全 文 ：第 17 卷 第 2 期
Vol. 17 No . 2
草 地 学 报
ACTA AGRESTIA SINICA
2009 年 3 月
Mar . 2009
结缕草属植物 RAPD反应体系的优化
陈 宣1, 薛丹丹2 , 郭海林1, 2 , 刘建秀1, 2*
( 1. 江苏省中科院植物研究所, 南京 210014; 2. 南京农业大学, 南京 210095)
摘要:为建立一个稳定的结缕草属植物 RAPDPCR 反应体系,以结缕草种源 Z111( Zoy s ia j aponica Steud. )为实验
材料,研究了模板 DNA 浓度、Taq 酶、Mg 2+ 浓度、dNT P 浓度、引物及扩增缓冲液浓度等各个主要因素对结缕草
RAPDPCR 反应的影响,并分别对各项单因子进行优化。结果表明:总反应体积为 20 L 时, 各反应物的适宜用量
分别为模板 DNA 浓度 30 ng、Taq 酶 1. 0 U、Mg2+ 2. 5 mmo l/ L、dNTP 0. 19 mmol/ L、引物 0. 5 mol/ L、10 buffer
2. 0 L ; 5 种、1 变种共 20份结缕草种源材料验证,显示该体系扩增条带多、清晰结果稳定, 表明该体系是一个适合
结缕草属植物 RAPD PCR反应的体系。
关键词:结缕草; RAPD; 反应体系; 优化
中图分类号: Q943 文献标识码: A 文章编号: 10070435( 2009) 02018106
Optimalization of RAPD Reaction System for Zoysia
CHEN Xuan1 , XU E Dandan2 , GUO Hailin1, 2 , L IU Jianxiu1, 2*
( 1. Ins titute of Botany, J ian gsu Pr ovin ce an d Chines e Academy of Sciences, Nan jing, Jiangsu Provin ce 210014, C hina;
2. College of H ort iculture, Nanjin g Agricultural University, Nanjing, Jiangsu Province 210095, China)
Abstract: The fresh leaves of zo ysiagr ass ( Z111) w ere used to study the effect of the primar y factors inclu
ding template DN A, Taq DNA polymerase, M g2+ , dNTP, random primers, and buffer on the RAPDPCR
react ion sy stem. T he results show that the r eaction mater ials of the opt imized RAPD PCR react ion sy stem
w ere as follow s: 20 L to tal volume of 30 ng template DNA, Taq DNA po lymerase at 1. 0U, Mg 2+ at 2. 5
mmo l/ L , dNT P at 0. 19 mmo l/ L , random pr imer s at 0. 5 mol/ L , and 10 buffer 2. 0 L. The optim ized
system w as tested w ith 20 accessions of zoy siagrass including f iv e species and one variety, and the r esults
indicate that the react ion sy stem o f RAPD could be used in mo lecular marking o f Zoy sia Willd.
Key words: Zoy sia Willd. ; RAPD; React ion system; Opt imizat ion
RAPD( random amplif ied polymorphic DNA,
随机扩增多态性 DNA )标记, 是 1990 年由 Wil
l iams、Welsh 等人基于 PCR 技术提出的标记技
术[ 1, 2] , 具有操作简单、检测快捷、所需 DNA 样品
少、通用性高、成本较低等优点, 目前广泛成功应用
于动植物遗传分析等诸多方面, 而且还可转化为
SCAR( sequence character ized amplificat ion reg ion
)、ST S ( sequence tagged sites )等共显性分子标记,
为其提供了新的方法和途径[ 3~ 5] 。
RAPD标记技术由于引物序列较短, 与模板结
合随机性强,易导致实验结果稳定性和重复性差, 因
此,必须依据具体的环境条件,对反应条件进行筛选
优化,获得稳定的扩增结果。Cho i等应用 50 L 的
RA PD体系,对韩国本土结缕草的 5个种及其 58个
生态型进行了鉴别[ 6] ;李亚等应用 25 L 的 RAPD
体系, 对中华结缕草( Zoy sia sinica Hance)的遗传
分化进行了分析[ 7] 。本研究依照以上两个体系对结
缕草属( Zoy sia)其它 5个植物种进行 RAPD扩增,
结果无条带或条带不清晰, 反应体系必须进行优化。
本研究以结缕草 Z111( Zoy sia j aponica Steud. )为
试验材料,优化 RAPDPCR 反应体系, 然后以结缕
草属 5个种、1个变种共计 20份种源材料对该反应
体系加以验证,旨在建立一个稳定的结缕草属植物
RA PDPCR反应体系,为今后相关研究奠定基础。
收稿日期: 20080304;修回日期: 20080925
基金项目:江苏省高技术研究项目( BG2006320) ,国家青年科学基金项目( 30800759)
作者简介:陈宣( 1983 ) ,男,海南定安人,硕士研究生,研究方向为暖季型草坪草抗盐性研究, Em ail: chenxuan06@ sina. com; * 通讯作者
Auth or for correspon dence, Email: tu rfun it@ yahoo. com. cn
草 地 学 报 第 17卷
1 材料与方法
1. 1 实验材料
以结缕草属 5个种、1个变种共计 20份结缕草
种源为实验材料,其中 Z111用于体系优化, 其它材
料均用作优化体系验证(表 1)。所有材料均取自江
苏省中科院植物研究所草业研究中心的试验苗圃地。
1. 2 试验方法
1. 2. 1 基因组总 DNA 的提取及检测 20份结缕
草种源的基因组总 DNA 提取参考郭海林等 [ 8]的方
法。DNA 质量和浓度采用 0. 8%的琼脂糖凝胶电
泳检测,并将其稀释至 50 ng /L,置于冰箱- 20
储存备用。
1. 2. 2 试验设计 RAPD反应条件的优化是在初
始反应条件的基础上进行 ( T aq DNA 聚合酶、
Mg2+ 、10 Buf fer 、dNT P 均购自上海博彩生物科
技有限公司; 随机引物序列为 GGT CCCT GAC, 由
上海 invit rog en生物技术有限公司合成) , RAPD初
始反应体系具体配置见表 2。
表 1 试验材料与来源
Table 1 Exper iment materials and their source
编号
No.
种源
Accession
种名
Species
采样点
Collect ion site
1 Z122 Z. sinica var. Nip pon ica 江苏省射阳市 Sheyan g, Jiangsu pr ovin ce
2 Z089 Z. t enui f ol ia 海南省海口市 Haikou, H ain an province
3 Z075 Z. mat re lla 台湾 T aiw an
4 Z059 Z. mat re lla 江苏省南京市 Nan jing, Jian gsu province
5 Z105 Z. sinica Z. j ap onica 山东省烟台市 Yintai, Shandong province
6 Z008 Z. sinica 杭州水稻所 H angzhou, Zhejian g pr ovince
7 Z119 Z. sinica 江苏省响水市 Xiangsh ui, Jian gsu province
8 Z068 Z. sinica 安徽省南陵县 Nan ling, Anhui province
9 Z116 Z. sinica 山东省枣庄市 Zaozhuang, Shandong province
10 Z020 Z. sinica 山东省胶州市 Jiaozhou, Shandong province
11 Z022 Z. j aponica 山东省胶州市 Jiaozhou, Shandong province
12 Z026 Z. j aponica 山东省章丘县 Zh angqiu, Sh andong province
13 Z049 Z. j aponica 安徽省滁州市 Chuzhou, Anhui province
14 Z061 Z. j aponica 江苏省南京市 Nan jing, Jian gsu province
15 Z101 Z. j aponica 河南省信阳市 Xin yang, H enan province
16 Z111 Z. j aponica 辽宁省瓦房店市 Wafangdian, Liaoning
17 Z070 Z. j aponica 江苏省苏州市 Suzhou, J iang su provin ce
18 Z073 Z. j aponica 日本国爱知县 Aichi, Japan
19 Z080 Z. j aponica 日本国爱知县 Aichi, Japan
20 Z130 Z. macr ostaych a 浙江省舟山市 Zh ou shan, Zh ejiang provin ce
表 2 RAPDPCR 初始反应体系
Table 2 Original reaction sy stem o f RAPDPCR
反应物
Reactant
模板 DNA
T em plate DNA
T aq DNA 聚合酶
T aq DNA polymeras e
镁离子
Mg2+
脱氧核苷酸
dNTP
随机引物
Random primer
缓冲液
Buffer
双蒸水
ddH 2O
规格
Spec
50 ng 1 U L- 1 25 mm ol L- 1 2. 5 mmol L- 1 10 mmol L - 1 10
用量(L)
Dosage
1. 0 1. 0 2. 0 1. 5 0. 8 2. 0 11. 7
在初始反应条件的基础上对扩增反应中的各因
子浓度设置梯度,分别进行单因子优化分析, 即进行
第一个因子筛选时,其余因子参照初始反应体系中
的用量;进行第二个因子筛选时,第一个因子使用筛
选出的最佳值, 其余因子仍参照初始反应体系用量,
并相应地调整 ddH 2O 用量, 以保持反应体系为
20 L; 依次类推, 直到筛选出最后一个因子的最佳
值为止。最后应用 20 份材料依照最终优化体系进
行 RAPDPCR扩增验证。
反应体系的各因子浓度梯度设置见表 3。
1. 2. 3 RAPDPCR 扩增及电泳 RAPDPCR扩
增程序为: 94 - 3 min; 94 - 45 s, 36 - 30 s,
72 - 1. 5 min, 45 个循环; 72 - 5 min; 最后 4
保存, 扩增反应在TC412型扩增仪( T ECHNE公
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第 2期 陈宣等:结缕草属植物 RAPD反应体系的优化
表 3 不同用量的各因子处理
T able 3 Volume t reatment s o f each facto r
处理
Treatm ent
模板 DNA
T em plate DNA
50 ng L- 1
T aq DNA 聚合酶
T aq DNA polymeras e
1 U L- 1
镁离子
Mg2+
25 mmol L- 1
脱氧核苷酸
dNTP
2. 5 mmol L- 1
引物
Prim ers
10 mm ol L- 1
缓冲液
Buf fer
10
a 0. 4 0. 5 1. 0 0. 5 0. 4 1. 0
b 0. 6 0. 75 1. 5 1. 0 0. 6 1. 5
c 0. 8 1. 0 2. 0 1. 5 0. 8 2. 0
d 1. 0 1. 25 2. 5 2. 0 1. 0 2. 5
e 1. 2 1. 5 3. 0 2. 5 1. 2 3. 0
f 1. 5 2. 0 4. 0 3. 0 1. 5 4. 0
司,英国)中进行。
将 RAPDPCR扩增产物加入 0. 8 L 6 load
ing buf fer,充分混合,用含 0. 5 g / mL EB的 1. 2%
琼脂糖凝胶电泳分离, 电泳缓冲液为 1 TAE, 5V/
cm 的稳压条件下进行电泳( DYY5型稳压稳流电
泳仪及 DYCP34A 型水平板凝胶电泳槽, 北京六
一) , 然后用自动凝胶成像分析系统( JS380A 型, 上
海培清)进行观察、照相并存档。
2 结果与分析
2. 1 基因组总 DNA质量检测
以已知浓度的DNA 作参照, 将提取的基因组
总 DNA 在 0. 8%的琼脂糖凝胶上进行电泳检测,
DNA 条带较亮(图 1) , 说明提取的 DNA 量较多;
DNA 谱带整齐, 无弥散现象, 表明 DNA 完整无降
解;然后加适量 TE, 将其稀释至 50 ng/L, 置于冰
箱- 20 储存备用。对稀释后的 DNA 进行电泳检
测, DNA条带亦明亮整齐,无弥散现象(图 2) , 表明
DNA 稀释后对实验结果无不良影响,可在后续实验
中应用。
2. 2 模板 DNA用量筛选
依据 RAPDPCR 初始反应体系, 进行模板
DNA 用量筛选,结果如图 3所示。以不同用量模板
DNA 进行扩增, a~ f泳道条带差异不明显。可见,
该 RAPDPCR反应体系对模板要求不严格, 20 ~
75 ng / 20 L 均可满足扩增要求, 在保证结果稳定
的基础上以节约成本为原则, 最终确定 DNA 的适
宜用量为 30 ng/ 20 L。
2. 3 Taq DNA聚合酶用量筛选
依据 RAPDPCR初始反应体系和最佳的模板
DNA 用量, 进行 T aq DNA 聚合酶用量筛选。图 4
表明, Taq酶浓度为 0. 5U~ 2. 0U 时均有扩增条带,
在 0. 5U、0. 75U ( a、b 泳道)时, 扩增条带较少且带
型较弱;在 1. 0 U ~ 2. 0U( c~ f泳道)时条带丰富且
清晰可见,其中浓度 1. 5U ~ 2. 0U ( e~ f泳道)时,扩
增明显加强,带型更丰富, 但出现弥散现象,不易辨
别;可见 Taq DNA 聚合酶是 RA PD扩增反应中的
关键因素,其浓度变化对扩增结果影响很大,从试验
效果和费用综合考虑, 确定 c 泳道为最佳, 即 T aq
DNA 聚合酶用量为 1. 0U。
183
草 地 学 报 第 17卷
2. 4 Mg2+ 浓度筛选
在 PCR反应中, M g2+ 浓度也是影响扩增结果
的关键因素之一, 加入不同用量 Mg2+ , DNA 扩增
结果如图 5 所示, a~ c 泳道扩增产物条带逐渐增
多,亮度逐渐增强,而 c~ f泳道亮度则逐渐减弱, 可
见 c泳道效果最佳,确定 Mg2+ 适宜用量为 2. 0 L,
即 Mg 2+ 浓度为 2. 5 mmol/ L。
2. 5 dNTP浓度筛选
加入不同浓度的 dNTP, DNA 扩增结果如图 6
所示, a~ c泳道条带逐渐增加, c~ f 泳道的扩增条
带清晰度逐渐减弱, f 泳道条带亮度最弱, 因此可确
定 c泳道为最佳选择,即适宜的 dNT P 反应用量为
1. 5 L, dNT P 浓度为 0. 19 mmol/ L。
2. 6 引物浓度筛选
由图 7可知, a泳道没有出现条带, 可能由于引
物浓度过低导致无法扩增, b泳道虽获得扩增产物,
但条带较弱, c~ f 泳道条带都较清晰, 亮度逐渐增
强,但 e~ f泳道背景均较亮,有个别非特异性扩增
产物条带出现, 影响实验结果分析,因此, d泳道为
最佳选择, 扩增反应随机引物的适宜用量为 1. 0
L,即最终引物浓度为 0. 5 mol/ L。
2. 7 缓冲液用量筛选
加入不同用量的缓冲液, DNA 扩增结果如图 8
所示, a~ f各泳道的条带清晰可见, 数目一致,结果
差异不大,可见缓冲液浓度对于该扩增体系无重要
影响, 1. 0~ 4. 0 L 均符合扩展要求,经综合分析,
确定 10 buf fer 使用量为 2. 0 L。
184
第 2期 陈宣等:结缕草属植物 RAPD反应体系的优化
图 7 随机引物不同浓度的扩增结果
Fig. 7 Amplif ication by r andom primer w ith
differ ent concent rations
模板 DNA 30 ng、T aq DNA 聚合酶 1U、M g2+ 2. 0 L、
dNTP1. 5L、缓冲液 2. 0 L
Template DNA30 ng ; T aq DNA po lymerase 1U ; Mg2+
2. 0 L ; dNT P 1. 5 L; 10 buffer 2. 0 L
综上所述, 通过对反应体系中各因子进行优化,
确定结缕草属植物进行 RA PDPCR反应的最佳体
系为:总反应体积 20 L; 各反应物的适宜用量分别
为模板 DNA 30 ng、Taq DNA 聚合酶 1. 0 U、Mg2+
2. 5 mmo l/ L、dN TP 0. 19 mmo l/ L、引物 0. 5 mol/
L、10 buf fer 2. 0 L。
图 8 缓冲液不同用量的扩增结果
Fig . 8 Amplification by 10 buffer wit h differ ent dosages
模板DNA 30 ng、T aqDNA 聚合酶 1U、M g2+ 2. 0L、dNT P1. 5
L、随机引物 1. 0 L
T emplate DNA30 ng; T aq DNA polymerase 1U; Mg2+ 2. 0
L; dNT P 1. 5 L; rand om prim er 1. 0 L
2. 8 优化体系的验证
按照试验优化的结缕草 RAPDPCR 最佳体
系,对 20份不同的结缕草材料进行 PCR扩增, 验证
该体系,结果如图 9所示。应用该优化体系扩增结
果显示条带数目多,且清晰度较高,重复三次结果一
致,说明该体系具有较好的可重复性和稳定性。
图 9 应用优化体系进行 RAPDPCR 扩增的结果
F ig . 9 Amplification result w ith the opt imal RAPDPCR react ion system
Mmarker 引物, 120为结缕草种源编号; Mmarker, No. 120 refers to the s erial number of zoysiagras s acces sions
3 讨论
关于 RAPDPCR体系优化的研究在很多植物
的研究中已有报道,但不同植物种属之间存在很大
差异,即使同种之间也有差别[ 9] ,这与 RAPD 扩增
体系中各因子具有很大关系。反应体系中的
Mg 2+ 、dN TP、引物浓度以及 Taq DN A 聚合酶用量
都与扩增效果密切相关[ 10] , 并且某种因素浓度高
低、用量多少都会对其他因素产生明显影响。
高质量的 DNA 模板是保证 RAPD 反应顺利、
稳定进行的必要条件, 模板用量在一定范围内对扩
增结果影响较小, 但其纯度对扩增的特异性影响较
大,本试验 DNA 模板用SDS法提取, 然后用RNase
除去 RNA,经琼脂糖电泳检测以及 RAPDPCR反
应结果表明, 该体系对 DNA 模板要求不严格,提取
的 DNA能够完全满足 RAPDPCR的要求 [ 11, 12]。
T aq DNA 聚合酶能显著影响 PCR扩增反应过
程,是影响扩增结果的最主要因素, 酶用量过低时,
底物与酶接触机率较小, 产物较少; 而酶用量过高
时,由于引物与模板 DNA 结合存在非竞争性抑制,
使酶的特异催化效率降低, 非特异产物增加。据本
试验结果,酶用量在 1. 0~ 1. 5U 之间, PCR结果较
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草 地 学 报 第 17卷
好。Taq DNA 聚合酶作用需要一定浓度的 Mg2+
来激活, 因此 Mg 2+ 浓度直接影响着酶的催化能力,
同时引物、模板双链的解链和退火温度也受 Mg2+
影响,提高 DNA 双链结构的稳定性, M g2+ 浓度过
高会使引物错配频率增加,导致非特异性的扩增, 浓
度过低又会减弱 Taq DNA 聚合酶活性,在本试验
中亦得到了证实, 最终确定 Mg2+ 最佳浓度为 2. 5
mmo l/ L。因此,当扩增体系得不到产物时, 排除模
板因素外, 应首先考虑 Mg 2+ 浓度[ 13]。dNT P 是
PCR扩增原料, 其浓度直接影响产物产量、特异性
及合成的可靠性,同时对 Mg2+ 浓度有较大影响, 在
较低的 dNT P 浓度下, 导致产率下降, 而浓度过高
时,会产生错误掺入, 并螯合大量的 Mg2+ , 使得没
有足够的 Mg 2+ 来激活酶的活性, 导致扩增产物量
减少,甚至无法得到。据禾本科相关研究报道,通常
dNT P 浓度范 围在 0. 02 ~ 0. 30 mmol/ L 之
间[ 14~ 16] , 与本实验的 dNT P 最佳浓度为 0. 19
mmo l/ L 结果相一致。引物浓度对扩增产生的影响
比较明显,其浓度变化实际上是改变了引物与模板
配对机率,从而影响扩增效率,浓度过低无法扩增,
浓度太高则增加非特异性扩增, 并且产生引物二聚
体,本实验最终确定引物浓度为 0. 5 mol/ L。扩增
缓冲液对 PCR反应的影响相对较小,一般用量无需
进行严格限定, 也在该试验中得到证实。本研究还
发现各反应因子都有一个较理想的扩增范围, 且反
应体系各因子间也存在相互影响,在今后的研究中
需深入探讨。
尽管已有大量有关 RAPD反应体系建立及优
化的报道,对其稳定性也存在争议 [ 17~ 19] , 但本研究
认为 RAPD技术的稳定程度具有可控性,通过针对
某一植物的各反应因子的筛选优化,最终可以获得
稳定性更好的反应体系, 以满足研究需要。
4 结论
4. 1 应用 SDS法提取的基因组总 DNA 原液及稀
释液经电泳检测, DN A条带均较亮,谱带整齐,无弥
散现象,表明提取的 DNA 量较多, 且完整无降解,
可满足实验要求。
4. 2 在初始反应条件的基础上对扩增反应中的各
因子浓度设置梯度, 分别进行单因子优化分析,结果
表明该 RAPDPCR 反应体系对 DNA 模板要求不
严格, 20~ 75 ng / 20 L 均可满足扩增要求, T aq酶
浓度为 0. 5U ~ 2. 0U 时均有扩增条带, M g2+ 适宜
浓度为 2. 5~ 3. 125 mmo l/ L , dNT P 适宜浓度为
0. 19~ 0. 25 mmol/ L, 反应随机引物最适宜的浓度
为 0. 4~ 0. 6 mo l/ L , 而缓冲液浓度对于该扩增体
系无重要影响。
4. 3 在保证扩增结果稳定的基础上,以节约成本为
原则, 经综合分析及验证, 最终获得最佳 RA PD
PCR反应体系为:总反应体积 20 L, 模板 DNA 用
量为 30 ng、DNA 聚合酶用量为 1. 0 U、Mg2+ 浓度
为 2. 5 mmo l/ L、dNT P 浓度为 0. 19 mmo l/ L、引物
浓度为 0. 5 mol/ L、10 buffer 用量为 2. 0 L。
参考文献
[ 1] Welsh J, M cClelland M. Finger print ing genomes us ing PCR
with arbit rary prim ers [ J] . Nucl. Acid Res . , 1990, 18( 24 ) :
72137218
[ 2] Wil liams J K, Kubelik A R, e t al . DNA polym or phisms am
pl ified b y arbit rary prim ers are us eful as genet ic markers [ J ] .
Nucl. Acid Res. , 1990, 18( 22) : 65316535
[ 3] Paran I, M ichelmore R W. Development of reliable PCRbased
mar kers link ed to d ow ny m ildew resistance genes in let tuce
[ J] . Theor. Appl. Genet , 1993, 85: 985993
[ 4] Olson M, H ood L, Cantor C, et a l . A Common Language for
physical mapping of the hum an gen om e [ J ] . S cien ce, 1989,
254: 14341435
[ 5] Brady J L, Scot t N S, T homas M R. DNA typing of hops
( H umulus lup ulu s) th rou gh applicat ion of RAPD and micro
s atellit e m ar ker sequen ces converted to sequen ce tagged site
( STS ) [ J ] . Eu pHyt ica, 1996, 91( 3) : 277284
[ 6] Choi J, Yang G M. PCR condition s for effect ident ifi cat ion of
Kor ean n at ive zoysiagrass ( Zoy sia spp. ) species by DNA pol
ym orphism . Korean Society for Hort icu ltural Scienc, 1996, 37
( 1) : 166170
[ 7] 李亚,佟海英.中华结缕草遗传分化的 RAPD分析 [ J] .广西植
物, 2004, 24( 4) : 345349
[ 8] 郭海林,刘建秀,高鹤,等.结缕草属优良品系 SSR 指纹图谱的
构建[ J] .草业学报, 2007, 16( 2) : 5359
[ 9] Sambrook J, Ru ssel1 D. 黄培堂,译. 分子克隆试验指南.第 3
版[ M ] .北京:科学出版社, 2002: 597623
[ 10] 汪小全,邹喻苹,张大明, 等. RAPD 应用于遗传多样性和系统
学研究中的问题[ J ] .植物学报, 1996, 38( 12) : 954962
[ 11] Clark M S .植物分子生物学 实验手册[ M ] .北京高等教育出
版社,施普林格出版社, 1998. 237243
[ 12] 任瑞支,卢强,徐晓立.提高 RAPD 稳定性的几点经验与探讨
[ J] .生物技术, 2001, 11( 2) : 4041
[ 13] 邹继军,董伟,张志永,等. 大豆 RAPD 影响因素的探讨[ J] . 大
豆科学, 1998, 17( 3) : 197201
[ 14] 陈燕,胡木林, 袁长春. 8个禾本科草坪草品种遗传多样性的
RAPD分析[ J] .亚热带植物科学, 2006, 35( 1) : 58
[ 15] 田志宏,邱永福,严寒,等.用 RAPD标记分析草地早熟禾遗传
多样性[ J] .草地学报, 2006, 14( 2) : 120123
[ 16] 李小雷,于卓,贺鹏程,等. 加拿大披碱草、肥披碱草及其杂种
F1 RAPD 分析[ J] .草地学报, 2008, 16(1) : 2327
[ 17] 袁庆华,桂枝,张文淑.苜蓿基因组 DNA 提取和RAPD反应条
件优选[ J] .草地学报, 2001, 9( 2) : 99105
[ 18] 张菊平,巩振辉,张大过,等.苦瓜 RAPD分析体系的优化研究
[ J] .河南农业大学学报, 2003, 37( 1) : 4953
[ 19] 周章乐,王振英,彭永康. 影响 RAPD 实验结果的稳定性和可
靠性因素研究[ J ] .华北农学报, 2003, 18( 3) : 8183
(责任编辑 李 扬)
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