全 文 ：第 17 卷
第 6 期

Vol. 17
No. 6
草
地
学
报
ACTA AGRESTIA SINICA



2009 年
11 月

Nov.

2009
抗冻蛋白基因 AFP表达载体构建及转化紫花苜蓿初报
郝
凤1 , 刘晓静1* , 毛
娟2, 于铁峰1 ,张德罡1
( 1. 甘肃农业大学, 草业学院 兰州
730070; 2. 甘肃农业大学, 农学院 兰州
730070)
摘要: 以胡萝卜基因组 DNA 为模板, 用 PCR 方法扩增目的基因,连接到 PGEM
T Easy Vecto r 载体上, 经 Xbal

和 Sac
双酶切, 将目的片段连接到 PBI121 工程质粒上,通过农杆菌介导法转化和田苜蓿,为提高紫花苜蓿的抗冻
性奠定基础。结果表明,成功克隆出抗冻蛋白基因 AFP, 并构建成 AFP 植物表达载体。获得了具有卡那霉素抗性
的苜蓿愈伤组织,和田苜蓿愈伤组织的最佳 Kan 筛选浓度为 60 mg/ L。经 PCR技术鉴定, AFP 抗冻蛋白基因已整
合到苜蓿基因组中。
关键词:抗冻蛋白基因 AFP; 载体构建;遗传转化; 紫花苜蓿
中图分类号: Q946



文献标识码: A




文章编号: 1007
0435( 2009) 06
0779
05
Construction of Antifreeze Protein Gene AFP Expression
Vector and Transformation into Alfalfa Callus
HAO Feng
1
, LIU Xiao
jing1* , M AO Juan2 , YU T ie
feng1 , ZHANG De
gang1
( 1. Pratacul tu ral College, Gan su Agricultu ral University, Lan zhou, Gansu Province 730070, China;
2. Col leg e of Agronomy, Gansu Agricu ltural U niver sity, Lanzh ou, Gan su Provin ce 730070, C hina)
Abstract: In or der to enhance the f reezing tolerance of alfalfa, the car rot g enomic DNA was taken as tem

plate, the targ et g ene was amplif ied using PCR method and connected to the PGEM
T Easy V ector vector,
the targ et fragment w as connected to the engineering plasmid PBI121 af ter double digest ion by Xbal
and
Sac
, then alfalfa Het ian w as t ransformed through Ag robacter ium
mediated transformat ion. T he r esults
show that the ant if reeze pr otein gene AFP w as successfully cloned, AFP plant expression vector w as con

st ructed, and the kanamycin
resistant callus of alfalfa w as obtained. The optimal kanamycin selection con

centrat ion of alfalfa Het ian callus w as 60 mg
L- 1 . Based on the identif icat ion by PCR techno logy , AFP
ant ifreeze protein gene w as integrated into the alfalfa g enome.
Key words: Antif reeze pr otein gene AFP; Vector const ruct ion; Genet ic t ransformat ion; Alfalfa


紫花苜蓿(M edicago sat iv a L. ) (以下简称苜
蓿)为暖温带重要牧草,对温度反应敏感。在正常情
况下,最适宜的生长温度为 15~ 25
, 12
以下生
长缓慢, 5
以下生长停止。低温是制约其生长的主
要限制因子,如何提高苜蓿抗寒性对提高其生产力
具有重要意义[ 1] 。
从北极鱼抗冻蛋白( Ant if reeze pro teins, AFP
s)基因( AFP)被克隆以来, 国内外学者 [ 2~ 5] 曾尝试
用转鱼类 AFP 基因的方法来提高作物抗冻性。由
于鱼类和植物在分类学上的关系相差太远, 外源基
因的正确表达有一定困难,研究结果不甚理想。在
此情况下,只得寄希望于植物 AFP 基因的发现和利
用。直到 1998年, W orrall等 [ 6]从胡萝卜中发现第
一个植物 AFP 基因, 并将胡萝卜 AFP 的 cDNA 连
接在表达载体的 CaMV35S 启动子之后导入烟草,
让其组成型表达, 检测含有胡萝卜 AFP 的烟草提取
物时,发现它们可以抑制冰晶生长,这无疑是抗冻基
因工程研究中的一大飞跃。随后, 在 1999年, M ey

er等 [ 7]用农杆菌( A gr obacterium tumef aciens)介导
胡萝卜 AFP 基因重组子转化拟南芥,诱导了一系列
低温调节蛋白的表达, 使未经低温驯化的植株具有
较强的抗寒能力。2001年, 我国学者尹明安 [ 8]又以
胡萝卜品种 Autumn King 的幼苗为材料, 以 PCR
法在体外扩增出胡萝卜抗冻蛋白基因,并构建成胡
收稿日期: 2009
04
09; 修回日期: 2009
07
22
基金项目:甘肃省农牧厅生物技术专项( GNSW
2004
07)
作者简介:郝凤( 1985
) ,女,汉族,黑龙江鹤岗市人,硕士研究生,研究方向为草地资源与生态, E
mail: haofen g1026 @ 163. com; * 通讯作
者 Author for correspondence, E
mail: liuxj@ gsau. edu. cn
草
地
学
报 第 17卷
萝卜 AFP 的植物表达载体 pBAF,并为进一步利用
其转化番茄、甜椒等作物奠定了基础。2002 年 Fan
等[ 9]以胡萝卜幼苗为模板进行 PCR扩增, 克隆到一
个 1099 bp的抗冻蛋白基因, 连上 CaMV35S 启动
子,构建到 pCAMBIA2300载体上后转入烟草, 发
现转基因阳性植株存活的过冷却点下降至- 2
。
迄今为止,还未见有关 AFP 基因转化苜蓿的研究报
道。本试验在于构建 CaMV35S 启动子调控下的
AFP 融合基因表达载体, 并导入苜蓿, 通过 PCR 检
测验证该基因已整合到苜蓿基因组中, 以期获得抗
冻性强的苜蓿新材料。
1
材料与方法
1. 1
供试材料
供试材料胡萝卜品种为黒田五寸参 ( Daucus
car ota L. cv. Heitian w ucunshen)和和田苜蓿(M .
sativa cv. Het ian)。
1. 2
AFP基因的克隆和表达载体的构建
1. 2. 1
研究方法
根据参考文献[ 8]序列, 设计合
成 1对引物 P1和 P2,用于扩增 AFP 基因[ 10~ 14] , 并
依据构建植物表达载体的需要在引物 5
端分别引
入了 Xbal
和 Sac
的酶切位点。
P1: 5

GCT CTAGATCAT GA CT CGAAAAC

ATAAT CCA
3
; P2: 5

GCGAGCT CTGCACT

GCT TGAGCT GCAT A
3

采用 Pfu高保真 DNA 聚合酶从胡萝卜基因组
DNA 中扩增目的基因, 反应程序: 94
, 3 min

( 94
, 30 sec
55
, 30 sec
72
, 1 min) 30

72
, 10 min,循环 30次, 热启动法加酶。采用 TA
克隆方法, 将该基因克隆于 PGEM
T Easy Vector
载体上。连接反应体系为 3
L 纯化后的 PCR产物
+ 2
L10
Ligation Buf fer + 1
L ( 50 mg / L )
PGEM
T Easy Vector + 1
L T4DNA Ligase, 在
16
条件下连接过夜[ 15~ 17]。挑取阳性克隆鉴
定[ 18, 19]。
将 AFP 基因片段连接到 PBI121载体上, 连接
反应体系为 AFP DNA 5
L+ pBI121 2
L+ 10

Buffer 5
L+ T 4 Ligase 1
L, 16
连接 22 h [ 20~ 24] ,
构建植物表达载体 P
T
AFP(图 1)。
1. 2. 2
农杆菌的转化
采用直接转化法,参照文献
[ 25, 26]略有改动。挑取农杆菌 EHA105单克隆菌
落,接种于 6 mLYEP 培养基中, 培养基含链霉素
( St r) 50 mg / L+ 利福平( Rif ) 25 mg/ L, 28
下, 200
r/ min振荡培养 24 h, OD 600约 0. 3。吸取菌液转入
2 mL 离心管中, 常温 5000 r/ min离心 5 min,吸弃
上清, 菌体用 1 mL 0. 02 mol/ LCaCl2 悬浮, 5000
r/ min离心5 min,重复2次。用 200
L 0. 02 mo l/ L
CaCl2 悬浮。转化管加入表达载体 DNA10
L, 混
匀。冰浴 30 min, - 70
速冻 10 m in, 37
融化。
加入800
LYEP 培养基, 28
下, 200 r/ min振荡培
养 6 h。涂平板( YEP+ Str50mg/ L + Rif 25 mg / L
+ Kan100 mg/ L ) , 28
培养, PCR鉴定转化菌。
1. 2. 3
苜蓿遗传转化
苜蓿种子用无菌水浸泡,酒
精和升汞消毒后在含 3%蔗糖的 MS固体培养基上
无菌培养。切下 7 d 龄子叶, 在愈伤培养基 MS1
( M S+ 2 mg/ L2, 4
D+ 0. 3 mg/ L KT )上预培养 3
d,在活化的农杆菌 EHA105( P
T
AFP+ EHA 105)
菌液中浸染 10 min, 在 MS1 培养基上和黑暗条件下
共培养 3 d, 然后转入筛选培养基 MS2 ( MS1 + 60
mg/ LKan+ 400 mg / LCarb)中筛选抗性愈伤组织,
且每 2周更换 1 次培养基[ 27~ 34] 。选取生长状态良
好的愈伤组织进行 PCR鉴定。
图 1
载体 P
T
AFP 物理图谱
F ig . 1
Map of P
T
AFP
Ori V:是在营养时期,即游离在细胞质中独立复制时的复制起点
Starting point of independent reproduce during nourishment periods; Col
E1 ori:大肠杆菌质粒复制起始点 Start ing point of plasmid reproduce of
Escherichia coli; NOS: 胭脂碱合酶基因启动子 Promoter of nopaline
synthet ic enzyme gene; npt

: Kan 抗性基因 Kanamycin e resistant
gen e; NOS
t er:胭脂碱合酶基因终止子 T erminator of n opalin e syn

thet ic enzyme gene; CaMV35S :花椰菜病毒启动子 Promoter of cau

lif low er virus; AFP:抗冻蛋白基因 Ant if reeze p rotein gene
2
结果与分析
2. 1
AFP基因克隆的鉴定
以 P1、P2为引物, 胡萝卜基因组 DNA 作模板
进行 PCR扩增,得到约 1200 bp的特异性扩增带,
与预期结果相符(图 2)。将片段回收纯化后, 插入
到 PGEM
T Easy Vector 载体上,得到重组质粒 T

AFP,分别挑取蓝白斑进行电泳检测。白斑用 Xbal

和 Sac
双酶切,结果表明, T 载体上所插入的片
780
第 6期 郝凤等:抗冻蛋白基因 AFP表达载体构建及转化紫花苜蓿初报
段大小与 PCR产物相同,测序结果显示与拟克隆区
段的 AFP 基因序列完全一致。这证明 PCR目的片
段已克隆至 T 载体上。
图 2
T
AFP 载体鉴定
Fig. 2
Detection o f T
AFP
M: 分子量标记; 1: 蓝斑 DNA; 2:白斑 DNA; 3: PCR扩增产物;
4: Xbal
, Sac
双酶切产物; M : Marker; 1: DN A of locus
ceruleus; 2: DNA of leuk oplak ia; 3: PCR p rodu ct ;
4: Xbal
and Sac
digest ion pr odu ct
2. 2
植物表达载体 P
T
AFP鉴定
构建的载体 P
T
AFP 大小与期望一致, 经 PCR
扩增,得到1200 bp的片段;经Xbal
和Sac
双酶切产
生预期片段,表明该表达载体构建正确(图3)。
图 3
P
T
AFP 载体鉴定
Fig . 3
Detection o f P
T
AFP
M: 分子量标记; 1: Xbal
, S ac
双酶切产物; 2: PCR扩增产物;
M : Marker; 1: Xbal
and Sac
digestion product ; 2: PCR product
2. 3
农杆菌的转化
用重组质粒P
T
AFP DNA转化感受态农杆菌
EHA105,在直径 9 cm 的筛选培养基 ( YEB+
Str 50mg/ L+ Rif 25 mg/ L+ Kan 100 mg/ L )上获
得转化菌落 19个,对照组(非转化组)无菌落形成。
随机挑取 4个菌落进行 PCR鉴定,结果显示 4 个菌
落均为阳性重组质粒(图 4)。
图 4
P
T
AFP 导入农杆菌的 PCR检测
Fig. 4
PCR analysis of P
T
AFP transferred A . tumef aciens
M : 分子量标记; 1, 2, 3, 4: 重组农杆菌的 PCR;M : Mark er;
1, 2, 3, 4: PCR of the recombined A . tume f aci ens
2. 4
苜蓿转基因抗性愈伤的获得
从表 1 可知, 随 Kan 浓度的增高, 愈伤组织诱
导率下降,当 Kan浓度
70 mg/ L 时, 愈伤组织诱
导率为 0, 所有生理状态的外植体生长均受到抑制,
最后全部死亡。因此, 本试验中采用 60 mg / LKan
浓度作为筛选时的临界值。而真正带有抗性基因的
转化子在 60 mg/ L Kan 的选择压条件下不仅能够
生长,而且也能忍耐 100 mg/ L 的较高浓度 Kan选
择压(图 5)。
2. 5
转基因苜蓿愈伤的 PCR鉴定
选取生长状态良好的转 EHA105( P
T
AFP)卡
那霉素抗性愈伤组织 6 个, 提取苜蓿总 DNA,以质
粒 P
T
AFP 作阳性对照,以非转基因植株作为阴性
对照,进行 PCR扩增。结果表明,转基因的植株经
PCR扩增,在约 1200bp处出现特征带,在非转基因
植株对照的泳道上没有该特征带, 初步证明目的基
因已经整合到和田苜蓿基因组中(图 6)。
表 1
卡那霉素浓度对愈伤率的影响
Table 1
Effect o f Kan on the ca llus induction
Kan浓度 m g
L- 1 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
外植体数 Ex plan t no. 60 60 60 60 60 60 60 60 60 60
愈伤数 Callu s n o. 35 33 30 27 22 10 0 0 0 0
愈伤率% Callu s rate 58. 33 55 50 45 36. 67 16. 67 0 0 0 0
781
草
地
学
报 第 17卷
3
讨论
3. 1
胡萝卜表达载体构建策略
在构建载体 P
T
AFP 过程中,所用的植物表达
载体为 PBI121。PBI121是一个常用的植物表达载
体,有优点,也有不足, 如多克隆位点仅有 3个酶切
位点( Xbal
、BamH
、Sma
) ,选择余地过小, 给
连接目的基因造成一定困难。为克服此问题, 尹明
安等[ 23] 在 AFP 植物表达载体构建的研究中, 对目
的片段克隆到 T 载体后,分别用酶 EcoR
和 Xbal

进行消化,再用 DNA 聚合酶补平末端,进行定向
连接, 认为这样便于组织化学检验。由于本试验只
需做后期表达情况检测, 采用置换 GUS 基因的办
法来解决这一问题( GU S基因下游有一 Sac
酶切
位点可利用) ,利用 Xbal
和 Sac
2个酶切位点。
证明如不需组织化学检验,该技术路线更加简单快
捷,行之有效。本试验用同源克隆的方法,以胡萝卜
基因组 DNA 为模板,克隆了抗冻蛋白基因 AFP,其
全长 1200 bP, 并且转化大肠杆菌 E. col i, 与 Wor

rall等[ 6]、尹明安[ 8]、Fan等[ 9] 结果一致。
3. 2
关于农杆菌直接转化法及其鉴定
一般转化农杆菌的方法有 2种:三亲交配法和
直接转化法。王关林等 [ 35] 表明三亲交配法操作繁
琐,花费时间较长, 工作量大,所以应用不广泛。本
试验采用直接转化法, 获得 19 个转化克隆,实际应
用的克隆只有 1个。因此,没有必要一味追求高转
化率,在转化率能满足试验需要的前提下,转化方法
越简捷越好。
3. 3
农杆菌对转化率的影响
在利用农杆菌介导法对苜蓿愈伤组织侵染的过
程中, 本试验采用的农杆菌菌株为 EHA105。
M ireille 等[ 36] 研究表明由于不同的农杆菌菌株对特
定植物品种的亲和力不同, 致使转化率差别很大,并
在大多数植物种中得到证实,在苜蓿转化中现象也
很明显。对苜蓿转化而言, Chabaud[ 37] 等认为 EHA105
优于其他菌种, 而用 M. variad的小叶做外植体进行
转化时, A281优于 LBA4404。本试验也得出一致
的结果,在挑取的 6个抗性愈伤中就有 1个是阳性,
说明 EHA105对苜蓿转化很有效。但王国良[ 38]用
LBA4404转化苜蓿也得到了转基因植株。为了提高
转化效率,今后的研究中可尝试不同类型的菌株,筛
选出对和田紫花苜蓿最为有效的菌株。
3. 4
抗生素对愈伤组织诱导的影响
不同种类和浓度的抗生素对愈伤组织的生长均
产生不同影响,最常用的抗生素为 Carb 和 Cef。这
2种抗生素对苜蓿愈伤组织的研究中,刘晓颖[ 39] 研
究表明在脱菌培养中用 Carb 200 mg / L 既能抑制农
杆菌又对愈伤组织伤害较小, 能达到最佳效果。余
密密[ 40]研究表明 Cef 对胚性愈伤组织的诱导影响
不大,结合抗菌素筛选试验的结果, Cef的最低抑菌
浓度为 400 mg / L ,在侵染转化中, 最佳选择为 Cef
400 mg/ L。本试验通过观察发现, 高浓度抗生素,
虽然能较好地抑制农杆菌的污染, 但亦对愈伤组织
生长不利,浓度越高,愈伤组织的生长越差,并且会
影响到后来的体细胞胚的发育成苗。因此,在能保
证完全抑制农杆菌污染的情况下, 抗生素的浓度应
尽量低。在总结前人工作的基础上, 本研究摸索出,
782
第 6期 郝凤等:抗冻蛋白基因 AFP表达载体构建及转化紫花苜蓿初报
子叶外植体共培后转到筛选培养基上时, 初筛的抗
生素 Carb浓度为 400 mg/ L , 在以后的继代中逐次
减少抗生素用量至 100 mg/ L ,收到较好的效果。
4
结论
以胡萝卜基因组 DNA 为模板, 通过 PCR 方
法,成功地克隆了全长 1200 bp 的抗冻蛋白基因
AFP,这对认识和利用胡萝卜抗冻蛋白及其基因资
源具有积极意义。通过双酶切,将其连接到 PBI121
工程质粒上, 成功地构建了植物表达载体 P
T

AFP,该载体完整地保留了选择标记基因,并通过直
接转化法将其导入农杆菌 EHA105 中, 构成双元表
达系统,为利用 P
T
AFP 进行直接转化和利用农杆
菌介导转化提供了物质基础。建立了和田苜蓿的遗
传转化体系,通过叶盘法转化苜蓿,经 PCR检测, 初
步证明胡萝卜 AFP 基因已导入和田苜蓿基因组, 为
进一步研究抗冻蛋白基因的功能奠定了基础。
参考文献
[ 1]
刘艳芝,王玉民,刘莉,等. Bar 基因转化草原 1号苜蓿的研究
[ J ] . 草地学报, 2004, 12( 4) . 274
280
[ 2]
黄永芬,汪清胤,付桂荣,等. 美洲拟鲽抗冻蛋白基因 ( afp )导
入番茄的研究[ J] .生物化学杂志, 1997, 13( 4) : 418
422
[ 3]
Georges F, Saleem M, Cut ler A J. Des ign and cloning of a
s ynthesis gene for th e f loun der ant if reeze protein and its ex

press oin in plant cel ls [ J] . Gene, 1990, 91( 2) : 159
165
[ 4]
H ightow er R, Cathy B, Ranela D. Ex pres soin of ant ifreez e
p roteins int rans genic plants [ J ] . Plant Molecular Biology,
1991, 17( 5) : 1013
1021
[ 5]
Wallis J G, Wang H , Guerra D J, et al . Ex pres sion of a syn

thet ic ant if reeze protein in potato redu ces electr olyte releas e at
f reezin g tem peratures [ J ] . Plant M olecular Boilogy, 1997, 35
( 3) : 323
330
[ 6]
Worrall D, Elias L, Ash ford D, et al . A carrot leucin e
rich

r epeat protein that inhibit s ice recrystalliz at ion [ J ] . Science,
1998, 282( 2) : 11
13
[ 7]
M eyer K, et al . A leucine
rich
repeat p rotein of carrot that ex

hibit s ant if reeze act ivity [ J] . FEBS Let ters, 1999, 447: 171

178
[ 8]
尹明安. 胡萝卜抗冻蛋白基因克隆及植物表达载体构建[ J] .
西北农林科技大学学报(自然科学版) , 2001, 29( l) : 6
10
[ 9]
Fan Y, Liu B, Wang H, e t al . Clonin g of an ant if reeze protein
gene f rom carrot and it s influen ce on cold tolerance in t ran s

genic tob acco plants [ J] . Plant Cell Rep. , 2002, 21: 296
301
[ 10 ] Rosen th al A, Win istorfer S C. PCR amplif icat ion techniques
for chromosom e w alking. Tr ends Biotechn ol . , 1992, 10( 1) :
44
48
[ 11] Pang K M, Knecht D A. Part ial in vers e PCR: A techniqu e for
cloning flank ing sequences [ J] . Biotechniques, 1997, 23 ( 6) :
1046
1048
[ 12] 李鹏,刘文忠,栗艳. 三种获取目的基因的 PCR方法[ J] .乳业
科学与技术, 2008, 4: 195
198
[ 13] S aik i R K, Gelfand D H , S tof fel S, et al . Primer
directed en

zym at ic amplif icat ion of DNA w ith a thermostable DNA poly

m erase [ J] . Science, 1988, 239: 487
491
[ 14] 翟中会,陈希南,王娟. 利用 Prim erPremier5. 0进行引物设计
[ J ] .西北医学教育. 2008, 16( 4) : 695
698
[ 15] 张金文,熊春蓉,李静雯,等. 臭鼻杆菌腈水解酶基因 ( bxn )的
克隆及其在原核生物中的表达 [ J ] . 草业学报, 2006, 15( 6 ) :
87
92
[ 16] 段红英,丁笑生.拟南芥DREB2A 基因的克隆及植物荧光表达
载体的构建[ J] .华北农学报. 2008, 23( 3) : 20
22
[ 17] Akiyama T , Pil laiM A, Sen tokuN. Cloning, characterization
an d expression of OsG LN 2, a rice end o
1, 3


glucanase g ene
regu lated developm entally in flow ers and hormonally in germi

nat ing seeds [ J ] . Planta, 2004, 220: 129
139
[ 18] 萨姆布鲁克 D, W . 拉塞尔(黄培堂,王嘉玺等译) .分子克隆实
验指南(第三版) [ M ] .北京:科学出版社, 2002, 1
[ 19] 萨姆布鲁克 J, 弗里奇 E F, 曼尼阿蒂斯 T . 金冬雁,黎孟枫等
译. 分子克隆实验指南 [ M ] . 第 2 版. 北京: 科学出版社,
1992. 19
22, 55
56
[ 20] 靳敏峰,侯喜林. 青花菜

1, 3
葡聚糖酶基因的克隆、表达分
析及其植物表达载体的构建[ J ] .南京农业大学学报. 2008, 31
( 2) : 27
31
[ 21] Reyes J C, Pastor M I, Florencio F J. T he GATA family of
t ran script ion factors in Arabidopsis and rice [ J] . Plant Physi

ol. , 2004, 134( 4) : 1718
1732
[ 22] 朱亚兰,姚伟,窦建华,等. 种子特异表达启动子的克隆分析及
其植物表达载体的构建[ J] .华北农学报. 2007, 22( 2) : 6
10
[ 23] Luo W X. Const ruet ion and applicat ion of an Esche ri chia coli
high ef fective expression vector with an enhancer [ J] . Chinese
Journ al of Biotechnology, 2000, 16( 5) : 578
581
[ 24] Vogel J T , Zark a D G, Van Buskirk H A, e t al . Roles of the
CBF2 and ZAT 12 t ran script ion factors in configu ring the low
tem peratu re t ranscriptom e of Arabidopsi s [ J ] . Plant J . ,
2005, 41: 200
[ 25] 傅荣昭,孙勇如,贾士荣. 植物遗传转化技术手册[ M ] . 北京:
中国科学技出版社, 1994, 88
89
[ 26] 刘进远,吴庆余译. 植物分子生物学试验指南[ M ] . 北京:科学
出版社, 2000, 34
35
[ 27] 王玉祥,王涛,张博. 转 rstB基因苜蓿耐盐性初评(简报) [ J ] .
草地学报, 2008, 16( 5) : 539
541
[ 28] 于娜,董宽虎. 白羊草成熟胚组织培养及植株再生体系的建立
[ J] .草地学报, 2008, 16( 5) : 466
469
[ 29] 马晖玲,卢欣石,曹致中,等. 紫花苜蓿基因转化的影响因素分
析[ J] . 草业学报, 2006, 15( 5) : 94
102
[ 30] 刘小琳,康俊梅, 孙彦,等. M sNHX1 基因转化紫花苜蓿及转
基因植株的鉴定[ J] .草地学报, 2008, 16( 2) : 115
119
[ 31] 杨成民,王宏芝,孙振元, 等. 利用基因枪共转化法获得转 bar
与P 5CS 基因黑麦草[ J] . 草地学报, 2005, 13( 1) . 35
38
[ 32] 李聪,熊德邵,耿华株. 苜蓿愈伤组织再生植株的研究[ J ] . 中
国草地, 1989, 6( 6) : 51
56
[ 33] 徐春波,米富贵,王勇.转基因冰草植株耐盐性研究[ J] .草地学
报, 2006, 14( 3) : 20
23
[ 34] 刘小琳,王继峰,胡晓艳,等. 根癌农杆菌介导的紫花苜蓿遗传
转化体系的建立与优化 [ J ] . 中国草地学报, 2007, 29( 2 ) :
102
106
[ 35] 王关林,方宏绮.植物基因工程 [ M ] . 北京:科学出版社, 2002,
21
24
[ 36] Chab aud M, Larsonneau C, Marmouget C, et al . T ran sfor

mation of barrel m edic ( Med icag o t runcatula Gaertn. ) b y
A gr obact erium tumef aciens and regenerat ion via s om at ic em

bryogen esis of t ransg enic plan ts w ith the MtENOD12 nodulin
promoter fused to the gus repoter gene. Plan t Cel l Report s ,
1996, 15: 305
310
[ 37] Chabau d M, Pas siatore J E , Cannon F, et al . Parameters af

fect ing the fr equency of kanamycin resi stant alfal fa obtained b y
A gr obact erium tume f aci ens mediated t ran sfor mat ion [ J ] .
Plan t Cell Report s, 1988, 7: 512
516
[ 38] 王国良.农杆菌介导的紫花苜蓿 BADH 基因高效转化体系的
优化和转基因植株的检测 [ D] : [ 学位论文] . 甘肃: 肃农业大
学, 2004
[ 39] 刘晓颖.农杆菌介导的玉米醇溶蛋白基因转化紫花苜蓿的研究
[ D] : [学位论文] .新疆:新疆大学, 2007
[ 40] 余密密.农杆菌介导的果聚糖合成酶基因转化紫花苜蓿影响因
素的研究[ D] : [学位论文] .北京:北京林业大学, 2006
(责任编辑
李
扬)
783