全 文 ：第 17 卷 第 6 期
Vol. 17 No . 6
草 地 学 报
ACTA AGRESTIA SINICA
2009 年 11 月
Nov. 2009
紫花苜蓿空间诱变突变体筛选及其
RAPD多态性分析(简报)
王 蜜1, 2 , 魏建民1 , 郭慧琴1 , 任卫波2* , 徐 柱2 , 陈立波2
( 1. 内蒙古农业大学生物工程学院, 呼和浩特 010018; 2. 中国农业科学院草原研究所, 呼和浩特 010010)
关键词: 紫花苜蓿; RAPD;遗传多态性;卫星搭载
中图分类号: S812; Q943 文献标识码: A 文章编号 : 10070435( 2009) 06084104
Selection of Space Flight Mutation of Alfalfa and Its Polymorphic Analysis by RAPD
WANG M i1, 2 , WEI Jianmin1 , GU O Huiqin1 , REN Weibo2* , XU Zhu2 , CHEN Libo2
( 1. In st itute of Bioengin eer S cien ce, Inner Mongolia Agricultural University, H uhhot 010018, Inn er Mongolia Au ton om ou s Region , Ch ina;
2. Grass lan d Research Inst itute, CAAS, H uhhot 010010, Inner M ongolia Autonomous Region, Ch ina)
Key words: Alfalfa; RAPD; Space f light ; Polymorphism
空间诱变是利用微重力、高真空、强辐射等因
素,对植物材料进行诱变。与传统物理诱变相比, 因
其具有损伤轻、诱变率高等优点,近些年已成为国内
外研究热点。在经历了空间飞行后,搭载当代的部
分农艺性状与地面对照具有差异, 表现为株高增加、
穗长增加、生育期变化等。并在 SP2 代更加明显,
出现株高增加、生育期变化、叶形、叶色、抗病等多种
变异类型。相关性状在 SP2 代、SP3代表现为强烈
的广谱分离, 一般在 SP4 代以后, 变异性状趋于遗
传稳定[ 1]。白昌军等发现柱花草 ( Sty losanthes
guianensions SW. )经过搭载后出现高产、早花、抗
病等变异,这些变异材料与对照间出现多个基因位
点的多态性,而且多态位点类型可分为 2类: 扩增片
断的增多和减少[ 2]。紫花苜蓿(Medicago sativa L. )
因其具有产量高、营养丰富、生物固氮能力强等优
点,被誉为牧草之王。开展苜蓿空间诱变研究对
加快新品种选育、促进优质饲草生产具有重要意义。
已有研究表明, 空间搭载对紫花苜蓿有较强的诱变
效应。Xu等发现, 紫花苜蓿种子经过卫星搭载后,
其搭载当代叶片的总氨基酸含量、叶片淀粉酶酶带
及活性均发生显著变化[ 3]。进而, 紫花苜蓿经过搭
载后其发芽率无显著变化,但其根尖染色体畸变率、
苗畸变率显著提高,而且在分枝数和鲜重产量上变
化显著[ 4] 。不同基因型间差异显著, 其中肇东苜蓿
诱变敏感性高于龙牧 803[ 5]。目前多数研究主要集
中在搭载当代诱变效应的评价, 有关突变体筛选及
其遗传多态性的研究报道较少。本文以株高为指
标,对卫星搭载苜蓿当代群体进行突变体筛选; 同时
通过 RAPD标记和聚类分析,揭示空间诱变对紫花
苜蓿遗传位点的影响。
1 材料与方法
1. 1 实验材料
供试的 3 个苜蓿品系由新疆大叶、公农 1 号、
WL323、Queen等国内外优良品种, 通过配置多个
杂交组合,以抗寒、高产为目标经过 10年(从 1999年
开始)选育而成,目前各品系的遗传性状基本稳定。
1. 2 卫星搭载处理
将精选后的种子分为 2份: 地面对照( CK)与用
于搭载。将种子封入布袋, 搭载于我国发射实践八
号育种卫星( 2006. 9. 9- 2006. 9. 24)进行空间诱变
处理,飞行时间 15 d[ 6]。返回后, CK与飞行种子均储
藏在 4 冰箱,干燥避光保存。
收稿日期: 20090408;修回日期: 20090625
基金项目: 十一五国家科技支撑计划重点项目( 2008BADB3B04) ; 中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金(中国农业科学院草
原研究所)资助项目
作者简介:王蜜( 1982 ) ,女,内蒙古呼和浩特市人,硕士研究生,研究方向为牧草分子生物学, Email: w angmi1024@ hotmail. com ; * 通讯
作者 Author for correspondence, Email: rppcaucau@ 163. com
草 地 学 报 第 17卷
1. 3 突变体筛选
2008年 5月搭载和对照种子在温室播种育苗。
随后在播种后第 1、2、3、4周共 4次测量株高进行筛
选。突变体筛选标准参照 Wei等的方法[ 7] , 入选标
准为:入选株性状> 对照平均值+ 3倍标准差。选
取 3次以上测量结果达到入选标准的单株为候选变
异株。入选单株编号、授粉、自交, 在自交后代中按
照搭载当代筛选方法,重新进行筛选,统计变异高株
数和遗传分离比例。
入选率= (入选候选单株数/植株总数) 100%
搭载当代变异率= (可遗传变异株数/植株总数) 100%
1. 4 RAPD多态性分析
1.4. 1 药品与仪器 PCR mix(含 dNTP, 1Taq 酶,
Mg2+ )、100 bp DNA ladder购自北京天根公司,随机
引物由奥科公司合成, PCR仪为美国ABI 2720。
1. 4. 2 试验设计 对照随机选取 15株, 单株提取
基因组,等量混合构建地面对照基因池。搭载变异株
单株提取基因组,进行 RAPD多态位点对比分析。
1. 4. 3 基因组 DNA提取及检测 基因组 DNA 提
取方法及质量检测参照文献[ 8]所述进行。
1. 5 PCR扩增程序及其检测
PCR循环程序为下:
PCR产物用含有 EB的 1. 5% 琼脂糖凝胶电泳
检测,其结果用凝胶成像系统观察。
1. 6 数据处理
试验数据用 SPSS 12. 0统计软件进行独立 t检
验;分子标记多态位点及树状图采用 NT sy s 2. 0进
行,聚类分析方法采用非加权组法( U PGMA)进行。
2 结果与分析
2. 1 突变体初步筛选
经过为期苗期 4周的筛选, 初步获得苗期株高
变异株 15株(入选率 3. 4%) , 其株高比对照增加 69
~ 150% (表 1)。
表 1 试验材料及其性状描述
Table 1 Characters descript ion of plant mater ials
编号
No.
品系
Combinat ion
搭载当代性状
Trait s in firs t gen erat ion
后代分离比率(高株变异:正常)
Segregat ion rate in progeny (Mutat ion : Normal)
S 117 品系 1 Combinat ion 株高增加 45~ 72% Incr eased height 45~ 72% 0
S158 品系 1 Combinat ion 株高增加 62~ 98% Incr eased height 62~ 98% 1 2
S164 品系 1 Combinat ion 株高增加 76~ 102% Incr eased height 76~ 102% 2 3
S168 品系 1 Combinat ion 株高增加 64~ 70% Incr eased height 64~ 70% 0
S197 品系 1 Combinat ion 株高增加 58~ 82% Incr eased height 58~ 82% 0
S1104 品系 1 Combinat ion 株高增加 67~ 116% Incr eased height 67~ 116% 0
S1144 品系 1 Combinat ion 株高增加 108~ 150% Increas ed heigh t 108~ 150% 0
S236 品系 2 Combinat ion 株高增加 68~ 91% Incr eased height 68~ 91% 0
S253 品系 2 Combinat ion 株高增加 47~ 69% Incr eased height 47~ 69% 1 3
S273 品系 2 Combinat ion 株高增加 71~ 102% Incr eased height 71~ 102% 0
S2108 品系 2 Combinat ion 株高增加 53~ 67% Incr eased height 53~ 67% 0
S475 品系 4 Combinat ion 株高增加 59~ 68% Incr eased height 59~ 68% 0
S493 品系 4 Combinat ion 株高增加 53~ 69% Incr eased height 53~ 69% 1 4
S4103 品系 4 Combinat ion 株高增加 67~ 114% Incr eased height 67~ 114% 0
S4111 品系 4 Combinat ion 株高增加 55~ 69% Incr eased height 55~ 69% 0
进而,入选 15个单株中有 5株( S158, S164,
S1104, S253和 S493)自交后代的株高性状出现
显著分离,其自交后代中高株变异与表现正常株的比
例在 0. 3~ 0. 6, 并因单株而异。因此, 初步认为这 5
株高株变异为可遗传变异,可遗传变异率达 1. 1%。
2. 3 RAPD多态性分析
在测试的 20 条随机引物中, 除 OP9和 OP18
外,其余 18条引物均可扩增出稳定、清晰的条带,产
生条带的引物比为 90% (图 1)。18 条引物产生的
总条带数为 142条, 其中平均多态性条带 94条,多
态带率 65. 6%。所有引物产生的条带数目有 6- 11
条不等, 平均为 7. 9, 大小在 500 bp~ 2000 bp。3个
品系间多态带数与多态带率存在差异。品系 1
( 103, 71%) 的多态带率最高, 品系 2 最低 ( 82,
58%) , 品系 4居中( 98, 69%)。
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第 6期 王蜜等:紫花苜蓿空间诱变突变体筛选及其 RAPD多态性分析(简报)
图 1 引物 OP1 扩增结果
Fig. 1 PCR results of primer OP1
注: 1 品系 1对照; 28为品系 1搭载变异株; 10 品系 2对照; 1114为品系 2搭载变异株; 15 品系四对照; 1619为品系
4搭载变异株; 20 阴性对照(模板为水) ; M 为 DNAmarker,其条带大小从上到下分别为 1500, 1000, 900, 800 bp
Note: 1 Gr ou nd Cont rol of com bination 1; 28 space mu tat ion individuals from comb inat ion 1; 10 Ground Cont rol of combinat ion
2; 1114 space mutat ion individuals f rom combinat ion 2; 15 Ground Cont rol of combinat ion 4; 1619 space mutation individu als
f rom combinat ion 4; 20 negat ive cont rol ( t emplate: w ater) ; M r epresen ts DNA m ark er, the ladders ( updow n) : 1500, 1000, 900, 800 bp
表 2 RAPD 引物序列及 PCR结果
T able 2 Sequence of RAPD primer s and their PCR results
引物编号
N o.
引物( 53 )
Primers( 53 )
扩增条带
Am plif ied
bands
品系 1
Combin at ion 1
多态带数
Polymorphic
bands
多态百分比( % )
Percentage of
polymorphic bands
品系 2
C om bination 2
多态带数
Polymorphic
bands
多态百分比( % )
Percentage of
polymorphic bands
品系 4
Comb inat ion 4
多态带数
Polym or phic
ban ds
多态百分比( % )
Percentag e of
polymorp hic ban ds
Op1 CCAGCT TAGG 8 6 75. 0 4 50. 0 3 37. 5
Op2 GAACACTGGG 11 9 81. 8 2 18. 2 8 72. 7
Op3 CCCGCT ACAC 7 6 85. 7 5 71. 4 7 100. 0
Op4 ACCGCCT GCT 6 2 33. 3 1 16. 7 1 16. 7
Op5 CCGTGACT CA 7 6 85. 7 5 71. 4 5 71. 4
Op6 T CT GT T CCCC 6 6 100 5 83. 3 4 66. 7
Op7 AGGGT CGTT C 10 8 80. 0 5 50. 0 8 80. 0
Op8 CACCAT CCGT 9 6 66. 7 7 77. 8 8 88. 9
Op10 ACGT AGCGT C 7 4 57. 1 3 42. 9 2 28. 6
Op11 CCACGGGA AG 11 9 81. 8 6 54. 5 6 54. 5
Op12 TCCCACGCAA 10 7 70. 0 8 80. 0 8 80. 0
Op13 GT CAGAGT CC 9 7 77. 8 6 66. 7 7 77. 8
Op14 TCGGCGGT T C 9 7 77. 8 8 88. 9 7 77. 8
Op15 ACACACGCTG 5 2 40. 0 3 60. 0 4 80. 0
Op16 CCCCGGTAAC 7 6 85. 7 3 42. 9 6 85. 7
Op17 ACATCGCCCA 7 5 71. 4 4 57. 1 4 57. 1
Op19 GGT CACCT CA 6 2 33. 3 3 50. 0 6 100. 0
Op20 CCGCGTCT TG 7 5 71. 4 4 57. 1 4 57. 1
总计
T otal
142 103 82 98
平均值
( Average)
7. 9 5. 7 70. 8 4. 6 57. 7 5. 4 68. 5
2. 4 空间诱变变异材料的聚类分析
18份苜蓿材料间的相似系数为 0. 66~ 0. 80。
依相似系数 0. 684的水平,将供试的 18份材料分为
4个类群(图 3) :
类群 : C1(品系 1对照)、22( S1144)、16( S1
17)、68( S4103)
类群: 21( S1104)、67( S493)
类群: C2(品系 2对照)、C4(品系 4对照)、19
( S168)、20 ( S197)、48( S273)、49( S236)、46
( S2108)、69( S4111)、66( S475)
类群: 17( S253)、18( S158)、47( S164)
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草 地 学 报 第 17卷
图 2 供试紫花苜蓿材料的聚类分析树状图
F ig . 2 T ree diag rams of 18 alfalfa tested mater ials
聚类分析结果表明, 品系 2与品系 4对照聚在
类群 ,品系 1对照聚在类群 ,这可能是因为品系
2是从品系 4群体中进一步选育而成, 因此其亲缘
关系较近。5个可遗传变异株分别被聚在第 、
类,说明苜蓿种子经过空间搭载后,部分单株的遗传
位点发生较大变化。其余 10个搭载株中,大部分单
株( 7株, 70% )都聚在相应的对照类群中,说明这些
单株的高株表现可能是由生理损伤引起的, 其遗传
位点并未发生显著改变。而 S4103、S168、S197
例外,其原因可能是存在其他形式的变异(如生理生
化方面) , 但是未被观测或检测出来。
3 讨论
3. 1 紫花苜蓿经过卫星搭载后,在其搭载当代中初
步筛选获得 15个候选变异单株。通过株系自交鉴
定,其中 5个单株的株高变异性状是可遗传的,搭载
当代的可遗传变异率达 1. 1%。这一变异率低于已
有的报道。Mei等研究发现, 以叶条纹单一性状为
指标,玉米种子的诱变率为 4. 6% [ 8] 。其原因可能
是诱变材料的体积差异造成的。玉米种子的体积远
大于苜蓿种子, 因此玉米种子在空间飞行过程中被
宇宙重粒子击中的概率也大于苜蓿种子。吕兑财等
研究发现在同一次搭载过程中,大粒种子如玉米, 有
近 90%的种子被宇宙粒子击中种胚,而小种子拟南
芥不到 14%左右[ 6] 。被宇宙重粒子击中胚的概率
差异可能导致诱变率的差异。同时可遗传株自交后
代中高株突变的出现概率介于 0. 3- 0. 6之间, 差异
较大,可能与株高性状为多基因控制的数量遗传性
状,因此其突变位点在遗传分离时表现性状较为复
杂有关。具体诱变遗传稳定性及其机理有待进一步
深入研究。
3. 2 聚类结果与变异性状具有较好的相关性。供
试 18份材料可聚为 4 类。对照主要聚在第 1, 3类
群,其中品系 2, 品系 4 的对照聚在同一类群, 结合
已有的结果,说明聚类结果较好地反应对照间亲缘
关系。聚在第 2, 4类群的为 5 份诱变材料,而且在
这 5份变异材料的自交后代中, 株高变异性状出现
不同程度的分离。
4 结论
4. 1 卫星搭载对紫花苜蓿株高有显著影响,通过选
择,可获得株高增加 60~ 100%的可遗传高株变异株。
4. 2 依相似系数 0. 684 的水平, 供试 18 份材料被
分为 4个类群,部分搭载变异株与其对照分别被聚
在不同类群,说明经过卫星搭载后,部分紫花苜蓿的
遗传位点发生较大改变。
参考文献
[ 1] 任卫波,韩建国,张蕴薇,等. 航天育种研究进展及其在草上的
应用前景[ J] . 中国草地学报, 2006, 28( 5) : 9197
[ 2] 白昌军, 刘国道,姚庆群,等. 太空搭载 热研 2号 柱花草后
代 RAPD多态性分析[ J ] . 草地学报, 2008, 16( 4) : 336340
[ 3] Xu Y Y, Jia F, Wang B, et al . . Changes in isoenzymes an d a
mino acids in forage an d germin at ion of th e f irst post fli ght
gen erat ion of s eeds of th ree legume species after space fli ght
[ J] . Gras s and forage sciences, 1999, 54: 371375
[ 4] 任卫波, 徐柱,陈立波,等. 紫花苜蓿种子卫星搭载后其根尖
细胞的生物学效应[ J] . 核农学报, 2008, 22( 5) : 566568
[ 5] 尚晨,张月学,唐凤兰,等.高能混合粒子场和 r 射线对紫花苜
蓿的诱变效应[ J] .草地学报, 2008, 16( 2) : 125128
[ 6] 吕兑财,黄增信,赵亚丽,等. 实践八号育种卫星搭载植物种子
的空间辐射剂量分析[ J] . 核农学报, 2008, 22( 1) : 58
[ 7] Wei L J, Xu J L, Wang J M , et al . . A comparative study on
mutagenic effect s of s pace flig ht and irradiat ion of rays on
rice[ J] . Agricultural S ciences in China, 2006, 5( 11) : 812819
[ 8] 袁庆华,桂枝,张文淑. 苜蓿基因组 DNA 提取和 RAPD 反应
条件优化[ J] . 草地学报, 2001, 9( 2) : 99105
(责任编辑 刘敏轩 李 扬)
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