全 文 ：第 19 卷
第 5 期

Vol. 19
No. 5
草
地
学
报
ACTA AGRESTIA SINICA



2011 年
9 月

Sep.

2011
航天诱变紫花苜蓿第一代植株( SP1)表型变异
及基因多态性分析
范润钧1, 2, 邓
波2* , 陈本建1 , 柴小琴3 , 张文娟1
( 1.甘肃农业大学草业学院, 甘肃 兰州
730070; 2.中国农业大学动物科技学院草业科学系 , 北京
100193;
3. 甘肃省天水市农科所, 甘肃 天水
741000)
摘要:采用正交设计优化紫花苜蓿( Medicago sativa L. ) SSR-PCR反应体系,从 17 对 SSR引物中筛选出 6对扩增产物
具有稳定多态性的引物,检测第 1代植株的基因多态性。结果表明: 4 个紫花苜蓿品种德福( Defi)、德宝( Derby)、阿尔
刚金( Algonguin)、三得利( Sanditi)共检测到 25 个等位基因,每对引物检测出 2~ 8 个等位基因, 平均为 4. 17 个。结合
植株较高、叶色较深、叶片较大、多叶 4 个表型突变指标, 检测经过表型变异筛选的植株等位基因频率及每个位点的
多态性信息量( PIC) , PIC 在 0. 2216~ 0. 8328 之间变化,平均为 0. 6366。分析多态基因植株与表型变异的相关性, 根
据检测结果初步确定了 13 株突变植株,为后继世代遗传变异的多代跟踪及选育奠定基础。
关键词:航天诱变; 紫花苜蓿;表型变异; 基因多态性
中图分类号: S541. 9; S335



文献标识码: A




文章编号: 1007-0435( 2011) 05-0795-08
Phenotypic Variation and Gene Polymorphism of First Generation ( SP1)
of Spaceflight Carrying Alfalfa Seeds
FAN Run-jun1, 2 , DENG Bo2* , CHEN Ben-jian1 , CHA I Xiao-qin3 , ZHANG Wen-juan2
( 1. Col lege of Grass lan d S cien ce, Gansu Ag ricultural Univercity, Lanzhou, Gansu Province 730070, China;
2. Departerm ent of Gras sland S cien ce, College of Anim al Science and T echnology, C hina Agricultural University, Beijing 100193, Chin a;
3. Gansu T ian shui esearch Insit itute of Agricultural Sciences, Tianshui, Gansu Province 741000, China)
Abstract: T o shorten breeding time and screen mutat ions, alfalfa(M edicago sat iva L. ) seeds w ere carr ied
by spacef light. Phenotypic variation and gene polymorphism of first g eneration ( SP1 ) f rom the alfalfa
seeds w er e analyzed using optim ized SSR-PCR amplif icat ion system w ith orthogonal design. DNA poly-
morphism w as detected by 6 SSR primers out of 17 SSR primers. Results show that 2 to 8 DNA bands
w ere amplified by each primer and the average w ere 4. 17. To tal 25 DNA bands w ere amplif ied. Four char-
acteristic indexes ( plant height , leaf co lor, leaf size, leaf number ) w ere measured. Polymorphism informa-
t ion content ( PIC) changed from 0. 2216 to 0. 8328 and the average is 0. 6366. T hese results preliminary
conf irm 13 mutations and provide foundat ion fo r select ing mutants
phenotypic variation and genomic poly-
morphism.
Key words: Spacef light mutat ion; Alfalfa; Phenotypic variation; Genomic polymorphism


苜蓿(Medicago sat iv a L. )为全球种植面积最
大的豆科牧草, 种植面积将近 3300万 hm2 [ 1]。具有
优质高产、粗蛋白质含量高、适应性广等特点, 是调
整种植业结构, 提高土壤肥力,缓解家畜蛋白质供需
矛盾的理想牧草 [ 2]。目前, 我国的苜蓿育种主要采
用常规育种方法, 这些方法虽简单易行, 应用广泛,
便于利用不同生态区优良的种质资源培育出适合当
地种植的优良新品种,但培育新品种一般所需时间
较长。航天育种(或太空育种)又称空间诱变育种,
具有变异频率高、变异幅度大、有益变异多、稳定性
收稿日期: 2010-03-15;修回日期: 2011- 3-25
基金项目:
十一五
国家科技支撑项目
牧草多因素诱变育种及聚合选育技术研究
( 2008BADB3B04) ;农业部牧草种质资源保护( 2009)
资助
作者简介:范润钧( 1984- ) ,女,甘肃兰州人,硕士,研究方向为牧草育种, E-mail: 105240523@ qq. com; * 通信作者 Author for correspon-
den ce, E-mail: dengbo67@ cau. edu . cn
草
地
学
报 第 19卷
强等特点。航天育种是指利用返回式卫星或高空气
球将植物种子带到太空, 利用太空特殊的环境(空间
宇宙射线、微重力、高真空、弱磁场等因素)使种子产
生变化,引起生物体染色体畸变,进而导致生物体遗
传变异,经地面种植选育新种质、新材料, 培育新品
种的植物育种新技术 [ 3]。农业工作者已将这项技术
很好的与生物技术相结合, 很大程度的缩短了育种
时间。SSR( Simple sequence r epeat )是一类由几个
碱基组成的基序( M ot if)串联重复而成的 DNA 序
列,由于 SSR标记呈共显性遗传,符合孟德尔遗传
规律,能用 PCR扩增, 提供高质量的信息以及在单
个微卫星位点上可做共显性的等位基因分析, 具有
试验重复性好、结果可靠性高等优点,是目前流行的
分子标记技术之一[ 4~ 6] 。
本研究的材料选用经
神舟三号
飞船搭载回收
后的紫花苜蓿种子种植的第 1代植株( SP1 ) , 旨在
完成 SP1 选育过程。通过田间性状调查、SSR 分子
标记技术分析 SP1 的变异情况,在品种内选出特异
单株,为后继世代遗传变异的多代跟踪及选育奠定
基础,进而选育出高品质的苜蓿品种。
1
材料和方法
1. 1
供试材料
试验材料为 4个紫花苜蓿品种,搭载于
神州三
号
卫星, 飞行时间从 2002年 3月 25日至 4月 1日
共 7 d,飞行高度为 198~ 338 km, 倾角 42. 4
, 绕地
球 108圈[ 7] 。4个紫花苜蓿品种分别是德福( Defi,
52株)、德宝( Der by, 47 株)、阿尔冈金( Alg onguin,
66株)和三得利( Sandit i, 59 株) , 共 4 个品种合计
224株, 均为 SP1 植株。试验材料于 2009年 4月 22
日取自甘肃省天水市西部航天育种中心。以单株为
采样单位,每株均取 30 片复叶,用冰盒迅速带回中
国农业大学草地所神内生物技术实验室, 放置于超
低温冰箱保存待用。
1. 2
试验方法
1. 2. 1
田间性状调查选材
对单株种植的紫花苜
蓿材料,进行田间性状观察。与对照组对比, 以 4个
变异性状即植株较高、叶色较深、叶片较大、多叶为
基准进行选材。
1. 2. 2
DNA的提取
采用 CTAB 法[ 8]提取 DNA,
用紫外分光光度计测定 DNA 的浓度和质量, 并把
DNA 浓度调至 50 ng

L- 1备用。
1. 2. 3
扩增反应及产物检测
SSR 扩增反应在德
国雷蒙德梯度 PCR上进行,所用引物由上海生物技
术工程有限公司合成, SSR引物序列如表 1 所示。
根据正交试验设计原理,通过探索正交试验和细调
正交试验来确定航天搭载紫花苜蓿 SSR- PCR反应
体系中各成分的浓度。反应总体积为 25
L, 其中
含 dNTP 0. 2 mmo l
L- 1、T aqDNA 聚合酶 2U、引
物 0. 7
mol
L- 1、Mg 2+ 2. 5 mmol
L- 1以及 10

buffer 和 60 ng 模板 DNA。PCR 反应程序为:
94
预变性 3 min, 95
变性 1 min, 52
退火 1. 5
min, 72
延伸 60 s,共循环 35次,最后 72
保温 8
min, 4
保存。利用该反应条件从 17对引物中筛
选出 6对多态性较好的引物并确定其退火温度。扩
增反应结束后, 取 3~ 6
L 扩增产物, 混合 2
L
Loading Buffer, 用 12%非变性聚丙烯酰胺凝胶进
行电泳分离, 然后银染。
表 1
SSR引物序列
Table 1
SSR pr imer secquence
引物
Primer name
引物序列( 5
- 3
)
Secquence( 5
- 3
)
引物长度
P rime r leng th
AF ca16 up GG TCGAACCAAGCATGT 17
down TA AAAAACA TTA CATGACCTCAAA 24
AF ca15 up TTA CGGGTCTAGATTAGAGAGTATAG 26
down CAAAATGAGTATAGGGAGTGG 21
AF ca1 up CGTATCAATATCGGGCAG 18
down TGTTATCAGAGAGAGAAAGCG 21
AF ca11 up CTTGAGGGAACTATTG TTGAGT 22
down AACG TTTCCCAAAACATACTT 21
AF ca32 up TTTTTGTCCCACCTCATTA G 20
down TTGGTTAGATTCAAAGGGTTAC 22
AF ct11 up GG ACAGAGCAAAAGAACAAT 20
down TTGTGTGGAAAGAATAGGAA 20
MTLEC2 up CGGAAAGATTCTTGAATAGATG 22
down TGGTTCGCTGTTCTCATG 18
B14B03 up GCTTGTTCTTCTTCAAGCTC 20
down ACCTGACTTGTGTTTTATGC 20
AF 245 up TCTTTCCGTTTATTGATGAT 20
down GG TA TTGAAGGATAAGGAAAT 21
MTR58 up GAAGTGGAAATGGGAAACC 19
down GAGTGAGTGAGTG TAAGAGTGC 22
AF ct45 up TA AAAAACGGAAAGAGTTGGTTA G 24
down GCCA TCTTTTCTTTTGCTTC 20
AF ctt1 up CCCATCATCAA CATTTTCA 19
down TTGTGGATTGGAACGAGT 18
MAA660456 up GGGTTTTTGATCCAGATCTT 20
down AAGGTGGTCATACGAGCTCC 20
W6002 up CATATTGTTAGATTTGTGG 19
down GTGAGCGTTAAGTTGGTAGAG 21
W6007 up GATTTGGGCCTCA TTCCTTCTTGT 24
down CCTGAAGGGGGAAAA TTGCCCAC 23
W6018 up AGCAGGA TTTGGGACAGTTGC 21
down ACCGTAGCTCCCTTTTCCA 19
W6019 up TGGAATTTGGGATA TAGGAAG 21
down GCCA TAAGAACTTCCACTT 19
796
第 5期 范润钧等:航天诱变紫花苜蓿第一代植株( SP1 )表型变异及基因多态性分析
1. 3
数据统计
DNA 片断的分子量大小根据 L. 2000 DNA
Marker电泳迁移距离来确定。统计 SSR产物银染
结果,有带记为
1
, 无带记为
0
, 建立数据库。
参照张阿英和刘志鹏[ 9, 10] 的公式计算等位基因
频率, P i 为微卫星位点上某一等位基因的频率
( Number and size of alleles and alleles f requen-
cies) , f i 为第 i 个植株的扩增条带类型, 有条带为

1
, 无条带为
0
, n 为群体内的植株数, N 为群体
在此位点的条带总数。这一公式也普遍应用于其他
未知目的基因剂量的标记中。
P i=
1
N

n
i= 1
f i
Sm ith 等[ 11, 12] 的公式计算每一对 SSR 引物的
多态性信息量( Po lymor phism information content ,
简称 PIC) , 其中 f i 为第 i 个位点的基因频率。
P IC= 1-
f 2i
2
结果与分析
2. 1
筛选表型变异单株
在甘肃省天水市西部航天育种基地试验田种植

神舟三号
搭载的 280粒回收种子和地面对照种子
萌发的植株, 进行对比观察。搭载后的种子经萌发
获得的 224株 SP1 植株中,大部分生长正常,无严重
生理损伤,结实率接近地面对照。但也出现部分形
态特征变异植株, 如植株高度、叶片大小及叶色等发
生了变化。
根据植株较高、叶色较深、叶片较大、多叶 4个
主要变异性状,分别筛选 4个紫花苜蓿品种的变异
单株(表 2)。
表 2
4 个紫花苜蓿品种变异单株的筛选
Table 2
Var iation plant screening o f four alfalfa v ariet ies
变异性状
Variable character
品种 Variety
Defi
( 52株)
Derby
( 47株)
Algonguin
( 66株)
Sandit i
( 59株)
占总株数比
Ratio/ % ( 224株)
植株较高
H igh er plants
2 4 6 5 7. 6
叶色较深
Darker leaves colour
7 10 10 6 14. 7
叶片较大
Bigger leaves
9 3 4 3 8. 5
多叶
M ore leaves
0 0 9 4 5. 8
总计
Total s
18 17 29 18 36. 6
占总株数比/ % 34. 6 36. 2 43. 9 30. 5


注:占总株数比( % ) = 表型变异单株数/植株数
Note: Rat io ( % ) = phen otypic variat ion plants/ total plants
2. 2
植株基因多态性分析
2. 2. 1
SP 1 植株 SSR多态性检测
为检测飞船搭
载对紫花苜蓿种子基因组产生的影响, 用 SSR技术
分析了4个品种共 224个 SP1 植株和地面对照的基
因组。用 6对引物作扩增, 共检测到 25 个等位基
因,每对引物扩增的等位基因数目在 2~ 8之间, 多
数引物扩增的等位基因数为 4左右,扩增片段大小
在 130~ 278 bp之间。在 224个 SP1 植株基因组中
共发现了 15个与地面对照基因组存在多态性的等
位基因,多态性表现为扩增片段的缺失或增加。以
下为个别引物扩增部分 SP1 植株基因组 DNA 的凝
胶电泳图(图 1和图 2)。


在扩增的 17对引物中,有 6对引物可以对多个
SP1 植株基因组产生多态扩增。不同的引物, 扩增
的多态性等位基因明显不同, 扩增的多态性等位基
因数目也从 2 到 8 个不等。如引物 MTR58 扩增
224个 SP 1 植株基因组总共产生了 2个不同的多态
性等位基因, 引物W6007扩增总共产生 3个多态性
等位基因(图 1) ; 引物 W6002 可对多达 27 个 SP1
植株的基因组 DNA 产生多态扩增, 具有多态性的
株数占总株数的 12. 05%, 每个引物扩增 SP1 单株
的 SSR分析结果统计见表3。不同引物的扩增片段
应代表了基因组上的不同等位基因, 故多个引物的
多态扩增结果,在一定程度上反映了空间搭载的紫
花苜蓿种子基因组上不同等位基因的变化。
797
草
地
学
报 第 19卷
表 3
引物扩增 SP1 植株基因组结果
T able 3
P rimer amplificat ion of SP1 plants g enome
引物
Primer name
等位基因
Allele
多态性等位基因
Polymorphic alleles
多态植株数
Polym or phic plants
植株多态率/ %
Polymorphic rates
AFca11 2 2 16 7. 14
B14B03 8 4 21 9. 38
M TR58 5 2 19 8. 48
W6002 3 2 27 12. 05
W6007 3 2 41 18. 30
W6018 4 3 24 10. 71
总计 T otal 25 15


注:用 SSR法检测,以 6对引物扩增 224个 SP1 和地面对照基因组;筛选植株多态率( % ) = 多态植株数/植株数;以地面对照作参考
Note: Detect ing w ith S SR analysis, 6 p rimer amplif ied 224 SP1 plants and cont rol group; polym orphism rate ( %) = polymorphism plants/
total plan ts
2. 2. 2
多态基因植株与表型变异的相关性分析
2. 2. 2. 1
表型变异单株的等位基因频率
等位基
因频率是指一个群体中某一基因对其等位基因的相
对比率。微卫星标记中的所有统计指标都是以等位
基因频率为基础的。
本试验采用的微卫星引物共 17对,但具多态性
且条带清晰的只有 6对, 其余 11对引物未能得到理
想主带。根据 4个主要的变异性状:植株较高、叶色
较深、叶片较大、多叶, 分别筛选 4个紫花苜蓿品种
的变异单株。利用以上公式求得这些变异单株等位
基因频率(表 4)。0/ 1法统计结果表明,各位点等位
基因频率相对较高, 说明按照变异性状筛选出的单
株基因多态性明显。6个微卫星位点共有等位基因
25 个, 同一位点不同等位基因在各群体间存在差
异。如 B14B03的 176 bp等位基因在 Sandit i(三得
利)中的频率高达 0. 8667, 而在 Defi (得福)中只有
0. 2500; MT R58的 186 bp位点在 Algonguin(阿尔
刚金)中的频率为 0. 6800, 而在 Derby (德宝)中为
0. 4545。另外,不同材料在同一等位基因上也存在
差异,如 MT R58 位点在 Derby(德宝)这个材料不
存在 184 bp等位基因。各微卫星位点的等位基因
观测值为 2~ 8个,每个位点等位基因观测值的平均
值为 4. 2; 各微卫星位点的有效等位基因为 2 ~ 4
个, 每个位点的平均有效等位基因是 2. 5,低于 4. 2。
798
第 5期 范润钧等:航天诱变紫花苜蓿第一代植株( SP1 )表型变异及基因多态性分析
表 4
4 个紫花苜蓿筛选单株中 6 个 SSR
位点的等位基因频率( 0/ 1 法)
Table 4
Allele frequency of 6 SSR loci in scr eening
individua l of 4 alfalfa var ieties( 0/ 1 method)
片段大小 Allele s ize Def i Derby Algongu in Sandit i
AFca11

130 0. 6667 0. 8182 0. 7600 0. 4667

134 1. 0000 0. 9091 1. 0000 0. 9333
B14B03

160 0. 3333 0. 5455 0. 3600 0. 4000

162 0. 7500 0. 4545 0. 7200 0. 8000

166 1. 0000 1. 0000 0. 9600 1. 0000

170 0. 1667 0. 3636 0. 3600 0. 2667

176 0. 2500 0. 5455 0. 3200 0. 8667

180 0. 2500 0. 5455 0. 2800 0. 5333

188 0. 2500 0. 1818 0. 2800 0. 0667

192 0. 5000 0. 3636 0. 2800 0. 0667
MT R58

172 0. 5833 0. 6364 0. 4800 0. 3333

174 0. 5000 0. 8182 0. 4400 0. 5333

180 0. 4167 0. 6364 0. 5200 0. 7333

184 0. 0833 0. 0400 0. 3333

186 0. 5000 0. 4545 0. 6800 0. 8000
W6002

220 1. 0000 0. 9091 1. 0000 1. 0000

260 0. 6667 0. 8182 0. 7200 0. 9333

266 0. 7500 0. 8182 0. 8400 0. 6000
W6007

198 0. 7500 0. 7273 0. 7200 0. 7333

202 0. 3333 0. 4545 0. 6000 0. 8000

236 0. 9167 1. 0000 0. 9600 0. 9333
W6018

224 0. 3333 0. 6364 0. 1600 0. 4000

260 0. 8333 1. 0000 1. 0000 1. 0000

270 1. 0000 1. 0000 0. 9200 0. 8000

278 0. 6667 1. 0000 0. 9600 1. 0000
2. 2. 2. 2
表型变异单株的多态信息含量
多态信息含量是表示微卫星位点变异程度高低
的一个指标, 当 PIC> 0. 5时该位点为高度多态性;
当 0. 25< PIC
0. 5时,为中度多态性位点, 标记可
以提供较合理的信息; 当 PIC
0. 25 时, 为低度多
态性位点,标记提供信息的能力较差[ 13] 。各位点在
各品种中的多态信息含量见表 5。


由表 5可知,各材料的平均多态信息含量分布
范围是从 Derby (德宝)的 0. 6060到 Def i (得福)的
0. 6784。绝大部分材料的 PIC 均大于 0. 5, 具有高
度多态性。在 6 个位点中, 除 W6018 位点为
0
3547外,其余 5个位点的 PIC均大于 0. 5, 表明这
6对引物可为这 4个品种提供理想的信息。6 个位
点中, 0. 6< PIC< 0. 7的位点有 3 个, PIC > 0. 7 的
位点有 2个,其中A Fcal l位点的值最大,为 0. 8133。
各位点各材料的平均 PIC 值为 0. 6366, 这与张阿
英[ 9] 用 6个位点对 8个紫花苜蓿研究所得的平均
PIC 值 0. 65基本相同。进一步说明根据形态特征
筛选出的单株其多态性信息含量丰富。
表 5
各位点各群体的多态信息含量( 0/ 1 法)
Table 5
Po lymorphism information content at each
lo cus of each gr oup ( 0/ 1 method)
Defi Derby Algonguin San diti平均 Average
AFca11 0. 8252 0. 7702 0. 8328 0. 8249 0. 8133
B14B03 0. 6450 0. 5314 0. 6683 0. 6262 0. 6177
MT R58 0. 6062 0. 7892 0. 5731 0. 6088 0. 6443
W6002 0. 7689 0. 5431 0. 8369 0. 7798 0. 7322
W6007 0. 6356 0. 6879 0. 5990 0. 7079 0. 6576
W6018 0. 5897 0. 3141 0. 2216 0. 2934 0. 3547
平均 Aver age 0. 6784 0. 6060 0. 6220 0. 6402 0. 6366
2. 2. 2. 3
基因组多态率较高的 SP1 植株及其表型
变异
根据 SP1 植株的形态特征, 一共总结出 4个
较明显的表型变异类型, 即植株较高、叶色较深、叶
片较大、多叶。分析这些表型变异植株的等位基因
频率及群体多态性信息含量, 初步从这些筛选出的
植株当中找出变异单株以供世代研究。
对不同的 SP1 植株基因组进行多态性分析可
知(表 6) , 在 224 个 SP 1 植株中, 56 株 (总株数的
25% )的基因组 DNA 可以扩增出与地面对照不同
的差异带,其中多数(占总株数的 13. 4%)具一个多
态性等位基因,有 13株具 3 个以上多态性基因座,
占总株数的 5. 81%。根据分析结果可以认为,航空
飞船搭载可导致较多紫花苜蓿种子的基因组产生变
异, 并且有些种子基因组产生了多个等位基因的变
异。


表 6中具 3个以上多态性等位基因的有 13株
SP1 植株,其基因组多态分析结果及其表型变化列
于表 7。由表中数据可知,在所检测的 25个等位基
因中, Def-i 07, Derby-35, Algonguin-01, Alg onguin-
28和 Sandit-i 21这 5个 SP1 植株, 可在其基因组检
测到 7个以上的多态性等位基因; 结合表型变化分
析发现, 基因组多态率高的植株大多数都有较明显
的变异表型, 如 Algonguin-01, Algonguin-28 和
Sandit-i 49等, 但也有个别基因组多态率高的植株,
如 Def-i 07, 在本研究观察的数个表型范围内未发现
形态性状的变异。可见 SP 1 植株的基因组 DNA 多
态性与所观察的表型变异之间有一定的相关性, 但
不是必然的联系。
799
草
地
学
报 第 19卷
表 6
SP1 植株基因组多态性差异
Table 6
Genome po lymorphisms differences of SP 1 plants
多态性等位基因数
Polymorphic loci
1 2 3~ 5 > 5 总计 Sum
具有多态性等位基因的植株数
Plants w ith polym orphic loci
35 8 7 6 56
具有多态性等位基因的植株所占比例
Plants w ith polym orphic loci/ t otal plants
15. 6% 3. 57% 3. 13% 2. 68% 25%
表 7
基因组多态率较高的 SP1 植株及其表型变异
Table 7
SP1 plants and pheno typic var iation o f higher genome polymorphism rate
株号
Plants No.
多态性等位基因数
Polymorphic loci
等位基因多态率/ %
Polymorp hic loci/ t otal loci
S P1 明显变异表型
M orphological changes in SP1 plants
DEFI-04 3 12 叶色较深
DEFI-07 8 32 ----
DEFI-50 10 40 叶片较大
DERBY-15 6 24 叶色较深
DERBY-35 7 28 ----
Algon guin- 01 9 36 植株较高
Algon guin- 10 4 16 多叶( 4、5叶)
Algon guin- 28 11 44 植株较高
Algon guin- 35 3 12 多叶( 4、5)
Algon guin- 43 4 16 叶色较深
Algon guin- 65 3 12 多叶( 4、5)
S andit-i 21 9 36 植株较高
S andit-i 49 3 12 叶片较大


注:用 SSR法检测,以 6对引物扩增 224个 SP1 单株和地面对照基因组 DNA:共扩增 25个等位基因;等位基因多态率 ( %) = 多态性基因
座数/总扩增基因座数;植株变异表型以地面对照组平均表型为参照;
----
表示在本研究所观察的表型范围没有变异
Note: Detect ing w ith SSR analys is, 6 prim er amplif ied 224 SP1 plants and con tr ol group; 25 alleles amplif ied; gene polymorph ism rate
( % ) = polym orphism loci / t otal augmentat ion loci; the average phenotyp e of ground cont rols is a standard for plan t variat ion phenotyp e
----

n o ph enotype variat ion
3
讨论与结论
3. 1
田间变异性状筛选结果
通过田间性状观察, 与地面对照组比较发现有
4个变异性状, 分别是植株较高、叶色较深、叶片较
大、多叶。经过统计得到表型变异的植株分别占总
植株数的结果为植株较高 ( 7. 6% )、叶色较深
( 14
7%)、叶片较大( 8. 5%)、多叶( 5. 8% ) ; 单个品
种中的变异植株占每个品种总植株的比例分别为:
德福( Defi, 34. 6% ) , 德宝( Derby , 36. 2%) , 阿尔冈
金( A lgonguin, 43. 9%) ,三得利 ( Sandit i, 30. 5% )。
说明空间搭载对紫花苜蓿外观性状有一定的影响。
3. 2
SSR-PCR 最佳反应体系的建立以及引物的
筛选
采用正交设计方法确定 SSR反应体系,并对结
果进行验证。在正交设计的基础上,得出了航天搭
载紫花苜蓿 SSR最佳反应体系: 25
L 反应总体系
包括 Mg2+ 2. 5 mmol
L - 1、dNTP 0. 2 mmol
L- 1、
引物 0. 7
mol
L- 1、T aq DNA 聚合酶2 U 以及 2.
5
L 10
buf fer 和60 ng 模板 DNA。循环参数为:
94
预变性 3 min, 95
变性 1 min, 52
退火 1. 5
min, 72
延伸 60 s,共循环 35次,最后 72
保温 8
min, 4
保存。在试验确定的最佳反应体系基础
上, 对 17对 SSR引物进行筛选, 共选出 6对扩增条
带信号强、背景清晰的引物,对试验材料进行多态性
检测。
3. 3
SP1植株 SSR多态性检测结果
用 SSR技术分析了 4个品种共 224 个 SP 1 植
株和地面对照的基因组。用 6 对引物作扩增, 共检
测到 25个等位基因,每对引物扩增的等位基因数目
在 2~ 8之间,多数引物扩增的等位基因数为 4个左
右, 扩增片段大小在 130~ 278 bp之间。在 224个
SP1 植株基因组中共发现了 15个与地面对照基因
组存在多态性的等位基因, 多态性表现为扩增片段
的缺失或增加。不同引物的扩增片段代表了基因组
上的不同等位基因, 6对扩增效果较好的引物中, 测
得的植株多态率最高可达 18. 3% ,多个引物的多态
扩增结果,在一定程度上反映了空间搭载的紫花苜
800
第 5期 范润钧等:航天诱变紫花苜蓿第一代植株( SP1 )表型变异及基因多态性分析
蓿种子基因组上不同等位基因的变化。
3. 4
多态基因植株与表型变异的相关性分析结果
一方面,检测表型变异单株的基因多态性。分
析 4个品种中, 表型变异单株各位点的等位基因频
率,用 0/ 1法统计结果表明,各位点等位基因频率相
对较高,说明按照变异性状筛选出的单株基因多态
性明显;同样分析表型变异单株的多态性息含量, 绝
大部分材料的 PIC 均大于 0. 5, 说明按照变异性状
筛选出的单株具有高度多态性。
另一方面, 统计 SP 1 植株中基因多态率高的单
株的表性特征。在 224 个 SP1 植株中, 56 株(总株
数的 25%)的基因组 DNA 可扩增出与地面对照不
同的差异带,统计这 56 个单株的形态特征: 植株较
高( 10. 7% )、叶色较深 ( 28. 6%)、叶片较大 ( 12.
5%)、多叶( 8. 9%)、无变异特征( 21. 4% ) ,可见 SP1
植株的基因组 DNA 多态性与所观察的表型变异之
间有一定的相关性, 但不是必然的联系。进一步证
明了空间搭载对紫花苜蓿表性特征及基因组变化的
影响。
3. 5
变异株系的确定
在224个 SP1 植株中, 56株(总株数的25%)的
基因组 DNA 可扩增出与地面对照不同的差异带,
其中有 13株具 3个以上多态性等位基因,占总株数
的 5. 81%。这 13 株分别是: DEFI-04, DEFI-07,
DEFI-50, DERBY-15, DERBY-35, Alg onguin-01,
Algonguin-10, Alg onguin-28, Alg onguin-35, A lgon-
guin-43, Alg onguin-65, Sandit-i 21和 Sandit-i 49。
3. 6
后续世代的种植和筛选方法以及表型与基因
组变异探讨
筛选出的 13株 SP 1 植株, 与地面对照组相比多
数存在表型变异特征。一般变异植株在其后连续 3
代的分离有以下 3种类型 [ 14~ 16] :一是前代的某些形
态性状变化在后代某些单株得以保留, 甚至更明显;
二是前代单株的形态性状变化在后代中逐渐回复;
三是后代单株出现前代所没有的新的形态性状变
化。为探索经飞船搭载后种子的基因组变异在世代
遗传中的规律性,进一步应用分子标记技术跟踪分
析以上 13个筛选出的变异单株及其连续多代单株
基因组变化。通过表型观察以及分子标记手段从
SP1 植株中共筛选出 13株系, 收种 30粒单株种植
成 SP2 株系, 用同样的种植筛选方法, 经 3~ 4 代
( SP3 ~ SP4 )选育获得形态性状明显变异, 并能稳定
遗传的突变株,种成 SP5 的突变株系。另外还混收
与地面对照组形态性状没有明显差异的第 1代单株
种子,混播单株种植 SP 2 ,选择与地面对照组形态性
状有明显差异的单株,对形态性状变异单株经过多
代种植和选育,获得形态性状明显变异,并能稳定遗
传的突变株系。
3. 7
利用 SSR分子标记研究航天搭载紫花苜蓿变
异的必要性和可行性
近年来, SSR标记因诸多优点而被广泛应用于
植物研究中, 由于微卫星标记在基因组中具有数量
大、分布均匀、多态含量丰富、显性遗传及检测方便
等优点, 已成为遗传图谱构建、功能基因定位、标记
QT L 连锁分析、分子标记辅助选择和检测种群内遗
传变异等多领域应用研究中的重要标记 [ 17]。本研
究利用 6对 SSR 引物对 224个经卫星搭载的紫花
苜蓿 DNA 进行扩增, 检测到 25个等位基因, 每对
引物检测出 2~ 8个等位基因,平均为 4. 17个, 平均
PIC 值为 0. 6366。表明利用 SSR分子标记各位点
多态性信息含量丰富,利用 SSR分子标记配合表型
变异观察来筛选经卫星搭载紫花苜蓿的突变体是可
行的。
3. 8
诱变系的利用
在本试验的基础上,利用分子标记技术结合生
理生化手段分析飞船搭载后种子的多代植株基因组
的多态性,跟踪分析突变株系与前后代基因组多态
性的关系,以了解基因组多态性在世代之间的遗传
规律,探讨空间诱变的基因组变异特点,最终确定能
够稳定遗传的,并且具有高品质的紫花苜蓿突变株
系, 在生产实践中得以应用。
另外,苜蓿属包括 56个种,其中 22个种为多年
生异花受粉, 34个种为一年生自花受粉。除人工种
植的紫花苜蓿外, 苜蓿属中其余绝大部分为野生种。
这些野生种是经长期自然选择保存下来的,具有一
些特殊优点, 如适应性好、抗逆性强, 能够在风土较
差的条件下生长生存。通过种质渐渗, 将苜蓿野生
种中的有利基因转移到苜蓿栽培种内, 提高栽培种
的抗逆能力, 并改善其有关经济性状, 这是苜蓿改良
工作的重要内容之一 [ 10]。那么利用航天搭载而产
生的有益突变体, 亦可成为对苜蓿野生种种质渗透
工作的重要课题之一。
801
草
地
学
报 第 19卷
参考文献
[ 1]
李富娟,玉永雄.苜蓿蛋白质及影响苜蓿粗蛋白含量的主要因
素[ J ] .草业与畜牧, 2006( 2) : 23-24
[ 2]
李红,罗新义,王玉林,等.高产高蛋白质高抗性苜蓿品种选育
[ J ] .草地学报, 2002, 10( 1) : 28-32
[ 3]
密士军,郝再彬.航天诱变育种研究的新进展[ J ] .黑龙江农业
科学, 2002( 4) : 31- 33
[ 4]
黄秦军,苏晓华,张香华. SSR 分子标记与林木遗传育种[ J ] .世
界林业研究, 2002, 15( 3) : 14-21
[ 5]
李新军,黄敏仁, 潘惠新,等. 林木基因组中的微卫星( S SR)及
其应用[ J ] .南京林业大学学报, 1999, 23( 5) : 64-69
[ 6]
唐荣华,张君诚, 吴为人. SSR 分子标记的开发技术研究进展
[ J ] .西南农业学报, 2002, 15( 4) : 106- 109
[ 7]
骆艺.飞船搭载水稻种子连续世代遗传变异及基因组多态性分
析[ D] .广州:华南农业大学, 2006
[ 8]
吴宗怀.紫花苜蓿、杂花苜蓿、黄花苜蓿的 SSR 分子标记分析
[ D] .呼和浩特:内蒙古农业大学, 2007
[ 9]
张阿英.中国苜蓿地方品质 SSR 分析[ D] .哈尔滨:东北农业大
学, 2002
[ 10] 刘志鹏.不同耐盐性状紫花苜蓿的 SSR 分子标记研究[ D] .杨
凌:西北农林科技大学, 2004
[ 11] Mansoori T A, EI-Deen M N, Cal igari P D S. Evaluat ion of in
vit ro s creening techniques for salt t olerance in date palm[ J] .
Acta H ort icultur e, 2007, 736: 301-307
[ 12] 覃鸿妮,蔡一林,杨春蓉,等.玉米诱变系的 SSR 遗传变异分析
[ J] .核农学报, 2008, 22( 6) : 750-755
[ 13] Nei M . Gen et icd istanceb etw eenp opulat ions [ J] . Animal Na-
tu re, 1972, 106: 283- 292
[ 14] 李社荣,曾孟潜,刘雅楠,等.植物空间诱变研究进展[ J ] .核农
学报, 1998, 12( 6) : 375-37
[ 15] 周峰,易继财,张群宇,等.水稻空间诱变后代的微卫星多态性
分析[ J] .华南农业大学学报, 2001, 22( 4) : 55-5
[ 16] 易继财,庄楚雄,姚涓,等.空间搭载诱导水稻种子突变的分子
标记多态性分析[ J] .生物物理学报, 2002, 18( 4) : 478-483
[ 17] 张阿英,胡宝忠,姜述君,等.影响紫花苜蓿 SSR 分析因素的研
究[ J] .黑龙江农业科学, 2002( 1) : 15- 17
(责任编辑
李美娟)

草业科学
2012年征订启事

欢迎投稿
欢迎订阅
欢迎刊登广告


草业科学
1984年创刊,是由中国草学会和兰州大学草地农业科技学院共同主办, 面向国内外公开发
行的综合性科技期刊。该刊为
中文核心期刊
、
中国科技核心期刊
和
中国农业核心期刊
,是
中国核心
期刊(遴选)数据库
、中国科学期刊文献数据库、英国 CABI、
中国期刊网
、
中国学术期刊(光盘版)
、中国
科技期刊数据库、中文电子期刊服务( CEPS)数据库的固定源期刊,并在中国期刊网、中国科技期刊数据库全
文上网。近几年,
草业科学
相继获得
全国畜牧兽医优秀期刊一等奖
、
全国优秀农业期刊贰等奖
和
甘
肃省优秀科技期刊奖
等荣誉。2010年版科技部中国科技信息所
中国科技期刊引证报告
统计总被引频次
和影响因子分别上升为 2 595和 1. 606, 分别在全国畜牧、兽医科学类期刊中排名第 1位和第 2位。

草业科学
主要报道草业科学领域最新基础研究与技术研发成果和国内外草业科技政策动态,刊登院
士、高层专家、草业政策制定者和执行者对热点问题的分析, 为从事草业科研、教学、生产和管理的专家、学
者、院校师生、基层科技推广和政府决策人员提供草业科技、国内外草畜产品信息,为农牧民提供技术与市场
咨询参考。本刊结合草业科学学科发展和科技期刊的定位,目前主要设有专论、前植物生产层、草人诗记、植
物生产层、动物生产层、后生物生产层、基层园地、业界信息等栏目,不仅为高校、科研单位的师生提供交流平
台,同时为基层科技人员的成果交流创造机会。另外, 本刊广告服务项目范围为畜牧机械、草种、化学药剂、
仪器设备以及科研机构、重点实验室、高科技农业企业的形象广告等。

草业科学
为月刊, 大16开本, 亚芬纸印刷,彩色封面覆膜,国内外公开发行,邮发代号 54-51, 每期定价
12元,全年 144元。全国各地邮局均可订阅,也可直接与编辑部联系订阅。
标准刊号: ISSN 1001-0629

CN62-1069/ S








邮发代号: 54-51
地址:兰州市城关区嘉峪关西路 768号
草业科学
编辑部 邮编: 730020
电话: 0931-8912486 传真: 0931-8912486
E-mail: cykx@ lzu. edu. cn 网址: ht tp: / / cykx. lzu. edu. cn
802