全 文 ：文章编号: 1007-0435( 2002) 01-0018-06
紫花苜蓿 RAPD反应条件优化
孙　杰1, 杨青川2, 韩国栋3
( 1 赤峰农牧学校, 赤峰 024031; 2 中国农业科学院畜牧研究所, 北京 100094;
3 内蒙古农业大学生态环境学院, 呼和浩特 010018)
摘要: 以“中苜一号”、“大西洋”、“渭南”3 个苜蓿品种为材料,对 RAPD 反应条件中的 M gCl2浓度、dNT P浓度、随
机引物浓度、模板DNA 用量、TaqDNA 聚合酶用量以及扩增缓冲液浓度分别进行梯度试验。结果表明,该反应体系
的体积为 25
L , MgCl2浓度为 2. 7 m mol/ L , dNTP 浓度为 150
mo l/ L ,随机引物浓度为 0. 192
m ol/ L , T aqDNA
聚合酶用量为每一反应体系 2U , 扩增缓冲液浓度(以 KCl浓度为指标)为 50 mmo l/ L ,模板 DNA 用量为 120 ng。通
过试验建立了一套稳定的 RAPD 反应体系。该反应体系扩增效果好。
关键词: 苜蓿; RAPD ; 扩增反应; 优化
中图分类号: S541; Q943　　文献标识码: A
Optimalization of RAPD Reaction System for Alfalfa
SUN Jie
1, YANG Qing-chuan
2, HAN Guo-dong
3
( 1 Ag r icultur al Polytechnic colleg e, Chifeng 024031 China ; 2 Inst itute o f Animal Science, CAAS, Beijing 100094 China;
3 Eco lo gical Environment Co lleg e of Inner M onglia Ag ricultural Univ ersity, Huhhot 010018 China)
Abstract: T hree species of alfalfa are used as the mater ials of ex tr act ing DNA in this exper iment , they are
the Zhongmu number one、Wei nan、Atlantic ocean. The exper iment step to the concentr at ion of M gCl2 ,
dNT P, random primers, template DNA, TaqDNA polymerase and buffer on RAPD are conduced。Then a
stable react ion system of RAPD is set up. In the optimalizat ion o f RAPD sy stem w ith totale vo lume of 25

L including MgCl2 at 2. 7 mmol/ L , dNT P at 150. 0
mol/ L, random primer at 0. 192
mol/ L, TaqDNA
po lymerase at 2 u/ 25 uL, buf fer at 50. 0 mmol/ L and 120. 0ng template DNA. T he effect of amplif ing w ith
the reaction system is the most opt imal.
Key words : Alfal fa; RAPD; Amplifed react ion; Optimal izat ion
　 　 RA PD ( Random Amplif ied Po lymorphic
DNA )因其试验方法简单,对 DNA 多态性检测效率
高而逐渐被用于基因的定位,遗传作图等方面[ 1]。但
由于其结果稳定性较差,因此,必须对反应条件进行
筛选优化,以提高反应结果的稳定程度,最大限度地
降低其随机性 [ 2]。本实验以“中苜一号”耐盐苜蓿,大
西洋和渭南两个敏盐苜蓿为试验材料,旨在建立一
个稳定的 RADP 反应体系, 为后续实验结果的稳定
性、可信性提供保证。
1　材料与方法
1. 1　供试材料
中苜一号 ( Medicago sat iva L. cv . “Zhongmu
No . 1”)耐盐苜蓿品种由中国农业科学院畜牧研究
所提供。大西洋 (M edicago sat iva L. cv. A tlant ic
o cean) ,引自美国,和渭南苜蓿(M edicago sat iva L.
f rom Weinan shanxi province)引自于陕西渭南, 二
者为敏盐苜蓿品种。试验中所用的随机引物为
OPEROR公司产品。
收稿日期: 2001-07-05; 修回日期: 2001-10-11
　　基金项目: 国家自然科学基金项目( 39870560)资助。
　　作者简介: 孙杰( 1962-) ,女,内蒙古自治区赤峰农牧学校讲师,主讲饲料生产学。现为内蒙古农业大学在职硕士生,在中国农业科学院畜
牧所参加紫花苜蓿耐盐遗传育种研究。
第 10卷　第 1期
　Vo l. 10　　No. 1
草　地　学　报
ACT A AGRESTIA SIN ICA
　2002 年　3月
March 　2002
1. 2　试验仪器及药品
随机引物及 dNT P 购于鼎国公司, T aqDNA 聚
合酶购于华绿渊公司, 1 kb DNA Ladder 购于 MBI
公司。PCR仪为 050-406PC48型。电泳仪及电泳槽
均由北京六一厂生产。
1. 3　基因组 DNA提取
1. 3. 1　在供试 3 个苜蓿品种的群体中, 随机抽取
10 株进行 DNA 提取, 再等量加以混合, 建成 3个
DNA 池备用。
1. 3. 2　试验采用 CTA B 法, 从苜蓿叶片提取
DNA。取叶片 3 g, 放入液氮研磨,加入预热至 65℃
的 2×CTAB ( 2% CT AB、2 mol/ L t ris HCl、0. 5
mol/ L EDTA、5 mol / L NaCl )提取液 900 uL, 在
65℃水浴 15至 20 min, 冷却后加入 500 uL 氯仿∶
异戊醇 ( 24∶1)在 6000～8000 rp/ min 下离心 10
m in, 取上清液, 加入 1/ 10 体积的 3 mol/ L 醋酸钠
和等体积的异丙醇,摇匀至出现絮状沉淀,在 12 000
r p/ m in 下离心 5 m in, 倒掉上清液, 用 75%酒精清
洗,室温干燥 1 h 后溶于 TE 缓冲液保存备用。
1. 3. 3　3个苜蓿品种的 DNA 样品分别编号为: 中
苜一号—AL 1、大西洋—AL 2、渭南—AL 3。
1. 4　试验设计
在其它因子保持不变的情况下, 按一定梯度变
化单一因子,筛选最优条件。采用热循环程序为:
反应体积为 25
L,分别对 6个因子进行使用浓度
或用量梯度试验, 筛选最优化组合[ 3, 4]。
1. 4. 1　单因子浓度用量梯度试验(表 1)
1. 4. 2　dNT P 与 Mg 2+ 不同浓度梯度配合下的反应
效果检验　为了找出 dNTP 与 Mg2+ 最佳的浓度配
合, 在单因子试验基础上, 设计二因子试验。其中
Mg 2+设 2. 4、2. 7、3. 0 mmol / L 3个浓度。dNTP 设
100
mol/ L、150
mol/ L、200
mol/ L 3个浓度, 随
机组合成 9 个二因子处理试验(表 2) , 经扩增以后
检查效果。
表 1　试验因子处理
Table 1　Each trea tment of experiment al facto rs
试验因子
Ex perim ental factors
因子处理
T reatmen ts of experimental factors
试验用引物和 DNA
Used DNA and prim er in th e exp eriment
MgCl 2(m mol/ L) 1. 8、2. 1、2. 4、2. 7、3. 0 OPD-20　AL1
扩增缓冲液( KC l) mmol / L
Buf fer on RAPD( KCl )mmol/ L
40. 0、50. 0、60. 0、70. 0、80. 0 OPA-19　AL2
dNTP(
mol/ L) 50. 0、100. 0、150. 0、200. 0 OPA-10　AL1
TaqDNA 聚合酶( U / 25 uL )
TaqDNApolymer ase( U/ 25uL )
0. 5、1. 0、1. 5、2. 0、2. 5 OPD-18　AL3
模板 DNA( ng )
Template DNA( ng)
60. 0、120. 0、180. 0、240. 0、300. 0 OPG-17　AL 1
引物(
mol/ L)
Random primers(
mol/ L) 0. 0952、0. 152、0. 224、0. 288、0. 352 OPA-3　AL 1
表 2　dNTP 与Mg2+ 浓度组合
T able 2　Differ ent tr eatment of dNTP and Mg 2+ concentr ation
dNTP 浓度
Concent rat ion of dNTP
M g2+ 不同浓度处理
Dif ferent t reatments of Mg2+ concent rat ion
处理编号
The number of t reatments
2. 4 mmol/ L ( 1)
100. 0
m ol/ L 2. 7 mmol/ L ( 2)
3. 0 mmol/ L ( 3)
2. 4 mmol/ L ( 4)
150. 0
m ol/ L 2. 7 mmol/ L ( 5)
3. 0 mmol/ L ( 6)
2. 4 mmol/ L ( 7)
200. 0
m ol/ L 2. 7 mmol/ L ( 8)
3. 0 mmol/ L ( 9)
19第 1期 孙杰等:紫花苜蓿 RAPD 反应条件优化
1. 4. 3　反应体系稳定性与谱带丰富程度的检验　
将随机组合反应体系与优化组合反应体系进行对比
试验,各重复两次(表 3)。
表 3　供试因子浓度用量
Table 3　Vo lume of each facto r concentr ation in two r eact ional systems
因子
Factors
随机组合体系因子用量(
L)
Volume of each factor in r andom com binational sys tem
优化体系组合因子用量(
L)
Volume of each factor in opt imalizat ional s ystem
ddH2O 15. 85 16. 125
扩增缓冲液
Am plifed buf fer
3. 0 2. 5
M gCl2 4. 0 4. 5
dNTP 0. 25 0. 375
T aqDNA 聚合酶
T aqDNA polymeras e
0. 4 0. 4
DNA 模板
T emplate DNA
1. 0 0. 5
引物
Random primer s
0. 5 0. 6
重复次数
T he numbers of repeat
2 2
备注
Notes:
两体系所用引物均为 N 组的OPN-2、OPN-11所用模板 DNA 为AL 1、AL 2、AL3
T he OPN-2　OPN-11 of N group and AL1 AL2 AL3 of template DNA are used in tw o system
2　结果与分析
2. 1　MgCl2浓度筛选
2. 1. 1　5个处理均有谱带产生, 但第 1、2处理所产
生谱带少且不清楚,处理 3谱带开始增多, 但模糊不
清, 处理 4、5 谱带多且清晰 (见图 1 中 10～14 泳
道)。结果表明,随着 MgCl2 浓度的增加,扩增产物
有所增加,谱带增多且逐渐变得清晰。
2. 1. 2　MgCl 2 浓度在 2. 4～3. 0 mmol/ L 各处理
间, 扩增产物差别不明显, 说明 MgCl2 浓度在
RAPD扩增体系中是有一定取值范围, 如果 MgCl2
浓度适当, 则扩增效果都比较好。本试验 MgCl2适
宜浓度为 2. 4～3. 0 mmol/ L。
2. 2　扩增缓冲液浓度筛选
扩增产物经电泳后, 5 个处理均有谱带产生
(图 1　3～7泳道谱带) ,其中第 2 处理谱带清楚且
较亮, 第 1、3处理谱带较淡、不清楚,第 4处理谱带
开始减少,第 5处理只有一条浅带出现。在扩增反应
中, M g2+ 和一价离子的浓度与性质对 TaqDNA 聚
合酶的活性具有较大影响。适量 KCl浓度能促进
TaqDNA 聚合酶的合成速度, 试验中第 2处理就表
现出较理想的试验效果。同时, 随着 KCl浓度的增
加, TaqDAN 聚合酶的活性则受到抑制, 扩增反应
受到影响。试验中第4、5处理扩增结果与此相吻合。
2. 3　dNTP浓度筛选
4个处理均有谱带出现(图 2　3～6泳道扩增
产物)。其中第 1处理谱带少且不清楚,第 2、3处理
谱带增多而清晰, 该试验结果反应出 dNT P 在扩增
反应中的作用。如果 dNT P 量不足, 将限制扩增产
物的生成, 如处理1则出现带弱及带少的情况。试验
以第 3、4处理效果较好。
2. 4　TaqDNA聚合酶用量筛选
5 个处理均有谱带产生(图 2　9～13泳道谱
带) , 其中第 1处理的谱带不清楚, 从第 2～5处理谱
带变得清楚且带数相同, 经比较以第 4 处理效果最
好。TaqDNA 聚合酶是扩增反应的催化剂,如果反
应体系中酶的用量太少, 则导致整个扩增反应不够
充分。正如试验处理 1的效果所示, 在紫外灯下观
察, 少量的扩增产物, 使谱带显得比较暗淡。随着
T aqDN A 聚合酶用量的增加, 扩增产物有所增加,
但达到一定程度后(处理 4所表现的情况)酶的用量
再增加,反应结果则无明显的变化。在保证试验效果
的前提下,考虑到成本, 本试验适宜的 T aqDNA 聚
合酶用量为2. 0 U / 25
L。
20 草　地　学　报 第 10卷
图 1　MgCl2和扩增缓冲液浓度与扩增效果
Fig. 1　T he amplified effects of M gCl2 and buffer under differ ent concentr ation st eps
3～7道KCl 40. 0 mmol / L、50. 0 mm ol/ L、60. 0 mmol/ L、70. 0 mmol/ L、80. 0 mmol / L
3～7 roads KCl 40. 0 mmol/ L、50. 0 mmol/ L、60. 0 mmol / L、70. 0 mm ol/ L、80. 0 mmol/ L
8道、15道 Marker 1Kb DNA Ladder
8 road、15 r oad Marker 1Kb DNA Ladder
10～14道 MgC l2 1. 8 mm ol/ L、2. 1 mmol/ L、2. 4 mmol /L、2. 7 mm ol / L、3. 0 mmol/ L
10～14 roads MgCl 2 1. 8 mmol / L、2. 1 mmol/ L、2. 4 mmol/ L、2. 7 mmol / L、3. 0 mm ol / L
2. 5　模板 DNA用量筛选
5 个处理均有谱带出现(图 3　2～6泳道) , 其
中以处理 2效果最好。过多的 DNA 用量一方面将
增加小片段物质对试验效果的影响,使制片背景变
得模糊不清。另一方面则导致游离的 Mg 2+ 与模板
结合, 从而影响 Mg2+ 对酶的激活作用,使试验结果
不稳定 [ 5]。试验中较适宜的模板 DNA 用量为
120 ng/ 25
L。
2. 6　引物浓度筛选
DNA 扩增是在引物的引导下,以材料 DNA 为
模板,产生互补链的过程。如反应体系中引物浓度过
低, 有可能降低引物在 DNA 模板上特定位点结合
的机率, 从而降低特异性谱带的检出率。在处 1出
现带少、模糊、不丰富等情况,随着引物浓度的增加,
如处理 2、3,情况则有所不同(图 3)。但引物浓度的
增加,应在适度范围之内,否则将出现因引物浓度过
高而抑制反应速度。试验引物适宜浓度为 0. 152～
0. 224
mo l/ L 之间。
2. 7　dNTP与Mg2+不同浓度梯度配合下的反应效
果检验
通过对 dNTP 和 Mg 2+双因子不同浓度下的 9
个组合进行扩增(图 4) ,电泳后处理 1～9均有谱带
生成,但在处理 1、2、3中都缺少 3500 bp 的带,此带
从处理 4、5开始出现, 但在6 中消失, 在处理 7、8、9
中较清楚。比较9个处理后发现,处理5同处理7、8、9
之间无显著差异,而且较高的Mg2+ 浓度必须与高浓度
的dNTP 配合才能表现出较好的效果,这在处理 6和
处理 9 中可得到验证。这可能和 dNT P 浓度决定
T aqDN A 聚合酶在反应中所需要 Mg2+ 确切浓度有
关。本试验的dNT P 与Mg 2+最佳浓度组合是: dNT P
150. 0
mo l/ L、Mg 2+ 2. 7 mmol / L。
21第 1期 孙杰等:紫花苜蓿 RAPD 反应条件优化
图 2　不同 dNTP 及 TaqDNA 聚合酶浓度与扩增效果
F ig . 2　The amplified effect s o f dNT P and T aqDNA polymerase under differ ent concent rat ion steps
3～6道 dN T P 50. 0
mol/ L、100. 0
mol/ L、150. 0
mol / L、200. 0
m ol/ L
3～6 roads dNT P 50. 0
mol/ L、100. 0
mol /L、150. 0
m ol / L、200. 0
mol/ L
9～13道 T aqDNA 酶 0. 5 U/ 25
L、1. 0 U / 25
L、1. 5 U/ 25
L、2. 0 U/ 25
L、2. 5 U / 25
L
9～13 roads T aqDNA polymerase 0. 5 U/ 25
L、1. 0 U/ 25
L、1. 5 U / 25
L、2. 0 U /25
L、2. 5 U/ 25
L
7、14道 Markers 1Kb DNA Ladder
7、14 roads Markers 1 Kb DNA Ladder
图 3　引物与模板 DNA 用量与扩增效果
F ig . 3　The amplified effect s o f prim er and template DNA under different concentr ational steps
2～6道 DNA 60. 0 ng、120. 0 n g、180. 0 ng、240. 0 ng、300. 0 ng
2～6 roads DNA 60. 0 n g、120. 0 ng、180. 0 ng、240. 0 ng、300. 0 n g
9～13道引物 0. 0952
mol/ L、0. 152
mol/ L、0. 224
mol/ L、0. 288
mol /L、0. 352
m ol / L
9～13 roads primer 0. 0952
mol/ L、0. 152
mol / L、0. 224
m ol/ L、0. 288
mol/ L、0. 352
mol/ L
7、14道 Markers　1 Kb DNA Laader
7、14 roads Marker s　1 Kb DNA Laader
22 草　地　学　报 第 10卷
图 4　不同 dNTP 和Mg2+浓度与扩增效果
F ig . 4　The amplified effects o f nine g r oups on dNTP and Mg 2+ under differ ent concentr ation combination
3道 Marker 1Kb DNA L adder　　　4～12道分别为处理 1～9
3 road Mark er 1Kb DNA Ladder　　4～12 roads are exper iments 1～9
　
2. 8　反应体系稳定性和谱带丰富度检验
随机组合反应体系与优化后反应体系比较,经
优化筛选的反应体系明显地稳定于随机组合的反应
体系,但在谱带的丰富程度方面,两个体系间无明显
差异(表 2)。
3　讨论
3. 1　非特异性谱带的稳定出现是反应体系稳定的
直接表现
在 RAPD 反应中, 任一特定的引物与基因组
DNA 序列有其特定的结合位点, 这些特定的结合位
点在基因组某些区域的分布必须满足 PCR 扩增反
应条件, 才能扩增出DNA 片段。即引物在模板的两
条链上有互补位置, 且引物 3′端相距在一定的长度
范围之内, 才可保证 DNA 片段的延伸,并使错配碱
基得到及时纠正。由于该条件的限制,在模板 DNA
链上,可与引物结合的特定位点数目大大降低, 由此
而产生的谱带,无论是特异性的或非特异性的, 其数
目应该是一定的。多数学者认为,建立一个抑制非特
异性谱带产生的反应体系,是顺利检出特异性谱带
的关键。笔者认为,在 RA PD反应中,无非特异性谱
带产生是不可能的,与其限制非特异性谱带的产生,
不如满足反应条件,因势力导,使非特异性谱带稳定
出现,从而提高产生特异性谱带的机率。这样的反应
体系应该是稳定的, 特异性谱带检出率是非常高的。
3. 2　RAPD稳定程度的可控性
无论是每次的优化条件试验, 还是优化的
RAPD 反应体系试验都可以表现出较高的稳定性,
可能有如下原因: ( 1)体系自身所具有的稳定性, 保
证了试验结果的重演性; ( 2)试验过程中,操作人员
的固定与操作程序的稳定也是一个不可忽视的重要
因素; ( 3)体系中各因子浓度或用量的最大满足, 可
以使引物与模板 DNA 的结合达到最饱满的程度,
从而限制了多态性 DNA 随机出现的机率, 使多态
性 DNA 检出率有所提高。
参考文献
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展, 1998, ( 3) : 12～18
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育出版社,施普林格出版社, 1998. 237～243
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北农业大学学报, 2000, ( 2) : 1～7
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23第 1期 孙杰等:紫花苜蓿 RAPD 反应条件优化