全 文 ：园 艺 学 报 2001, 28 ( 6) : 544~ 550
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期: 2001- 04- 25; 修回日期: 2001- 08- 08
茉莉幼苗 ATP 酶活性的超微细胞化学定位与
耐冷性研究
苏金为1 王湘平2
( 1福建农林大学基础部 , 福州 350002; 2 福建农林大学测试中心, 福州 350002)
摘 要: 采用磷酸铅沉淀的细胞化学方法 , 电镜下观察两个抗冷力显著不同的茉莉品种
幼苗ATP 酶活性在细胞中超微结构定位及其经冷胁迫的变化。结果表明, 抗寒力强的双瓣茉
莉品种比抗寒力弱的单瓣品种在低温胁迫下超微结构和 ATP 酶活性有更强的适应能力。茉莉
幼苗叶肉组织ATP酶主要定位于细胞质膜、液泡膜、叶绿体片层、线粒体脊和胞间连丝等部
位, 小叶脉维管束的ATP酶主要分布在筛管和伴胞。
关键词: 茉莉; 低温胁迫; 超微结构; ATP酶
中图分类号: S 685.16 ; Q 944 文献标识码: A 文章编号: 0513353X ( 2001) 06054407
茉莉 ( Jasminum sambac L. Ait. ) 是喜温植物, 常由于冬季低温伤害影响翌年花的产
量。有关茉莉低温伤害机理的研究报道很少。细胞膜是低温冷害的首要部位1 , 膜损伤导
致植物代谢的变化和功能紊乱。ATP酶是一种膜结合的功能性蛋白, 是生物生理代谢的关
键酶。许多研究表明 ATP酶对外界因子反应敏感, 与机体抗性有密切联系2~ 5 。这些研究
较多采用生化分析, 提取测定离体 ATP 酶活力, 对该酶的细胞学定位只有为数不多的报
道6~ 8 。作者采用细胞化学方法, 在电子显微镜下直观地显示耐冷力不同的两个茉莉品种
幼苗ATP酶活性及在细胞中的超微结构定位, 探讨其冷害的原初反应及耐冷机制。
1 材料与方法
选用抗寒力较强的主栽双瓣茉莉品种 (广东种) 和花质优异但不耐寒的单瓣茉莉品种
(台湾种) , 春季剪取枝条扦插于营养钵。当年初冬选取生长一致的幼苗转移到生长培养
箱, 光强 4000 lx, 0 ! 下分别处理 6、12和24 h ( 12 h黑暗+ 12 h光照)。以未经冷处理的
同期室外苗为对照。每处理10株。处理后将幼苗置于室外 (日均温13 ! ) 观察生长状况。
制片: 剪取顶芽下 第 2片叶切成约 2 mm ∀ 0. 2 mm ∀ 0. 2 mm 的薄片, 放入0. 1 mol#
L- 1磷酸缓冲液 ( pH 7. 0 ) 配制的 5%戊二醛固定液, 0~ 4 ! 下固定 24 h 后用 1%锇酸固
定4 h, 系列浓度酒精脱水, 环氧树脂 EPON812渗透、包埋, LKBV型超薄切片机定位切
片。切片厚约 70 nm, 醋酸双氧铀和柠檬酸铅双重染色, JEM1010透射电镜观察拍照。
ATP酶的细胞超微结构定位: 取样方法同上, 按 Bentwood等8 的方法略加修改。用
0. 05 mol#L- 1二甲基胂酸钠缓冲液 ( pH 7. 2 ) 配制的2. 5 %戊二醛和 4%甲醛混合液固定
2 h, 0. 05 mol#L- 1TrisMaleate 缓冲液 ( pH 7. 2 ) 清洗 2 h, 然后将材料放入酶反应液中6 ,
27 ! 孵育 2 h。以反应液不加底物 ATP 和在反应液中加0. 01 mol#L- 1的氟化钠酶活抑制剂
作对照。孵育后的材料用二甲基胂酸钠缓冲液清洗 1 h, 按上述制片法进行后固定, 脱
水, 渗透, 包埋, 切片。切片不经染色直接观察拍照。
2 结果与分析
2. 1 常温下叶肉细胞超微结构及 ATP酶活性的细胞化学定位
常温下生长的单瓣品种叶片叶肉细胞结构完整, 液泡充盈, 细胞质与壁紧密相贴, 叶
绿体沿壁分布, 片层丰富清晰, 基粒垛叠的层次多, 排列整齐与壁平行。线粒体脊发达,
基质电子密度高 (图版∃ , 1、3)。单瓣与双瓣品种间细胞超微结构无明显差异。
叶片经ATP 酶反应液孵育 2 h, 在电镜下观察, ATP 酶活性反应产物磷酸铅沉淀以电
子致密粗细不等的黑色线条或大小不同的点状出现, 在细胞内分布位点明确, 界限分明,
主要定位在质膜、液泡膜、线粒体脊、叶绿体片层和胞间连丝上 (图版 %, 1~ 4)。单瓣
与双瓣品种细胞 ATP 酶的分布和活性差别不显著。不同组织 ATP 酶活性强度差异显著。
小叶脉韧皮部的筛管 ATP酶活性比叶肉组织强, 伴胞也呈现 ATP酶活性。叶脉周围细胞
ATP 酶活性存在梯度, 距叶脉愈近的薄壁细胞活性愈强 (图版 %, 6)。这显然与光合产物
在韧皮部的逆浓度装入和运输有关。
酶孵育液中不加底物 ATP 和加酶活抑制剂 NaF 的对照切片上未观察到磷酸铅沉淀,
表明沉淀确实来源于 ATP 酶特异反应 (图版%, 7)。
2. 2 低温胁迫下叶肉细胞超微结构及 ATP酶活性变化
幼苗经低温胁迫 6 h, 单瓣品种叶肉细胞在质膜和线粒体脊上的 ATP 酶活性明显降
低, 液泡膜和叶绿体片层上的磷酸铅沉淀减少更甚, 酶几近失活, (图版 %, 9、10 ) ; 双
瓣品种叶肉细胞仍保持高的 ATP 酶活性, 仅叶绿体片层上的酶反应产物略减, 其它部分
与低温处理前比较没有显著差异 (图版 %, 5、8)。此时两品种细胞超微结构均未见明显
变化 (图版∃, 2、4~ 8)。
当低温处理延续到 12 h, 单瓣品种的叶片细胞结构损伤严重, 质壁分离, 叶绿体片层
紊乱、集结, 被膜破裂, 线粒体空泡化 (图版∃ , 9、12) ; 仅有微量沉淀颗粒零星分布于
质膜, 其余各细胞器均未见酶反应产物 (图版 %, 13) ; 冷处理结束恢复常温后, 叶片出
现水渍状, 继而枯黄、萎蔫, 陆续死亡, 说明这种程度的超微结构损伤和 ATP 酶变性是
不可逆的。双瓣品种细胞超微结构变化较少, 原生质轻微孤立, 液泡内含物增加, 叶绿体
片层减少, 基粒排列方向改变, 线粒体脊减少, 基质电子密度降低 (图版 ∃, 10、13)。
细胞ATP酶整体活性水平也开始明显下降, 液泡膜ATP酶大多失活, 叶绿体片层酶活性
十分微弱, 与单瓣品种经 6 h处理的现象类似, 质膜和线粒体脊的酶反应产物仍维持较高
水平, 线粒体脊酶活力减少的幅度最小 (图版%, 11、12)。
低温持续 24 h, 双瓣品种叶片细胞细胞质内陷, 分隔液泡, 叶绿体片层进一步减少,
线粒体基质凝结 (图版∃ , 11、15)。ATP 酶活性继续下降, 质膜上磷酸铅沉淀呈不连续
的小黑点, 线粒体脊上的 ATP酶活性是此时细胞中的最高水平 (图版 %, 14、15)。幼苗
恢复常温后能正常生长, 表明此程度的超微结构损伤和 ATP 酶变性是可逆的。单瓣品种
则因作为骨架的膜结构解体, 膜结合的 ATP酶活性消失殆尽 (图版∃ , 14)。
5456期 苏金为等: 茉莉幼苗 ATP酶活性的超微细胞化学定位与耐冷性研究
3 讨论
抗寒力强的双瓣茉莉品种在 0 ! 胁迫 24 h期间维持较高 ATP 酶活性, 原生质轻微孤
立, 减少细胞内外物质交流, 降低代谢水平, 液泡内含物增加, 大液泡分隔成许多小液泡
等, 这些都是避免冰冻伤害的适应性变化, 对低温胁迫具有一定的可塑性和缓冲能力, 使
其在逆境下仍能保持活力。该品种有潜在的经低温诱导的生理耐冷特性, 如果苗期进行适
当的低温锻炼, 有望提高品种耐寒力。单瓣品种在0 ! 经 12 h处理已表现伤害反应, 细胞
超微结构受损, ATP 酶变性失活, 细胞内能量水平降低, 生理代谢紊乱, 细胞失去对物质
主动转移的控制, 导致最终死亡。电镜观察结论与田间生长抗寒力表现一致, 与简令成
等7 在不同抗寒性小麦品种的研究结果相同, 也与苏金为等4 采用提取测定法比较这两个
茉莉品种的ATP 酶在低温处理下的稳定性结论吻合。细胞超微结构变化和 ATP 酶活性强
弱与个体耐冷力的相关性, 可作为品种抗寒力鉴定的一个参考指标。
在低温胁迫初期 ( 6 h) 单瓣品种细胞膜结构未出现明显变化, ATP 酶活性已急剧减
弱, ATP 酶活性减弱远早于膜结构破坏。ATP酶活性变化被认为是细胞对低温胁迫的最初
生理反应5 。比较不同细胞器的ATP酶的耐冷力, 两品种表现同样的趋势, 质膜比液泡膜
耐冷, 线粒体脊比叶绿体片层耐冷。冷害对线粒体功能的影响较叶绿体小得多10 , 可以
推断与 ATP 酶耐冷差异有关。许多研究指出细胞边界质膜是植物遭受冷害最敏感部
位7, 9 , 作者却观察到质膜比液泡膜无论是超微结构还是膜上附着的 ATP 酶活性都表现出
对低温的更强的耐受力, 并不存在由表及里的次序。这些现象与其组成结构及在细胞中所
处微环境有关, 也可能与细胞内信息传递和调控系统有密切联系, 有待进一步深入探究。
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546 园 艺 学 报 28卷
Ultracytochemical Localization of ATPase Activity in The Cells of Jas
minum Sambac L. Seedlings and Its Relation to Chilling Tolerance
Su Jinwei1 and Wang Xiangping2
( 1Department of Fundamental Subjects, Fuj ian Agriculture and Forestry University , Fuzhou 350002; 2Centre of Test, Fu
jian Agriculture and Forestry University , Fuzhou 350002)
Abstract: Ultracytochmical localization of ATPase act ivity was carried out using a leading phos
phate precipitation technique in the cells of two different chilling resistance Jasminum sambac L. Ait.
seedlings. Under 0 ! chilling stress, the ultrastructure of cells and the ATPase activity in the chilling
resistant Jasmine ( double petal cultivar) was obviously more stable than that in the chilling sensitive
Jasmine ( single petal cult ivar) . The ATPase in Jasmine seedlings cells of mesophyll mainly located
on plasmolemma, tonoplast , chloroplast lamellae, mitochondria cristae, and plasmodeslma , whereas
the ATPase in cells of minor leaf vein mainly located on the sieve element and the companion cell.
Key words: Jasmine ( Jasminum Sambac L. ) ; Low temperature stress; Ultrastructure; ATPase
图版∃ Plate∃
5476期 苏金为等: 茉莉幼苗 ATP酶活性的超微细胞化学定位与耐冷性研究
图版说明 Ch: 叶绿体, Pm: 质膜, M : 线粒体, Pd: 胞间连丝, V : 液泡, Cc: 伴胞, Se: 筛管, Cl: 叶绿体片层, Mc: 线
粒体脊, T: 液泡膜, Cw: 细胞壁, O: 嗜锇颗粒, Pa: 韧皮薄壁细胞, N : 细胞核.
图版∃ 茉莉幼苗叶肉细胞超微结构 1, 3. 常温下单瓣品种; 2, 7, 8. 低温 6 h单瓣品种; 4, 5, 6. 低温 6 h双瓣品
种; 9, 12. 低温 12 h单瓣品种; 10, 13. 低温 12 h双瓣品种; 14. 低温 24 h单瓣品种; 11, 15. 低温 24 h 双瓣品种。
Explanation of Plates Ch: Chloroplast ; V : Vacuole; M : Mitochondria; Pm: Plasmolemma; Pd: Plasmodesla; Se: Sieve element;
Cc: Companion cell; Cw: Cell wall; Cl : Chloroplast lamellae; N: Nucleus; Mc: Mitochondria cristae; O: Osmiophilic globue; Pa:
Phloem parenchyma; T: Tonoplast.
Plate∃ Ultrastructure in the mesop hyllous cell of Jasmine seedlings 1, 3: The single petal cult ivar grown at the optimum tempera
ture. 2, 7, 8: The single petal cultivar subjected to chill ing treatment for 6 h. 4, 5, 6: The double petal cultivar subjected to chilling
treatment for 6 h. 9, 12: The single petal cult ivar subjected to chilling treatment for 12 h. 10, 13: The double petal cult ivar subjected
to chil ling treatment for 12 h . 14: The single petal cultivar subjected to chilling treatment for 24 h . 11, 15: The double petal cultivar
subjected to chill ing treatment for 24 h .
548 园 艺 学 报 28卷
图版% Plate%
5496期 苏金为等: 茉莉幼苗 ATP酶活性的超微细胞化学定位与耐冷性研究
图版% 茉莉幼苗 ATP酶细胞化学定位 (未经电子染色) 1, 2. 常温下单瓣品种; 3, 4. 常温下双瓣品种; 6. 常
温双瓣品种叶脉小微管束; 7. 空白对照反应切片; 5, 8. 低温处理 6 h 双瓣品种; 9, 10. 低温 6 h 单瓣品种; 11,
12. 低温 12 h双瓣品种; 13. 低温 12 h单瓣品种; 14, 15. 低温 24 h的双瓣品种。
Plate% Ult racytochemical localization of ATP ase act ivity in the cell of Jasmine seedlings ( Sect ion unstained ) 1, 2: The sin
gle petal cult ivar grown at the optimum temperature. 3, 4: The double petal cultivar grown at the optimum temperature. 6: Cells of
minor leaf vein grown at the opt imum temperature. 7: Cells of mesophyll incubated in reactive solut ionw ith NaF andwithout substrate
ATP. 5, 8: The double petal cultivar subjected to chill ing t reatment for 6 h. 9, 10: The single petal cult ivar subjected to chilling tr
eatment for 6 h. 11, 12: The double petal cultivar subjected to chill ing t reatment for 12 h. 13: The single petal cult ivar subjected to
chilling treatment for 12 h. 14, 15: The double petal cultivar subjected to chil ling treatment for 24 h.
550 园 艺 学 报 28卷