全 文 ：第 19 卷 第 1 期
Vol. 19 No. 1
草 地 学 报
ACTA AGRESTIA SINICA
2011 年 1 月
Jan. 2011
紫花苜蓿 GDP解离抑制蛋白基因 cDNA
的克隆、分析及烟草转化
乌艳红1, 2 , 米福贵1* , 李志明2 , 栾守泉2 , 陈玲玲2 , 娜日苏2, 粱庆伟2
( 1. 内蒙古农业大学, 呼和浩特 010019; 2. 赤峰市农牧科学研究院, 赤峰 024031)
摘要: 采用 RTPCR方法,克隆得到紫花苜蓿( Med icago sativa L. ) GDP解离抑制蛋白基因 cDNA 核心区域序列,
命名为 MsGDI1。序列分析结果表明,该 cDNA 核心区域全长 1575 bp, 包含一个 1332 bp 的最大开放阅读框, 编码
444 个氨基酸。半定量 RTPCR 分析结果表明,在盐胁迫和铝胁迫条件下 ,MsGDI1 基因的表达随着胁迫时间的增
加而上升,该基因可能与紫花苜蓿抗盐耐铝机理有关。借助于新构建的该基因超表达载体, 用农杆菌介导方法转
化烟草(N icotiana tabacum L . )。转基因烟草植株 PCR检测的结果表明, MsGDI1 基因已经成功插入到烟草基因
组中,为进一步研究该基因的功能奠定了基础。
关键词:紫花苜蓿; MsGDI1( GDP 解离抑制蛋白基因) ; RTPCR;表达分析; 超表达载体构建; 烟草转化
中图分类号: Q756 文献标识码: A 文章编号: 10070435( 2011) 01015708
Cloning and Characterization of a GDP Dissociation Inhibitor Protein
Gene fromMedicago sativa L. and Expression in Tobacco
WU Yanhong1, 2 , M I Fugui1* , L I Zhiming 2 , LU AN Shouquan2 ,
CHEN Lingling 2 , NR Risu2 , L IANG Qingwei2
( 1. Inner Mongolia Agricul tu ral Un iversity, H uhhot , Inn er Mongolia Au ton om ou s Region 010019, China;
2. Chifeng Academy of Agricultu ral and An imal H usb andry, Chifen , Inner Mongolia Autonomous Region 024031, C hina)
Abstract: A cDNA core region of alfalfa GDP dissociat ion inhibitor protein Gene named M sGDI1 w as isola
ted by RTPCR. Sequence analysis reveals that the full length of the core region is 1575 bp and contains
1332 bp open reading frame ( 444 amino acids) . Semiquantitat iv e RTPCR analysis show that the expres
sion level o f M sGDI1 increases signif icant ly w ith salt o r Aluminum st ress increasing. T his result indi
cates that M sGDI1 may play an impor tant r ole in both salt and Aluminum tolerances of M edicago sat iva
L. . T he MsGDI1 gene is int roduced into tobacco by A gr obacterium mediated t ransfo rmat ion system using
overexpression vector. PCR analy ses show that t ransgenic tobacco s contain the MsGDI1 gene. The func
t ion o f MsGDI1 gene w ill be further studied.
Key words: Medicago sativa L. ; GDP disso ciation inhibitor pro tein gene; RTPCR; Expression analy sis;
Over expr ession vecto r const ruct ion; Tobacco t ransformation
紫花苜蓿(M edicago sativa L. )作为一种优质
的豆科牧草,长期以来一直被广泛用于奶牛及各种
家畜养殖中。许多研究表明, 在奶牛日粮中添加苜
蓿干草可显著提高奶牛的产奶量, 降低饲养成本, 获
得更大的经济效益[ 1~ 5] 。
我国苜蓿的主产区主要集中于北方地区, 但近
年来南方许多地区,如黄淮海地区的滩涂荒地也开
始推广紫花苜蓿 [ 6]。这些地方的土壤多偏酸性, 土
壤中铝离子含量高达 10~ 100 mo l L - 1 , 严重地
影响着苜蓿的大面积推广利用。以往的研究表明,
通过基因工程手段改造现有植物使其达到育种目标
是可行的捷径。目前, 通过基因工程手段提高苜蓿
抗盐性和耐铝毒能力已有报道。2000 年 Winicov
等[ 7 ]将 Alf inl基因导入苜蓿中, 使其耐盐性得到提
高,生长速度加快。2001年 Tesfaye 等[ 8] 在苜蓿中
转化了超表达苹果酸脱氢酶( MDH )基因后, 使得
苜蓿对酸性土壤和高铝土壤的抗性提高。Samac[ 9]
研究表明, 增大根瘤的苹果酸脱氢酶( neMDH )基
收稿日期: 20101110;修回日期: 20101207
基金项目:现代农业产业技术体系建设专项资金资助
作者简介:乌艳红( 1967 ) ,女,蒙古族,内蒙古赤峰市人,博士研究生,研究员,主要从事牧草及帚用高粱种质资源研究与新品种选育研究,
Email: xuyanw uyanhong@ sin a. com; * 通讯作者 Auth or for correspon dence, Em ail: m fgui@ yahoo. com. cn
草 地 学 报 第 19卷
因和磷酸烯醇丙酮酸羧化酶( nePEPc )基因的表达
可提高转基因苜蓿对铝毒的耐受性;罗小英等[ 10] 研
究结果也表明超量表达 neMDH 基因可提高转基因
苜蓿对铝毒的耐受性; 柠檬酸与植物对铝毒的耐受
性相关, 张丽[ 11] 将烟草 ( N icotiana tabacum L. )柠
檬酸合成酶基因导入紫花苜蓿, 靳苗苗等 [ 12]将紫花
苜蓿柠檬酸合成酶导入烟草都获得了转基因苗, 转
基因植株对铝胁迫的抗性是否有提高还未见报道。
植物体内的 GDP 解离抑制蛋白基因与多种非
生物胁迫相关。Ezaki等[ 13~ 15] 将烟草 GDI1基因转
入拟南芥和酵母中发现可提高两者对盐胁迫和铝胁
迫的耐受性。汤华等 [ 16]建立的玉米( Zea may s L. )
铝胁迫抑制消减杂交文库筛选获得了玉米 GDP 解
离抑制蛋白基因的 EST 序列,发现在铝敏感和耐铝
材料中, GDI1基因的表达特点有明显的时空差异。
紫花苜蓿中 GDI1基因的序列及功能尚未见报
道,本研究以拟南芥( Ar abidop si s thal iana L. ) A t
GDI1基因编码的蛋白序列为探针, 在 NCBI 中比对
找到了截形苜蓿(M edicago t runcatula) MtGDI1的
cDNA 及蛋白序列,根据截形苜蓿中的序列设计引
物,克隆得到紫花苜蓿中包含编码区的 GDP 解离抑
制蛋白基因 cDNA 的核心区域, 并进行了生物信息
学分析, 半定量 RTPCR 分析以及转基因研究, 为
培育抗盐耐铝紫花苜蓿品种提供可行的途径。
1 试验材料与方法
1. 1 试验材料
1. 1. 1 植物材料 紫花苜蓿品种为敖汉苜蓿,由赤
峰市农科院草原研究所保存并提供。选取干净饱满
的种子用清水浸泡 24 h,播种于营养土和蛭石( 1
3)混合基质中,光照( 3000 lx ) 16 h,黑暗8 h, 相对湿
度 75% , 25 培养, 生长 2 周后进行处理。本生烟
草( N icotiana benthamian)亦由该研究所提供,种子
经75%酒精消毒 10 min后用 0. 1%升汞( HgCl2 )处
理 8 min,无菌水洗 3~ 5次后用灭菌滤纸吸干残留
水分,接种于 1/ 2MS 培养基上, 28 培养。
1. 1. 2 试剂、菌株和载体 TaqDNA 聚合酶, 凝胶
回收试剂盒,感受态菌株, T rizol试剂, DNA marker
购自全式金生物公司;克隆载体 PMD19T , T 4DNA
连接酶, 限制性内切酶, MMLV 反转录酶购自
TAKARA公司; 植物表达载体 PBI121 和农杆菌
LBA4404由研究所保存; 其他常用试剂为进口分装
或国产分析纯。
1. 2 方法
1. 2. 1 总 RNA 提取及反转录 取生长 2周的敖
汉苜蓿幼苗全株, 按照 T rizol 试剂说明书提取总
RNA,提取的总 RNA 在 1%的琼脂糖凝胶上电泳
检测。以提取的总 RNA 为模板, 参照 MMLV 反
转录酶说明书进行反转录获得 cDNA第一链。
1. 2. 2 cDNA 核心区域的 PCR 扩增 以 Gene
bank 中登录的拟南芥 A tGDI1 基因编码蛋白
( Genebank登录号: NP_001078054)为探针, 比对得
到截形苜蓿 GDP 抑制解离蛋白基因(M tGDI1)和
蛋 白 序 列 ( Genebank 登 录 号: AJ618983;
CAF02075) ,根据比对得到的序列设计引物 P1 和
P2(表 1) ,以反转录得到的 cDNA 第一链为模板进
行 RTPCR扩增,反应体系为: H 2O 34. 5 L、buf f
er 5 L、dNT P 4 L、P1和 P2各 2 L、Taq DNA
聚合酶 0. 5 L、模板 2 L, 反应程序为: 94 预变性
3 min, 94 变性 30 s, 60~ 58 退火 30 s, 72 延伸
90 min, 30个循环后, 72 延伸5 m in。PCR产物经
1%琼脂糖凝胶电泳检测后,目的片段用凝胶回收试
剂盒回收,回收产物与克隆载体 PMD 19T 连接,连
接产物转化大肠杆菌感受态菌株 DH 5, 在含有氨
苄青霉素的 LB 平板过夜培养后挑取单菌落, 进行
PCR扩增检测, 阳性菌落送华大基因公司测序, 测
序正确的重组质粒命名为 PMDMsGDI1。
1. 2. 3 生物信息学分析 开放阅读框查找由 NCBI
上的 ORF finder 软件完成。目的基因编码蛋白的
等电点和分子量预测运用瑞士生物信息学研究所网
站的 Compute pI/ M w 软件( ht tp: / / www . expasy.
or g/ too ls/ pi_tool. html)进行,疏水性轮廓和二级结
构用 DNAMAN软件预测,编码蛋白的保守结构域
用 NCBI 上的 conser ved domains 软件 ( ht tp: / /
www. ncbi. nlm. nih. gov/ St ructure/ cdd/ wrpsb. cgi)预
测,亚细胞定位预测用 ProtComp Version 9. 0( ht
tp: / / linux1. softberry. com/ berry. phtml)软件预测。
在 Genebank中查找到其他17个物种的 GDP 抑制蛋
白的氨基酸序列, 应用进化树构建软件 MEGA 4. 1,
采用邻接法[ 17]构建进化树。
1. 2. 4 MsGDI1基因的表达分析 选取干净饱满
的敖汉苜蓿种子, 用清水浸泡 24 h, 播种于营养土
和蛭石( 1 3)混合基质中, 生长 10 d后部分幼苗分
别提取根, 茎, 叶中的 RNA, 剩余幼苗分别用 300
mM NaCl溶液和 50 mol L - 1 AlCl3 溶液处理 0
h, 0. 5 h, 1 h, 3 h, 6 h 和9 h后提取各处理的 RNA,
反转录获得 cDNA 第一链, 根据测序获得的 cDNA
序列设计引物 P3 和 P4(表 1) , 以紫花苜蓿 UBQ5
基因作为内参基因, 其引物为 P5和 P6(表 1) , 对
M sGD I1基因进行表达分析。
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第 1期 乌艳红等:紫花苜蓿GDP解离抑制蛋白基因 cDNA 的克隆、分析及烟草转化
表 1 实验中用到的引物序列
Table 1 Sequence of pr imers used in the experiment
引物名称
Primers name
引物序列
Primers
P1 AACCCCCT TT CGATT GTGAT TT CCG
P2 T TACGCACAAGCGAGCAT CT GGAGG
P3 CCAACACCAAT GACTCCCAAT
P4 ATCGGCAACACAT AACAAACAC
P5 GCAGCAACCAACGAAGCAAGA
P6 CACCACGAAGACGT AGGACAAGG
P7 GGAT CCAT GGAT GAAGAGT ACGAT GT(下划线部分为酶切位点 BamH )
P8 GAGCT CCT CTT CT GCAGCACT GGCG(下划线部分为酶切位点 Sac )
1. 2. 5 植物表达载体 PBI121MsGDI1 构建 根
据已知目的基因序列设计一对引物 P7 和 P8 (表
1) ,以重组质粒 PMDM sGDI1为模板, 扩增带有酶
切位点 BamH 和 S ac 的 M sGDI1基因编码区,
反应程序为 94 预变性 3 m in, 94 变性 30 s, 57
退火 30 s, 72 延伸 90 m in, 30个循环后, 72 延伸
5 m in, PCR产物连接转化后测序鉴定。测序结果
正确的单克隆摇菌提质粒, 重组质粒与 PBI121 质
粒用 BamH 和 Sac 酶切后回收重组质粒的小片
段和 PBI121大片段, 2个片段用 T4连接酶 16 连
接 6 h,连接产物转化大肠杆菌感受态菌株 DH 5,
在含有卡那霉素的 LB培养基上倒置过夜培养, 挑
取单菌落摇菌提质粒, BamH 和 S ac 双酶切检
测阳性克隆。
1. 2. 6 烟草转化 运用 CaCl2 冻融法将含有目的
基因的植物表达载体质粒导入农杆菌 LBA4404中,
然后通过叶盘法转化烟草,经过抗生素筛选, 获得具
有抗性的再生植株。
1. 2. 7 转基因烟草检测 采用 CTAB 法提取转基
因烟草的基因组 DNA, 以基因组 DNA 模板, P7 和
P8为引物, PBI121M sGDI1质粒为阳性对照, 未转
基因烟草基因组 DNA 为阴性对照, 对转基因烟草
进行 PCR鉴定。
2 结果与分析
2. 1 MsGDI1基因 cDNA序列的克隆
经 RTPCR扩增,获得了大小约为 1500 bp 的
特异性条带(图 1) ,将这条特异性条带切胶回收, 连
接克隆载体后测序,得到 1575 bp的序列。在 NCBI
上使用 ORF finder 软件查找到一个 1332 bp 的最
大开放阅读框, 编码 444 个氨基酸(图 2)。将此氨
基酸序列在 NCBI 上比对发现与其他植物的 GDP
解离抑制蛋白同源性高达 96%以上。
图 1 MsGDI1 基因的 PCR扩增
F ig. 1 PCR amplification of MsGDI1 gene
M: DNA Mar ker DL2000; 1: MsGDI 1基因
M: DNA Mar ker DL2000; 1: MsGDI 1 gene
2. 2 MsGDI1基因编码蛋白的理化性质分析
Compute pI/ M w 软件预测该蛋白的等电点为
5. 58, 相对分子量为 49. 8 KDa, 疏水性预测结果表
明,其大部分区域为亲水性(图 3A)。二级结构预测
结果表明, 该蛋白包含大量螺旋和折叠结构 (图
3B)。保守结构域预测结果表明, 该蛋白含有
ROSSMANN折叠 NAD( P) ( + )结合蛋白结构域
(图 3C)。对该蛋白进行亚细胞定位预测发现定位
于细胞质的可能性较大。M sGDI1基因编码蛋白与
17个物种的的 GDP 解离抑制蛋白氨基酸序列构建
进化树(图 4) , 比较分析表明, 亲缘关系越近的物
种,该蛋白进化关系越近。
2. 3 MsGDI1基因的半定量 RTPCR分析
半定量结果表明,紫花苜蓿 MsGDI1 基因在不
同组织中的表达情况为根> 茎> 叶(图 5) , 在盐胁
迫和铝胁迫条件下, 随着胁迫时间的增加,M sGDI1
基因的表达量呈现上升趋势(图 6)。
2. 4 植物表达载体 PBI121MsGDI1构建
提取 PBI121MsGDI1质粒, BamH 和 Sac
双酶切鉴定结果表明, 植物表达载体 PBI121MsG
DI1构建成功(图 7)。
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草 地 学 报 第 19卷
图 2 MsGDI1 基因序列及推测的氨基酸序列
F ig . 2 Nucleo tide and predicted amino acid sequences of MsGDI1
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第 1期 乌艳红等:紫花苜蓿GDP解离抑制蛋白基因 cDNA 的克隆、分析及烟草转化
图 3 MsGDI1基因编码蛋白理化性质的预测分析
F ig . 3 Analyses o f MsGDI1 coding pr otein
注: A疏水性分析, B编码蛋白二级结构, C编码蛋白保守结构域
Note: AH ydrophobicity analysis, BSecondary st ru cture of MsGDI1, CSpecif ically fun ct ional s ite of MsGDI 1
2. 5 转基因烟草的获得
用含有 pBIMsGDI1的根癌农杆菌侵染烟草叶
片,经 3~ 4周的选择培养, 从叶片周围愈伤组织分
化出不定芽,转入生根培养基 2~ 3周后, 转基因烟
草生根成苗,当再生植株株高 8~ 10 cm 时, 移栽到
灭菌的营养土中,正常生长(图 8)。
2. 6 转基因烟草的鉴定
以转基因烟草的基因组 DNA 为模板, P7和 P8
为引物对转基因烟草进行 PCR鉴定,琼脂糖凝胶电
泳显示有约 1300 bp的条带,与目的条带大小相符,
表明目的基因已成功插入转基因烟草植株中(图 9)。
3 讨论与结论
随着分子生物学技术的发展, 通过转基因手段
获得具有目标性状的植物已成为常用方法。基因克
隆最常用到的是 RACE 技术, 3RACE 相对而言较
为简单,但是 5RA CE 有时候存在一些问题。本研
究根据已经公布的与紫花苜蓿同源性很高的截形苜
蓿的 GDP 解离抑制蛋白基因 cDNA 序列, 在 3和
5端非编码区设计特异引物, 成功得到紫花苜蓿
GDP 解离抑制蛋白基因编码区序列,为目的基因的
克隆提供更方便的途径。
植物体内 GDP 解离抑制蛋白和多种非生物胁
迫相关,通过比对发现, 在不同的物种之间,该蛋白
的氨基酸序列和核苷酸序列都比较保守, 亚细胞定
位预测表明 M sGDI1定位于细胞质的可能性较大。
半定量 RTPCR发现,苜蓿植株中 MsGDI1基
因的表达存在空间差异,根中的表达量最高,茎中其
次,叶中最低;在铝胁迫和盐胁迫条件下, 该基因的
表达随着时间增加而升高,达到一定水平后表达量
基本保持不变, 这与汤华等[ 16] 的研究结果吻合, 初
步证明植物体内该基因与铝胁迫和盐胁迫相关。
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草 地 学 报 第 19卷162
第 1期 乌艳红等:紫花苜蓿GDP解离抑制蛋白基因 cDNA 的克隆、分析及烟草转化
图 9 转基因烟草的 PCR 检测
F ig . 9 PCR analy ses o f transgenic tobaccos
M: DNA Marker DL2000 plus; 1~ 12:转基因植株; CK : 阴性对照; CK+ :阳性对照
M : DNA marker DL2000 plus; 1~ 12: T ransgenic plants; CK: Negative cont rol; CK+ : Posit ive con tr ol
通过农杆菌介导的方法将 MsGDI1基因转入
到烟草中,初步鉴定获得了转基因植株,在此基础上
可以进行转基因植株的抗盐耐铝性检验, 更直观的
研究该基因的功能。同一基因在不同的物种间对某
一性状的影响不同,苜蓿体内超表达该基因对抗盐
耐铝性能起多大的作用还有待研究。
小三磷酸鸟苷( GTP)结合蛋白在细胞生长, 分
化以及基因表达的信号传导过程中发挥重要作
用[ 18] , 该蛋白功能的发挥通过 GDP 结合的非活性
状态和 GT P 结合的活性状态之间的循环得以实
现,细胞内小 GTP 结合蛋白通常与 GDP 结合形成
复合体,这时不能行使其功能, 当复合体上的 GDP
被 GT P 取代, 此时才能与信号通路下游的效应分
子结合, 发挥其作用。GDP 抑制解离蛋白通过与
GDP小 GT P 结合蛋白的复合体结合, 调控 GDP 解
离和 GTP 结合发挥其调控功能,并且能抑制 GTP
小 GT P 结合蛋白复合体与信号通路下游效应分子
的结合,从而调控信号转导过程适时终止[ 19]。植物
抗盐耐铝的分子机制十分复杂, 是许多基因协同作
用的结果, Ezaki[ 14, 15] 通过对转入烟草 GDP 抑制解
离蛋白基因的拟南芥进行研究发现,转基因拟南芥
表现出抗铝性是由于促进根尖区域的铝离子排出,
可能是拟南芥体内某些信号传导过程的终止而促进
铝离子的外排, 但是具体哪些信号传导途径被终止
以及转基因植株耐盐性提高机理有待进一步研究。
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