全 文 ：第20卷 第4期
Vol.20 No.4
草 地 学 报
ACTA AGRESTIA SINICA
2012年 7月
Jul. 2012
黄花苜蓿和紫花苜蓿分子核型比较
窦全文,雷云霆,王海庆
(中国科学院西北高原生物研究所,青海 西宁 810008)
摘要:黄花苜蓿(MedicagofalcataL.2n=32)是一种重要的野生豆科牧草,由于其突出的抗逆特性,被认为是用来
进行苜蓿改良的优异遗传资源。本研究利用染色体荧光原位杂交技术(FISH),以不同荧光物标记的3种重复序列
(5SrDNA,45SrDNA和C0t-1DNA),对黄花苜蓿和和紫花苜蓿(MedicagosativaL.2n=32)染色体进行了FISH
分析和分子核型比较,以期在染色体水平上揭示二者之间的亲缘关系。结果表明:利用上述重复序列可以较好的
将苜蓿32条染色体区分为16对特征不同的染色体。黄花苜蓿和紫花苜蓿绝大多数染色体FISH杂交特征表现一
致或高度相似性,分子核型无显著区别,因此二者间在遗传上具有高度的相似性。
关键词:黄花苜蓿;紫花苜蓿;分子核型;染色体荧光原位杂交技术
中图分类号:S334;S541.03 文献标识码:A 文章编号:1007-0435(2012)04-0718-06
MolecularKaryotypeComparisonbetweenAlfalfa
MedicagosativaandM.falcata
DOUQuan-wen,LEIYun-ting,WANGHai-qing
(NorthwestPlateauInstituteofBiology,theChineseAcademyofSciences,Xining,QinhaiProvince810008,China)
Abstract:Alfalfa(MedicagosativaL.2n=32)andM.falcataareimportantforageandwildgeneticre-
sourcesforalfalfaimprovement.Molecularkaryotypecomparisonswereconductedusingfluorescenceinsi-
tuhybridization(FISH)todetectgeneticrelationship.Threedifferentrepetitivesequences(5SRdna,45S
rDNAandC0t-1DNA)wereadoptedasFISHprobes.Resultshowedthat32chromosomesofalfalfacould
becharaterizedas16pairswithpobecombinations.FISHpatterncomparisonsofindividualchromosomes
betweenM.sativaandM.falcatarevealedhighsimilarity.Therewerenosignificantkaryotypediffer-
encesbetweenM.sativaandM.falcatainthisstudy.
Keywords:Medicagosativa;M.falcata;Molecualrkaryotype;Fluorescenceinsituhybridization(FISH)
黄花苜蓿(MedicagofalcataL.2n=32)是一
种重要的野生豆科牧草,在我国北方有着广泛的分
布,虽然其产量性能和再生性能较紫花苜蓿(M.sa-
tiva)低,但由于其具有抗旱、抗寒、耐瘠薄等特点,
适合于北方寒旱地区种植推广。同时,黄花苜蓿由
于能够与紫花苜蓿进行杂交结实,产生可育后代,是
紫花苜蓿抗性改良的优异基因资源,国内相关育种
单位已经通过对二者进行人工杂交,选育出了一系
列抗逆性优于紫花苜蓿的杂花苜蓿新品种[1-2]。
尽管黄花苜蓿和紫花苜蓿之间容易自然杂交形
成可育的后代,但对于二者的分类关系一直众说不
一,没有定论。20世纪80年代Quiros等[3]提出了
初紫花苜蓿复合体(M.sativaL.complex)概念,
认为与紫花苜蓿亲缘关系较近的黄花苜蓿、胶质苜
蓿 (M.glurtionsa)、蓝花苜蓿(M.coeruda)、苜蓿
(M.varia)等可以天然杂交形成杂交后代,应该合
并为一个种。国内李拥军等[4]利用种子储藏蛋白标
记分析紫花苜蓿、杂花苜蓿和黄花苜蓿之间的遗传
关系,认为将这3个苜蓿类型划分为M.sativa的3
个变种(M.sativassp.sativa,M.sativassp.varia
和M.sativassp.falcata)较为合理。何咏松等[5]
对包括黄花苜蓿在内的12份苜蓿种质材料进行了
自交不亲和性研究,同意将紫花苜蓿和黄花苜蓿归
为一个种,认为二者属同一个种的2个亚种或生物
型或生态型。孙毅等[6]根据核糖体DNA的ITS序
列分析进行苜蓿属的系统分类学研究,结果提示黄
收稿日期:2011-12-14;修回日期:2012-03-05
基金项目:国家高技术研究发展计划(863计划)项目(2009AA10Z108)资助
作者简介:窦全文(1970-),男,青海湟中县人,博士,副研究员,主要从事植物遗传育种研究,E-mail:douqw@nwipb.cas.cn
第4期 窦全文等:黄花苜蓿和紫花苜蓿分子核型比较
花苜蓿和紫花苜蓿应该列为一种。但是到目前为
止,上述观点尚未被我国学者普遍接受。
核型分析是研究植物物种间和物种内遗传分化
的重要细胞学手段。由于苜蓿的染色体比较小、形
态上比较相似、以及其同源四倍体特性使得苜蓿细
胞学研究落后于其他作物,迄今为止有关这方面仅
有零星的报道。Bauchan等[7]曾通过染色体分带技
术对黄花苜蓿和紫花苜蓿的基因组组成进行了分
析。但染色体分带技术只能揭示异染色质在染色体
上的分布情况,无法确定异染色质组成的成分,因此
不同物种间进行的核型比较,即使一些染色体具有
相似带纹分布,也不能确定它们具有相同的来源。
染色体荧光原位杂交技术(fluorescenceinsituhy-
bridization,FISH)作为一种新型分子细胞学技术,
将分子生物学和传统的细胞遗传学技术相结合,利
用标记的特定重复序列,可以稳定、可靠地进行染色
体的识别,并进行核型分析比较。编码5SRNA和
45SRNA的基因序列在高等植物中普遍以重复序
列形式存在,在不同物种间高度保守性,而且2种基
因位点在同一物种染色体组上的分布和数量上具有
一定的保守性,因此5SDNA和45SDNA被广泛
用来作为物种进化分析的细胞学标记[8-9]。Falis-
tocco[9]对四倍体紫花苜蓿进行5SrDNA 和45S
rDNA的FISH定位研究,揭示紫花苜蓿具有2个
45SrDNA位点4个5SrDNA。而C0t-1DNA是
植物基因组中高度和中度重复序列部分,将其作为
探针对不同近缘物种基因组进行FISH 分析,可以
为基因组进化关系提供新的证据[11]。在本项研究
中,将利用标记的5SrDNA,45rDNA 以及C0t-1
DNA为探针,对黄花苜蓿和紫花苜蓿进行FISH分
析,以期在分子核型水平上揭示二者之间的遗传分
化关系。
1 材料与方法
1.1 材料
紫花苜蓿材料5342和黄花苜蓿材料5339由中
国牧草国家种质资源库提供。将这2种材料种植在
青海西宁地区,在开花期,5342花色为紫色,5339花
色为黄色。质粒pWrrn含有45SrDNA基因片段,
由日本鸟取大学Tsujimoto教授提供。
1.2 方法
1.2.1 染色体制片 不同材料的种子室温下发芽,
根尖长至2cm左右,0~4℃冰水处理24h左右,卡
诺液(无水乙醇∶冰醋酸=3∶1)固定30min以上,
45%醋酸火焰干燥压片,相差显微镜观察,挑选中期
分裂相良好制片冰冻揭片。
1.2.2 探针DNA的制备 5SrDNA以黄花苜蓿
材料5339基因组DNA为模板,按着Fukui等[9]的
方法,由PCR扩增产生。C0t-1DNA 的制备参阅
Zwick等[11]的方法,以黄花苜蓿材料5339基因组
DNA为材料进行。
1.2.3 探针标记 5SrDNA和C0t-1DNA探针以
Flurescein-12-dUTP或 Tetramethy1-rhodamine-5-
dUTP用随机引物法进行标记(AgilentPrimeItⅡ
试剂盒),质粒pWrrn(含45SrDNA)通过缺口平移
法进行标记。
1.2.4 荧光原位杂交 染色体制片在0.2mol·L-1
NaOH溶液室温变性10min后于-20℃无水乙醇
中固定。每张制片杂交液为10μL,其中含有50%
甲酰胺,50%硫酸葡聚糖,1mg鲑鱼精DNA,1μL
20×SSC和10ng的探针 DNA。杂交液在90~
92℃变性5min后,与变性后的制片在37℃杂交20
~24h。杂交后的制片用双蒸水冲洗,利用含DAPI
(4,6-diamidino-2-phenylindole)的抗荧光衰减封片
剂(Vecter)封片,Leica荧光显微镜观察,利用CCD
(Coolsnapper,Photometrics)获取图像,图像后期
利用Photoshop进行处理。
2 结果与分析
2.1 苜蓿分子核型基本特征
为了解5S和45SrDNA黄花苜蓿和紫花苜蓿
染色体上的分布情况,利用不同颜色标记的5S和
45SrDNA 对5339和5342的染色体制片进行
FISH分析。结果表明在黄花苜蓿5339和紫花苜
蓿5342中均表现为4条染色体上有45S杂交信号,
8条染色体上具有5S杂交信号,并且杂交位点分别
位于不同的染色体上(资料未列出)。为了进一步揭
示5S和45S杂交位点所在染色体的特征以及其他
染色体的结构特征,进一步利用 Flurescein-12-
dUTP标记的C0t-1DNA(绿色)和 Tetramethy1-
rhodamine-5-dUTP标记的5S或45SDNA(红色)
为2种探针组合对5339和5342进行FISH 分析,
结果表明标记C0t-1DNA几乎在5339和5342所
有染色体上都具有杂交信号,而5S或45SDNA在
5339和5342染色体上的杂交位点数,与5S和45S
rDNA为探针组合进行的FISH 检测结果一致(图
1-A1,A2,B1,B2)。
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草 地 学 报 第20卷
图1 黄花苜蓿和紫花苜蓿FISH结果及核型分析
Fig.1 FISHpatternsandmolecularkaryotypesofM.sativaandM.falcata
注:A1~B2为黄花苜蓿4339(A1,A2)和紫花苜蓿5342(B1,B2)FISH分析:A1和B1利用5SrDNA(红色)和C0t-1DNA(绿色)探针组合
进行杂交,A2和B2利用45SrDNA(红色)和C0t-1DNA(绿色)探针组合进行杂交 (比例尺为10μm);C为黄花苜蓿和紫花苜蓿分子核型分
析:a1和a2为黄花苜蓿4339,b1和b2为紫花苜蓿5342;a1,a2,b1和b2核型分析分别按着A1,A2,B1和B2的FISH结果进行
Note:A1~B2areFISHpattersofM.falcate4339(A1,A2)andM.Sativa5342(B1,B2):A1andB1weredetectedwith5SrDNA
(red)andC0t-1DNA(green),A2andB2weredetectedwith45SrDNA(red)andC0t-1DNA(green)(bar=10μm).Ciskaryotypesoftetra-
ploidalfafa:a1anda2arekaryotypesofM.falcata4339folowingtheFISHpatternsofA1andA2;b1andb2arekaryotypesofM.Sativa
5342folowingtheFISHpatternsofB1andB2
进一步对2种材料进行核型分析,结果表明
C0t-1DNA在大多数染色体上的分布具有差异性,
结合C0t-1DNA以及45SDNA和5SDNA在染色
体上的杂交信号,绝大多数染色的同源染色体能得
到较清晰的辨别。并根据这些重复序列在染色体上
的不同分布特征,32条染色体可以较清晰地区分为
16对。比较重复序列在黄花苜蓿5339和紫花苜蓿
5342染色体上的分布特征,表明绝大多数染色体具
有相似的分布特征,分子核型特征具有非常高的相
似性。根据特征性重复序列分布,黄花苜蓿和紫花
苜蓿16对染色体可以区分为以下几种类型,长臂上
具有45SDNA杂交信号(1号和2号染色体);短臂
近着丝和近端粒区有C0t-1DNA杂交信号(3~7号
染色体);短臂近着丝C0t-1DNA杂交信号较强和
027
第4期 窦全文等:黄花苜蓿和紫花苜蓿分子核型比较
近端粒区较弱(8号和9号染色体);短臂中间或近
着丝粒区有5SDNA杂交信号(10~12号染色体);
在着丝粒区有明显C0t-1DNA杂交区(13号和14
染色体);长臂近着丝粒和近端粒区有C0t-1DNA
杂交信号(15号染色体);长臂上具有5SDNA杂交
信号(16号染色体)(图1-C)。
2.2 黄花苜蓿和紫花苜蓿分子核型比较
由于黄花苜蓿5339和紫花苜蓿5342分子核型
特征相似,可以进一步对这2种材料的每一对染色
体重复序列分布的相似性和多态性进行比较,具体
结果如表1所示。
表1 黄花苜蓿(Mf)和紫花苜蓿(Ms)FISH特征比较
Table1 FISHfeaturecomparisonsbetweenM.falcate(Mf)andM.sativa(Ms)
染色体号
ChromosomeNo.
材料
Materials
C0t-1DNA
短臂Shortarm
近端粒区
Proximal
中间区
Interstitial
近着丝粒区
Pericentromeric
着丝粒区
Centromeric
长臂 Longarm
近着丝粒区
Pericentromeric
中间区
Interstitial
近端粒区
Proximal
5S
rDNA
45S
rDNA
1
Mf +/- - + - - - - - +(L)
Ms + - + - - - - - +(L)
2
Mf +/- - + - - - - - +(L)
Ms + - + - - - - - +(L)
3
Mf + - + - - - - - -
Ms + - + - - - - - -
4
Mf + - + - - - - - -
Ms + - + - - - - - -
5
Mf + - + - - + - - -
Ms +/- - + - - - - - -
6
Mf + -/+ + - - - - - -
Ms + - + - - - - - -
7
Mf + - + - - - - - -
Ms + - + - - - - - -
8
Mf + - + - - - - - -
Ms - -/+ - + - - - - -
9
Mf +/- +/- +/- + + + +/- -
Ms - - - + - - - -
10
Mf + - + - - - - +(S) -
Ms + - + - - - - +(S) -
11
Mf + - + - - - - +(S) -
Ms + - + - - - - +(S) -
12
Mf - - + + + - - +(C) -
Ms - - + + + - - +(C) -
13
Mf - - + + + -/+ +/- - -
Ms - - + + + - - - -
14
Mf +/- - + + + -/+ - - -
Ms - - + + + - - - -
15
Mf - - - - + - + - -
Ms - - - - + - + - -
16
Mf - - - - + - + +(L) -
Ms - - - - + - + +(L) -
注:Mf和 Ms分别为黄花苜蓿和紫花苜蓿;“+”和“-”分别表示杂交信号存在和缺失;“+/-”表示杂交信号具有存在或缺失的多态性;(L),(S)和(C)表示
杂交信号出现在染色体长臂、短臂或着丝粒区
Note:MfandMsrepresentM.falcataandM.sativa;“+”and“-”indicate“presence”and“absence”oftheFISHsignals;“+/-”indicatesthepolymor-
phismofFISHsignalpresenceorabsence;(L),(S),and(C)representlongarm,shortarm,andcentromericregionofchromosome
1号染色体:黄花苜蓿和紫花苜蓿均在短臂近
着丝粒区和近端粒区具有较强的C0t-1DNA杂交
信号,而在长臂相似的位置上具有45SDNA杂交
位点,同时在黄花苜蓿材料5339个体中观察该号染
色体具有杂合性,相应杂合染色体短臂近端粒C0t-1
DNA杂交信号表现为缺失。
2号染色体:在重复序列分布上与1号染色体
具有相似的分布,但是相对于1号染色体,染色体长
127
草 地 学 报 第20卷
短臂臂比较大。在5339材料中观察到不同个体近
端粒C0t-1DNA杂交信号具有多态性。
3~7号染色体:黄花苜蓿和紫花苜蓿均在短臂
近着丝粒区和近端粒区具有较强的C0t-1DNA杂
交信号,而在长臂上无杂交信号。3~7号这5对染
色体在FISH杂交特征上表现相似,由于苜蓿染色
体比较小,显著对这5对染色体进行区分显得比较
困难,同时也观察到部分染色体处于杂合状态以及
不同个体间染色体多态性,如紫花苜蓿5342的6号
染色体。
8号染色体:黄花苜蓿和紫花苜蓿在此染色体
上FISH杂交特征表现不尽一致,黄花苜蓿5339在
近着丝粒区和近端粒区具有较强的C0t-1DNA杂
交信号,而5342仅在着丝粒区杂交信号较强,同时
在5342不同个体中观察到短臂有C0t-1DNA杂交
信号多态性存在。
9号染色体:C0t-1DNA杂交信号在黄花苜蓿
遍布整个染色体,但同时又在长臂近着丝粒区有较
强杂交信号的多态性染色体存在,并处于杂合状态。
在紫花苜蓿中C0t-1DNA杂交信号主要分布在近
着丝粒区。
10号染色体:FISH杂交特征在黄花苜蓿和紫
花苜蓿表现一致,在短臂近端粒区和近着丝粒区有
较强的C0t-1DNA杂交信号,5SDNA杂交信号分
布处于短臂2个C0t-1DNA杂交信号之间,并偏向
于近着丝粒区。
11号染色体:FISH杂交特征在黄花苜蓿和紫
花苜蓿表现一致,在短臂近端粒区和近着丝粒区有
较强的C0t-1DNA杂交信号,5SDNA杂交信号分
布处于短臂2个C0t-1DNA杂交信号之间。
12号染色体:黄花苜蓿和紫花苜蓿在此染色体
上重复序列分布相似,在近着丝粒区有较强C0t-1
DNA和5SDNA杂交信号,2种重复序列在此区域
重叠分布。
13和14号染色体:黄花苜蓿和紫花苜蓿在近
着丝粒区均有C0t-1DNA杂交信号,但是黄花苜蓿
短臂和长臂具有额外C0t-1DNA杂交信号,并在不
同个体间具有多态性。
15号染色体:FISH杂交特征在黄花苜蓿和紫
花苜蓿表现保守性,二者均在染色体长臂近端粒区
和近着丝粒区有较强的C0t-1DNA杂交信号。
16号染色体:黄花苜蓿和紫花苜蓿具有相同的
重复序列杂交特征,在染色体长臂近端粒区和近着
丝粒区有较强的C0t-1DNA杂交信号,并在2个杂
交信号之间具有一个较强的5SDNA杂交位点。
3 讨论与结论
Falistocco[10]以5SrDNA 和45SrDNA 为探
针,对四倍体紫花苜蓿染色体进行了FISH 定位研
究,发现紫花苜蓿具有2个45SrDNA位点4个5S
rDNA,这些位点分位于不同染色体上,与本研究结
果一致。C0t-1DNA是植物基因组中高度和中度重
复序列部分,在本研究中发现C0t-1DNA分布在绝
大多数染色体短臂的近端粒和近着丝粒区域。染色
体C-带技术可以揭示染色体异染色质组成情况,而
染色体上异染色质部分则为大量高度重复序列所在
区。Bauchan等[12]利用染色体C-带技术对紫花苜
蓿进行了研究,揭示C-带主要显现在绝大多数染色
体短臂的端部、近着丝粒部以及多数染色体短臂的
中部,利用C-带技术揭示的位于短臂上的端带和近
着丝粒带与本研究中C0t-1DNA杂交信号所在区
域有较高的一致性。本研究采用的C0t-1DNA是
多种重复序列的混合物,今后进一步对这些重复序
列中单一序列分离、克隆后,可获得更为稳定、可靠
的染色体标记。
苜蓿被认为是异花授粉的同源四倍体,在本研
究中可以将32条染色体区分为16对染色体,虽然
从整个核型来看具有同源四倍体的起源特征,但是
显然黄花苜蓿和紫花苜蓿已经二倍体化,例如1号
和2号染色体均在染色体长臂上具有45SrDNA的
杂交位点,但从染色体臂比以及C0t-1DNA分布来
看,这2对染色体显然具有明显的遗传分化;同样,
具有5SrDNA杂交位点的10号、11号、12号和16
号染色体,从5SrDNA的分布位置、染色体大小、臂
比、以及C0t-1DNA分布等细胞学特征,可以清晰
地将这4对染色体进行区分。
在本研究中,采用3种不同的DNA重复序列
作为探针,对这些重复序列在黄花苜蓿和紫花苜蓿
染色体上的分布特征进行了比较,结果表明二者的
分子核型具有高度相似性,虽然在某几条染色体上
杂交信号有一定差异,但考虑到苜蓿是一个自交不
亲和的、高度杂合的群体,以及在本研究中已经观察
到同源染色体重复序列分布的多态性,结果表明在
分子核型上黄花苜蓿和紫花苜蓿之间无显著差异,
紫花苜蓿和黄花苜蓿具有高度相似的遗传组成,二
者形态学上的差异,可能由少数基因之间的差异造
成,不足以促成物种分化的形成。但是物种水平之
227
第4期 窦全文等:黄花苜蓿和紫花苜蓿分子核型比较
下该复合体内蕴含有较高的遗传多样性,是进行苜
蓿遗传改良的优良基因资源。
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(责任编辑 吕进英)
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