全 文 ：第20卷 第4期
Vol.20 No.4
草 地 学 报
ACTA AGRESTIA SINICA
2012年 7月
Jul. 2012
新疆野生黄花苜蓿愈伤诱导及分化的研究
刘 芳,王玉祥,陈爱萍,张 博*
(新疆草地资源与生态实验室 新疆农业大学草业与环境科学学院,新疆 乌鲁木齐 830052)
摘要:以新疆野生黄花苜蓿(MedicagofalcataL.)为材料,通过愈伤组织诱导及分化途径获得再生植株;从种子硬实、
外植体、激素(2,4-D和KT)、培养基方面探讨野生黄花苜蓿组织培养的影响因素。结果表明:4℃低温处理与浓硫酸
浸种结合是破除黄花苜蓿硬实的较优方法,发芽率达90%;下胚轴为诱导愈伤组织的最佳外植体;MS培养基比改良
的SH培养基对愈伤组织的诱导更有效,MS诱导培养基为 MS+2,4-D0.5mg·L-1+KT0.8mg·L-1+蔗糖
30g·L-1+琼脂粉7g·L-1,出愈率达到80%;浅绿色和浅黄色的愈伤组织在 MS+2,4-D0.2mg·L-1+KT0.4
mg·L-1+CH1g·L-1+蔗糖20g·L-1+琼脂粉7g·L-1的培养基上分化较好,分化率为30%。研究结果将为黄
花苜蓿生物技术育种奠定一定的基础。
关键词:黄花苜蓿;愈伤组织诱导;分化
中图分类号:Q943.1 文献标识码:A 文章编号:1007-0435(2012)04-0741-06
CalusInductionandDifferentiationofXinjiangMedicagofalcataL.
LIUFang,WANGYu-xiang,CHENAi-ping,ZHANGBo*
(XinjiangKeyLaboratoryofGrasslandResourcesandEcology,ColegeofGrasslandandEnvironmentalSciences,
XinjiangAgriculturalUniversity,Urumqi,Xinjiang830052,China)
Abstract:XinjiangwildMedicagofalcataL.wasselectedtostudycalusinduction,differentiationand
propagationregeneration.TheinfluencefactorsofwildM.falcataL.tissueculturesuchashardseed,
explants,hormones(2,4-DandKT)andmediawerediscussed.Resultsshowedthatthecombinationof
4℃low-temperaturetreatmentandsulfuricacidsoakingasthebettermethodofbreakingthehardseedof
M.falcataL..Thistreatmentresultedin90%germinationrate.Hypocotyltissuewasthemostsuitable
explantforcalusinduction.TheMSmediumwasmoreeffectivethantheimprovedSHmediumforthecal-
lusinduction.TheoptimalcalusinductionmediumcontainedMS+2,4-D0.5mg·L-1+KT0.8mg·L-1+
sucrose30g·L-1+agarpowder7g·L-1with80%calusinductionrate.Lightgreenandlightyelowcalus
werediferentiatedinculturemediumcontainingMS+2,4-D0.2mg·L-1+KT0.4mg·L-1+CH1g·L-1+
sucrose20g·L-1+agar7g·L-1with30%diferentiationrate.ThistechniquewillayafoundationforM.fal-
cataL.biotechnologybreeding.
Keywords:MedicagofacaltaL.;Calusinduction;Differentiation
黄花苜蓿(MedicagofalcataL.)是苜蓿属中
很重要的多年生野生豆科牧草,广泛分布于新疆的
南北疆[1],是苜蓿育种研究的主要种质资源。黄花
苜蓿草质优良,茎叶营养丰富,具有较高的应用价
值,具有抗逆性强、耐旱、耐寒、耐盐、耐瘠薄和寿命
长等突出特点,是我国北方建设高产优质混播草地
的主要豆科草种。我国学者对于黄花苜蓿已经做过
大量研究,但多数是关于栽培利用、种子及植株形
态、黄花苜蓿遗传多样性的报道,刘俊英等[2]做了关
于黄花苜蓿栽培驯化及杂交利用的研究;王俊杰
等[3]做了关于黄花苜蓿遗传多样性的研究;于林清
等[4]对黄花苜蓿的多样性及秋眠性进行了相应的研
究;何茂泰等[5]关于野生黄花苜蓿花药愈伤组织的
诱导和植株再生进行了研究;黄竣等[6]对黄花苜蓿
进行了游离细胞培养的研究;白静仁等[7]对野生黄花
苜蓿叶肉原生质体的培养进行了研究;马海燕等[8]做
收稿日期:2012-01-16;修回日期:2012-04-04
基金项目:国家“863”项目(2009AA10Z108);国家“十二五”科技支撑计划项目(2011BAD17B05-02)资助
作者简介:刘芳(1986-),女,河南商丘人,硕士研究生,研究方向为牧草遗传育种,E-mail:lf401305@163.com;*通信作者Authorforcor-
respondence,E-mail:xjauzb@sina.com
草 地 学 报 第20卷
了关于新疆苜蓿再生体系的研究;其他学者[9-10]在
种质资源等方面也做了部分研究。国外的学者关于
黄花苜蓿的研究较多,BenderA.[11]对包括2份黄
花苜蓿(134份)材料在抗寒性方面进行了研究;
Wilton等[12]研究表明黄花苜蓿的抗旱性和抗寒性
均强于百脉根(LotuscorniculatusL.)和野豌豆
(Viciasepium Linn.);Kidwel等[13]用RFLP分子
标记技术研究显示,黄花苜蓿与紫花苜蓿(M.sati-
vaL.)虽有一定的亲缘关系,但黄花苜蓿遗传多态
性比紫花苜蓿要高;Shao等[14]和Denchev等[15]均
对黄花苜蓿体细胞胚的发生进行了研究。近年来关
于黄花苜蓿植株再生的研究很少,黄花苜蓿有着许
多优良特性,不同品种间培养条件差异较大,本试验
旨在研究适用于新疆北疆野生黄花苜蓿愈伤诱导及
分化的方法,为后续黄花苜蓿转基因试验奠定基础,
也为苜蓿育种提供一定参考。
1 材料与方法
1.1 材料
2009年8月采集于新疆奇台县天山山区(N43°
45′03.2″,E89°25′13.2″;海拔1480m)的黄花苜蓿种
子于布袋中室温保存,2010年10月进行试验。
1.2 方法
1.2.1 黄花苜蓿种子处理 选取籽粒饱满的黄花
苜蓿种子,设置5个处理。处理Ⅰ(CK):未作任何
处理;处理Ⅱ:砂纸打磨;处理Ⅲ:浓硫酸浸种15~
20min;处理Ⅳ:浓硫酸浸种15~20min后流水冲
洗30min;处理Ⅴ:4℃ 放置24h,浓硫酸浸种15~
20min后流水冲洗30min。
1.2.2 外植体筛选
1.2.2.1 无菌苗获得 选取籽粒饱满的种子4℃
下放置24h,浓硫酸浸种15~20min后流水冲洗
30min,75% 酒精浸泡30s,然后在0.1% HgCl2 溶
液中处理5min,再用无菌水冲洗3~5次,灭菌后
的种子置于 MS培养基上(含3%蔗糖和0.8%琼
脂),密封,在发芽箱培养。下胚轴暗培养(25℃±
1℃);子 叶 与 叶 片 进 行 光 培 养 (光 周 期 为 16
h·d-1,光照强度1500~2000lx,25℃±1℃)。
1.2.2.2 外植体来源 将8~10d大小的下胚轴
切成3~5mm长的小段;将培养10d以上完全展
开的子叶切成5mm×5mm大小;将培养12d以上
展开的叶片切成长条状。每个处理10瓶,每瓶接6
块外植体,将外植体置于愈伤组织诱导培养基上。
1.2.3 愈伤组织诱导与分化的培养基 试验分别
以 MS和改良后的SH(SH的大量元素,MS的微量
元素,铁盐及B族维生素,重新命名为 MSH)为基
本培养基。
1.2.4 培养基的制备 以上诱导培养基均加入30
g·L-1蔗糖+7g·L-1琼脂,pH5.8~6.2。分化
培养基加入20g·L-1蔗糖+7g·L-1琼脂,pH
5.8~6.2。
表1 黄花苜蓿诱导及分化培养基
Table1 MedicagofalcataL.inductionand
differentiationculturemedium
培养基
Medium
编号
Number
2,4-D
/mg·L-1
KT
/mg·L-1
CH
/g.L-1
诱导培养基
Inductionculture
medium
MS1 0 0 0
MS2 0.2 0 0
MS3 0.5 0 0
MS4 1 0 0
MS5 1.5 0 0
MS6 2 0 0
MS7 2.5 0 0
MS8 0.5 0.05 0
MS9 0.5 0.2 0
MS10 0.5 0.5 0
MS11 0.5 0.8 0
MS12 0.5 1 0
分化培养基
Differentiation
culturemedium
MSH1 0.5 0.05 0
MSH2 0.5 0.2 0
MSH3 0.5 0.5 0
MSH4 0.5 0.8 0
MSH5 0.5 1 0
MS13 0.2 0.2 1
MS14 0.2 0.3 1
MS15 0.2 0.4 1
MS16 0.2 0.5 1
MS17 0.2 0.6 1
1.2.5 培养条件 诱导的培养条件:黑暗培养(培养
温度为25℃±1℃)3d后进行光培养(光周期为16
h·d-1,光照强度1500~2000lx,温度为25℃±
1℃)。分化培养的条件与诱导的光照培养条件相同。
1.3 数据处理和分析
数据用Excel2003和DPS6.0统计软件进行
处理和分析。
2 结果与分析
2.1 不同处理对破除硬实的影响
黄花苜蓿具有抗逆性强、耐旱、耐寒和寿命长等
突出的特点,但种子的硬实率很高,新疆的黄花苜蓿
亦是如此。由表2可知,处理Ⅴ黄花苜蓿的发芽率
达到90%,比处理Ⅰ(CK)的发芽率提高了86.66%;对
247
第4期 刘芳等:新疆野生黄花苜蓿愈伤诱导及分化的研究
于破除种子的硬实率方面,浓硫酸起着显著的作用,
徐道英等[16]和田甜等[17]均证实对于高硬实率的种
子,浓硫酸浸种对种子发芽数有明显的影响。但处理
Ⅳ,虽说在一定程度上提高了发芽率,但其平均发芽
率仅为50%,远不能满足试验要求。在处理Ⅴ中,先
将种子在4℃低温处理24h,再采用浓硫酸处理使得
平均发芽率达90%,可以表明4℃的低温处理对黄花
苜蓿的发芽有促进用,云文丽等[18]和云锦凤等[19]研
究表明低温处理(春化现象)在一定程度上提高了牧
草种子的发芽率,与本试验的结果相一致。
表2 不同处理对破除黄花苜蓿硬实率的影响
Table2 Theinfluenceofdifferenttreatmentson
thehardseedsofMedicagofalcataL.
不同处理 Differenttreatments 发芽百分率 Germinationrate/%
Ⅰ(CK) 3.34D
Ⅱ 13.34CD
Ⅲ 23.34C
Ⅳ 50B
Ⅴ 90A
注:不同大写字母间表示差异极显著(P<0.01)
Note:Differentcapitallettersmeansignificantdifferenceatthe
0.01level
2.2 外植体的筛选
以下胚轴、子叶、叶片为外植体,进行外植体的
筛选。由表3可知,在相同的培养基及相同的培养
条件下,下胚轴、子叶、叶片的出愈率依次为85%,
66%和70%,下胚轴的出愈率最高,褐化数低,从而
确定下胚轴为较佳的外植体。
2.3 不同激素对愈伤组织诱导的影响
2.3.1 单一激素诱导愈伤组织 试验以下胚轴为外
植体,采用不用浓度的2,4-D进行愈伤组织诱导。当
2,4-D浓度为0和0.2mg·L-1时所诱导愈伤出愈率
低且生长速度缓慢;当2,4-D浓度为0.5mg·L-1和
1mg·L-1时出愈率基本达到100%,愈伤的颜色及
质地表现为乳白色松软状;随着2,4-D浓度增加,虽
然出愈率达到100%,但愈伤组织呈现出乳白色水样
状,不适宜进行分化。因此适宜的2,4-D浓度为0.5
mg·L-1,试验结果如表4所示。
表3 不同的外植体对愈伤组织诱导的影响
Table3 Effectofdifferentexplantsoncalusinduction
外植体
Explants
接种数
Inoculants
出愈数
Calus
出愈率/%
Calusfrequency
褐化数
Browningnumber
未出愈数
Nocalus
污染数
Polution
颜色
Colors
叶片Leaf 60 42 70 11 7 0 绿色
子叶Cotyledon 60 40 66 14 6 0 绿色及黄色
下胚轴 Hypocotyl 60 51 85 1 2 6 淡绿色
表4 不同2,4-D浓度对下胚轴愈伤诱导状况
Table4 Inductionconditionofhypocotylscalusatdifferent2,4-Dconcentrations
激素浓度/mg·L-1
Endocrineconcentration
外植体数
Numberofexplants
出愈率/%
Calusfrequency
颜色
Colors
质地
Character
0.0 60 20 白色 松软
0.2 60 50 乳白色 松软
0.5 60 100 乳白色 松软
1.0 60 90 乳白色 松软
1.5 60 100 乳白色 稀软
2.0 60 100 乳白色 水样
2.5 60 100 乳白色 水样
2.3.2 不同培养基及激素组合对愈伤组织诱导的
影响 苜蓿再生所用到的培养基种类繁多,不同的
培养基对愈伤诱导也有着不同的影响。试验中选取
MS和 MSH培养基。在含0.5mg·L-12,4-D的
MS培养基中,附加不同浓度的 KT进行下胚轴愈
伤组织诱导,结果表明:当KT的浓度为0.05mg·L-1
时,其愈伤呈现乳白色,表面湿润,质地稀软,虽然其
出愈率最高,为98.30%(表5),但其愈伤组织并不
适宜用作分化。之后随着KT浓度的增加,愈伤组
织出愈率呈现先增加后降低的趋势,当KT浓度为
0.8mg·L-1时,出愈率最高值达到80%,且愈伤组
织外观疏松,表面瘤状突起明显,颜色有淡黄色和淡
绿色(图片A~C)。
在 MSH培养基中添加与 MS培养基相同的激
素浓度,当KT的浓度为0.05mg·L-1时,出愈率
虽高达93.30%(表5),但愈伤质地稀软,其愈伤组
347
草 地 学 报 第20卷
织并不适宜用作分化。由图1可知,随着KT浓度
的增加,愈伤组织出愈率呈现先增加后降低再增加
的趋势,当KT浓度为0.2mg·L-1时,出愈率最高
值达到36.7%。结合以上的分析可知 MS培养基
和 MSH培养基都可使下胚轴产生出愈伤组织,MS
培养基诱导的出愈率明显高于 MSH 的。因此,最
佳的培养基及激素组合为 MS+0.5mg·L-12,4-D
+0.8mg·L-1KT。
表5 培养基及激素组合对出愈率的影响
Table5 Effectofbothmediumandhormoneoncalusinductionrate
培养基
Medium
外植体数
Numberofexplants
2,4-D
/mg·L-1
KT
/mg·L-1
出愈率/%
Calusfrequency
MS8 60 0.5 0.05 98.3
MS9 60 0.5 0.2 70.0
MS10 60 0.5 0.5 75.0
MS11 60 0.5 0.8 80.0
MS12 60 0.5 1.0 70.0
MSH1 60 0.5 0.05 93.3
MSH2 60 0.5 0.2 36.7
MSH3 60 0.5 0.5 20.0
MSH4 60 0.5 0.8 18.3
MSH5 60 0.5 1.0 21.6
图1 不同培养基愈伤诱导的出愈率
Fig.1 Calusinductionratesofdifferentmedia
2.4 不同浓度的KT对愈伤组织分化的影响
有研究表明,分裂素KT的浓度对再生芽的诱
导有显著的影响[27]。试验以 MS培养基为基本培
养基,试验结果表明,随KT浓度的增加,分化率呈
现先增加后降低的趋势,当KT的浓度在0.2~0.4
范围内分化率呈现上升趋势,依次为13.3%,21.7%
和30%;随后,分化率开始下降,如图2所示。因
此,KT浓度为0.4mg·L-1时,愈伤组织分化率最
高,为30%,分化苗如图片F~H所示。
3 讨论与结论
3.1 外植体对愈伤组织形成的影响
苜蓿组织培养开展研究近40年来,国内外研究
图2 愈伤组织分化率
Fig.2 Thedifferentiationrateofcalus
报告中所采用的外植体种类繁多,几乎苜蓿所有器官
或组织都可作为外植体,如茎尖、叶片、子叶、下胚轴、
上胚轴、茎段、幼芽、花粉、花药、根、叶柄等。本试验
以黄花苜蓿以黑暗培养8~10d的下胚轴、光照培养
10d以上完全展开的子叶、培养12d以上展开的叶
片为外植体,在相同的培养基及相同的培养条件下,
下胚轴、子叶和叶片的出愈率依次为85%,66%和
70%,这表明黄花苜蓿各类外植体愈伤形成能力有差
异,下胚轴形成愈伤的能力大于子叶及叶片。此结论
与王涌鑫等[20]、危晓薇等[21]、高雪芹等[22]的研究结
果相一致。黄峻等[23]用黄花苜蓿下胚轴和子叶为外
植体获得了再生植株,伊风艳等[24]关于黄花苜蓿再
生的研究也表明下胚轴为最佳外植体。
3.2 培养基种类对愈伤组织诱导的影响
培养基的主要成分是植物生长发育所必须的各
447
第4期 刘芳等:新疆野生黄花苜蓿愈伤诱导及分化的研究
图片 Pictures
A:淡黄色愈伤组织;B和C:淡绿色愈伤组织;D:紧实的愈伤组织;E:畸形苗;F:初期分化苗;G,H和I:分化苗
A:lightyelowcalus;BandC:lightgreencalus;D:compactionofthecalus;E:deformityseedlings;
F:earlydifferentiationseedlings;G,HandI:differentiationofseedling
种营养元素、碳源和有机添加物等。不同的植物材
料以及不同的发育阶段对培养基的要求都不一样。
苜蓿组织培养研究开始以来,采用较多的是 MS培
养基。MS培养基最初是为烟草(Nicotianataba-
cumLinn.)的培养设计的,其主要特点是无机盐的
浓度高,能够加速愈伤组织的生长,可满足组织培养
对矿质营养元素的需求。
植物组织培养的培养基种类很多,对于愈伤组
织的形成有着一定的影响。在王涌鑫等[20]关于高
效的苜蓿组织培养再生体系研究中,其认为使用改
良的SH培养基对愈伤组织的诱导更有效;俆长绘
等[25]通过比较苜蓿在改良SH 培养基关于植株再
生的研究中,发现改良SH培养基在诱导苜蓿愈伤
组织分化方面更具优势。徐春波等[26]用紫花苜蓿
的4个品种获得高频再生体系的研究中表明最佳脱
分化培养基为改良SH,最佳分化培养基为 MS。本
试验中使用 MSH 和 MS培养基进行愈伤组织诱
导,结果表明,在相同的试验条件下,MS培养基所
诱导的愈伤组织数量明显高于 MSH培养基所诱导
的。本试验通过分析认为对于黄花苜蓿愈伤组织诱
导,MS培养基所提供的硝态氮(NO-3 )比 MSH 所
提供的氨态氮(NH+4 )具有更大的优越性。
3.3 外源激素对愈伤组织诱导与分化的影响
在植物组织培养中,仅靠植物体内的激素是远
远不够的,外源的细胞分裂素和细胞生长素能够提
供细胞离体培养中必须的激素。李聪等[27]研究表
明2,4-D是植物离体培养所必须的外源激素,杨燮
荣等[28]在苜蓿组织培养中只采用2,4-D 或不断降
低其浓度,获得了愈伤组织,但在本试验中,仅仅依
靠2,4-D可以诱导出愈伤组织,但诱导出的愈伤组
织在颜色及形态上均不及在添加了KT的培养基所
诱导出的愈伤,因此关于黄花苜蓿愈伤组织的诱导必
须在2,4-D基础上添加一定浓度的分裂素,对愈伤组
547
草 地 学 报 第20卷
织的质量有很大的提高,黄峻等[24]研究以黄花苜蓿
下胚轴、子叶为材料,在0.5~2mg·L-12,4-D以及
1mg·L-12,4-D和0.2~0.6mg·L-16-BA的培养
基上均可诱导形成愈伤组织。
分裂素KT的浓度对再生芽的诱导有显著的影
响,李聪等[27]认为,KT对苜蓿愈伤组织的分化有促
进作用。Suanders等[29]认为2,4-D在诱导苜蓿脱
分化后必须将其及时降低或去除,否则不能形成成
熟的体细胞胚或再生植株。因此,本试验中选取
0.2mg·L-12,4-D和不同浓度KT作为分化的外源
激素,结果表明0.2mg·L-12,4-D和0.4mg·L-1
KT可使黄花苜蓿愈伤组织分化,得到了较高的分化
率。
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(责任编辑 李美娟)
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