RAPD技术相似, 但比 RA PD更稳定, 可重
复性强,多态性更好,而且不需知道被检测物种任何
基因组的信息, 因此 ISSR 标记非常适合基因组信
息缺乏物种的研究。由于 ISSR标记的众多优点,
自发明以来己被广泛应用于生物的遗传多样性和分
子标记研究,广泛应用于农作物研究中[ 5, 6]。
1 材料与方法
供试物种冰草,于 2007年 7月种植于中国农业
科学院畜牧研究所实验地。
收稿日期: 20081109;修回日期: 20090311
基金项目:国家科技支撑项目( 2008BABD3B01) ;基本科研业务费专项( YWFT D3)
作者简介:王方( 1983 ) ,女,汉族,甘肃兰州人,硕士研究生,研究方向为牧草种质资源, Email: w fcayenne@ 163. com; * 通讯作者 Auth or
for correspondence, Email : yuan qin ghua@ hotmail . com
第 3期 王方等:冰草 ISSRPCR反应体系的建立与优化
1. 1 基因组 DNA提取及定量
基因组 DNA 提取参照经典的 SDS 方法, 并略
加改进[ 7]。用 0. 8%琼脂糖凝胶对 DNA 质量进行
电泳检测, 并以一定浓度 DNA 作为定量参照标
准。根据电泳检测结果, 将 DNA 浓度调整为 10 ng
L - 1 , - 20 保存备用。
1. 2 ISSR扩增反应体系及程序
ISSR引物由上海生物工程公司合成, dNTP 和
Taq DNA 聚合酶购于 T aKaRa 公司。试验以随机
选取 的 815 号引 物为固 定引物, 其序列为:
CT CTCT CTCTCT CTCT G。扩增反应在 0. 2 mL
离心管中进行, 利用 M J Resear ch 公司的 PT C
100T M 扩增仪进行扩增。
20 L 反应体系中各反应物含量为: 40 ng 模板
DNA, 0. 2 mmo l L - 1 dNT P, 0. 5 mol L- 1 ISSR
引物, 1U T aq DNA 聚合酶, 2 L 10 PCR Buf fer,
2. 5 mmol L - 1 MgCl2。
ISSRPCR 扩增程序为: 94 预变性 4 m in,
94 变性 30 s, 60 ( 60 ~ 58 )退火 45 s, 72
延伸 1 min 45 s, 共 11 个循环, 每个循环退火温度
降 1 ; 94 变性 30 s, 50 ( 50 ~ 48 ) 退火
45 s, 共 24个循环; 72 延伸 5 min, 25 保温。
1. 3 PCR检测结果
取 7. 5 L PCR 扩增产物与 1. 5 L 6 加样缓
冲液( T aKaRa)混匀,点入含 0. 5 g mL - 1 EB 的
2%琼脂糖凝胶中, 在5 V/ cm 电场强度下电泳 1~ 2
h, 凝胶在紫外灯下观察照相。
1. 4 ISSR 反应条件优化
在确定最佳反应条件时, 参考了地毯草( A xo
nopus comp ressus ( Sw artz) Beauv. ) [ 8]、鸭茅( Dac
ty l is glomerate L. ) [ 9] 、紫花苜蓿( Med icago sativa
L. )
[ 10]的 ISSR扩增程序和反应体系。对反应体系
各因素设置不同梯度水平(表 1)。当试验中对某一
因素进行梯度设置时, 其余因素均保持不变。在最
佳反应体系的基础上对退火温度进行梯度试验, 每
个梯度设 2个重复, 筛选出合适的退火温度。
2 结果与分析
2. 1 DNA 检测
琼脂糖电泳检测冰草 DNA 质量 DNA 电泳带
无拖尾现象且图像较为清晰, 可知所提 DNA 纯度
较高, RNA 和蛋白质含量较少, 且通过与 DNA 对
比可知所提 DNA浓度在 50~ 100 ng L- 1 (图1)。
表 1 ISSR 反应系统优化设计
T able 1 Design o f optimal ISSR reaction sy st em
影响因素
Inf luencing factor
反应参数 Param eter in react ion
1 2 3 4 5 6
Mg2+ ( mmol L- 1) 1. 0 1. 5 2. 0 2. 5 3. 0 3. 5
DNTP( mmol L- 1) 0. 1 0. 15 0. 2 0. 25 0. 3 0. 35
T aq酶( U/体系) 0. 25 0. 5 0. 75 1. 0 1. 25 1. 5
引物 Prim er( mol L- 1 ) 0. 25 0. 5 0. 75 1. 0 1. 25 1. 5
DNA ( ng) 20 40 60 80 100 120
退火温度
Anneal ing temperature ( )
48 50 52 54 56
图 1 DNA电泳检测
Fig. 1 DNA electropho retic detect ion
2. 2 模板 DNA用量对 ISSRPCR的影响
适宜的模板量是保证特异性扩增的前提。由图
2可知,模板用量为 20、40 ng 时, 均能产生清晰 IS
SR条带,而 40 ng 时带更清晰, 在 60~ 120 ng 时,
只有少量主带, 或无扩增产物。因此冰草 ISSR
PCR反应中, DNA 最佳用量为 40 ng。
2. 3 Taq DNA聚合酶用量对 ISSRPCR 的影响
在 ISSRPCR 反应体系中 T aq DNA 聚合酶的
种类以及用量直接影响扩增反应成功与否。由图 3
可知, 当 T aq 酶量大于 1. 25 U 时, 谱带有弥散现
象,且特异性扩增较明显。当 Taq酶量小于 0. 75 U
时,扩增产物减少。考虑综合成本,在 20 L 反应体
系中, Taq DNA聚合酶用量选择 0. 75~ 1. 0 U 为宜。
2. 4 dNTP 用量对 ISSR的影响
dNTP 是 ISSRPCR扩增的原料, 其浓度过高
会导致 PCR错配,从而出现非特异性扩增,浓度过
低又会影响扩增效果, 甚至会因为 dNTP 过早消耗
使产物单链化 [ 11]。由图 4 可知, dNTP 浓度高于
0. 2 mmol L - 1时, 出现明显条带缺失现象;而低于
0. 2 mmol L- 1时, 扩增产物少且出现条带模糊现
象。因此冰草 ISSRPCR反应中最佳dNTP 浓度为
0. 2 mmol L - 1。
2. 5 Mg2+ 用量对 ISSR的影响
当 Mg2+ 浓度低于 2. 5 mmol L- 1时扩增产物
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草 地 学 报 第 17卷
减少甚至没有; 而 Mg 2+ 浓度大于 2. 5 mmo l L - 1
时,谱带背景变浓且出现弥散现象, 主带不易分辨。
因此冰草 ISSRPCR 反应中 Mg2+ 最佳浓度为
2. 5mmol L - 1 (图 5)。
2. 6 引物浓度对 ISSR的影响
如图 6所示: 1~ 6 个泳道均有扩增产物, 但引
物浓度为 0. 25 mol L- 1时, 只有一条主带; 引物
浓度在 0. 5~ 0. 75 mol L - 1时,条带最清晰稳定,
大于 0. 75 mol L- 1时,扩增产物减少, 带不清晰
且有弥散现象。故冰草 ISSRPCR最佳引物浓度在
0. 5~ 0. 75 mol L - 1为宜。
2. 7 退火温度对 ISSR的影响
图 7结果显示: 退火温度为 50 时, 条带清晰
稳定, < 50 时,条带出现缺失现象, > 50 时,多态
性偏低且条带亮度比较暗。故 815号引物最适宜的
退火温度确定为 50 。
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第 3期 王方等:冰草 ISSRPCR反应体系的建立与优化
图 7 退火温度对扩增结果的影响
Fig. 7 Effect of annealing temperature on amplification pattern
12: 48 ; 34: 50 ; 56: 52 ; 78:
54 ; 910: 56 ; M : M ark er
3 讨论
3. 1 基于 PCR 反应的 ISSR 分子标记技术, 其扩
增条带虽然较 RA PD标记稳定,但也受到反应条件
的变化以及物种不同的影响。尤其是体系中 Taq
DNA 聚合酶, Mg 2+ , dNT P 及引物浓度相互影响。
这与文献[ 12] 所研究的内容一致。因此, 为确保
ISSR分析结果的可靠性和重复性,反应条件一旦确
定,就应保持不变,同时还应使用同一厂家生产的试
剂和同一 PCR仪等设备,把影响减小到最低。
3. 2 DNA 模板质量是保证 ISSRPCR扩增的重要
因素,在一定范围内扩增条带会随模板浓度升高而
增加,但模板质量浓度过高,会增加非特异性产物出
现。同时,为保证 PCR 反应的特异性, 引物与模板
的比例也要控制在一定范围内。引物浓度过低时,
扩增产物少,条带弱; 引物浓度过高时, 会引起模板
与引物错配, PCR 反应特异性下降, 还会增大引物
二聚体形成的几率[ 13] 。
3. 3 Taq DNA 聚合酶是 Mg 2+ 依赖性酶, M g2+ 浓
度通过影响 Taq DNA 聚合酶而影响 PCR 扩增。
Mg 2+ 浓度过低对酶的活化作用不够,过高又会抑制
酶活性。除影响酶活性外, M g2+ 浓度还会受到体系
中另一重要成分 DNT P 的影响。主要原因是
DNT P 分子中的磷酸基团能定量与 Mg 2+ 结合产生
拮抗作用,使实际反应中的 Mg 2+ 浓度下降,从而影
响聚合酶的活力。对于 DNT P, 是 PCR反应中的基
本原料, 浓度过高会产生错误渗入, 过低会导致
PCR扩增不完全,效率减低。
3. 4 实验结果表明,退火温度对扩增结果好坏具有
明显影响。在 PCR 实验中, 退火温度过低, 易出现
背景重,弥散的条带;温度过高则出现非特异性扩增
带。只有在合适温度下才会产生特异的 PCR条带,
且没有弥散带。有研究指出,在选择最佳退火温度
时,如扩增结果相近,宜选择较高退火温度以提高反
应的特异性[ 14] 。此外,不同的引物有不同的退火温
度,因此需要对退火温度逐一筛选,以获得稳定可靠
的标记结果。
3. 5 采用单因素实验,可直观快速地得到该因素对
扩增程序的影响, 但是忽略了各因素间的相互作用,
因此, 在后续的实验中还需进一步优化。此外, IS
SRPCR反应体系的建立既要保证扩增结果的可靠
性与重复性,又要兼顾节约成本和尽量缩短实验周
期的原则。
4 结论
本试验确立了冰草 ISSRPCR 反应体系。在
20 L 体系中各反应物的最适含量为: 40 ng 模板
DNA, 0. 2 mmol L - 1 DNTP, 0. 5 mol L- 1 ISSR
引物, 1U Taq DNA 聚合酶, 2 L 10 PCR buffer,
2. 5 mmol L - 1 MgCl2。
参考文献
[ 1] 陈世鐄,齐智鑫. 冰草属植物生态地理分布和根系类型的研究
[ J] .内蒙古草业, 2005, 17( 4) : 14
[ 2] 李景欣,云锦凤,李国瑞,等. 冰草染色体组型分析[ J ] .内蒙古
农业大学学报, 2005, 26( 4) : 2325
[ 3] 李景欣,云锦凤,郭军. 16个天然冰草种群遗传多样性 RAPD
分析[ J] .草地学报, 2005, 13( 3) : 190193
[ 4] Zietk iew icz E, Rafals kia, Labuda D. Gen om e fin gerprin tin g
by sim ple s equence repeat ( S SR)an chored polymeras e chain
react ion amplif ication [ J] . Genomics, 1994, 20: 176183
[ 5] Joshi S P, Gupta V S, Aggarw al R K, e t al . Genet ic diver sity
an d phylogen et ic relat ionship as revealed by inter simple se
quen ce repeat ( ISSR) polymorp hism in the genu s Or yz a [ J ] .
T heor. Appl. Genet . , 2000, 100: 13111320
[ 6] Brantestam A K, Bothmer R V, Dayteg D. Znter s imple se
quen ce repeat analysis of genet ic diversity and relat ionships in
cul tivated barely of Nordic and Balt ic origin [ J ] . H ereditas ,
2004, 144: 186192
[ 7] 王关林,方宏筠. 植物基因工程原理和技术[ M ] .北京:科学出
版社, 1998: 370375
[ 8] 席嘉宾,郑玉忠,杨中艺. 地毯草 ISSR 反应体系的建立与优化
[ J] .中山大学学报(自然科学版) , 2004, 25( 3) : 8084
[ 9] 范彦,曾兵,张新全, 等.中国野生鸭茅遗传多样性的 ISSR 研
究[ J] .草业学报, 2006, 15( 5) : 103108
[ 10] 王瑜,袁庆华.紫花苜蓿 ISSRPCR反应体系的建立与优化[ J] .
草地学报, 2007, 15( 3) : 212215
[ 11] Lu S D. Cur rent pr otocl s for molecular biology. 2nd Edition
[ M ] . Beijing: Peking U nion Medical College Pr ess , 1999.
458463
[ 12] 隋晓青,王堃. 克氏针茅 ISSRPCR 反应体系的建立与优化
[ J] .草业学报, 2008, 17( 3) : 7178
[ 13] 邹喻苹,葛颂,王晓东. 系统与进化植物学中的分子标记[ M ] .
北京:科学出版社, 2001. 16
[ 14] 穆立蔷,刘赢男,冯富娟,等. 紫椴 ISSRPCR反应体系的建立
与优化[ J] . 林业科学, 2006, 42( 6) : 2631
(责任编辑 李 扬)
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