全 文 ：第21卷 第2期
Vol.21 No.2
草 地 学 报
ACTA AGRESTIA SINICA
2013年 3月
Mar. 2013
doi:10.11733/j.issn.1007-0435.2013.02.026
紫花苜蓿MsRBP基因的克隆、分析及烟草的遗传转化
王慧敏1,龙瑞才3,沈益新1,康俊梅2,张铁军2,张 瑜1,杨青川1,2∗
(1.南京农业大学动物科技学院,江苏 南京 210095;2.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,北京 100094;
3.重庆大学农学及生命科学研究院,重庆 400044)
摘要:采用RACE技术以一段紫花苜蓿(Medicagosativa)盐诱导基因的EST(expressedsequencetag)序列为模板
设计引物克隆此基因的全长序列。序列分析结果表明,该基因全长1551bp,包含一个1230bp的最大开放阅读框,
编码409个氨基酸,包含3个 RNA结合蛋白结构域(RRMdomain),命名为 MsRBP (GenBankaccessionNo.
JN986878.1)。亚细胞定位分析表明此基因编码蛋白定位于细胞核。经同源比对和进化树分析,MsRBP基因编码
的氨基酸序列与截形苜蓿(Medicagotruncatula)、大豆(Glycinemax)、拟南芥(Arabidopsisthaliana)等物种中的
某些RNA结合蛋白的氨基酸序列具有很高的相似性。RT-PCR(Real-timePCR)分析结果表明,在NaCl,ABA和
PEG胁迫下MsRBP基因的表达水平均上调,推测该基因可能在紫花苜蓿逆境胁迫调控中发挥重要作用。经构建
植物超表达载体pBI21-MsRBP,采用农杆菌介导法对烟草(Nicotianatabacum)进行遗传转化,获得了抗性转化再
生植株。通过PCR,RT-PCR及GUS组织化学染色分析表明:MsRBP基因在烟草的基因组中能够进行转录和表
达。本研究为该基因的功能鉴定与调控机制研究奠定了基础。
关键词:紫花苜蓿;RNA结合蛋白;实时定量RT-PCR;表达分析;烟草转化
中图分类号:Q943.2 文献标识码:A 文章编号:1007-0435(2013)02-0379-09
CloningofanRNA-bindingProteinGenefromAlfalfaandExpressioninTobacco
WANGHui-min1,LONGRui-cai3,SHENYi-xin1,KANGJun-mei2,
ZHANGTie-jun2,ZHANGYu1,YANGQing-chuan1,2∗
(1.ColegeofAnimalScienceandTechnology,Nanjing,AgricultureUniversity,Nanjing,JiangsuProvince210095,China;
2.InstituteofAnimalScience,CAAS,Beijing100094,China;3.InstituteofAgriculture
andLifeScience,ChongqingUniversity,Chongqing400044,China)
Abstract:BasedonanexpressedsequencetagofMedicagosativaL.,afullengthof1551bpcDNAwasi-
solatedusingRT-PCRandRACE-PCRtechniques.ThegenewasnamedMsRBP(GenBankaccessionNo.
JN986878.1).SequenceanalysisrevealedthatMsRBPcontainedamaximumopenreadingframeof1230
bpandencodeda409aminoacidsprotein.TheputativeaminoacidsequencehadhighidentitywithRNA
bindingproteinsfromMedicagotruncatula,Glycinemax,andArabidopsisthaliana.Real-timequantita-
tivePCRshowedthatthetranscriptionlevelofMsRBPwasup-regulatedinNaCl,ABA,andPEGstress
treatments.ItindicatedthatMsRBPprobablyplayedanimportantroleinthetoleranceofabioticstress.
MsRBPgenewastransferredintotobaccowithleafdiscmethodbyAgrobacteriumLBA4404andexpressed
underthecontrolofCaMV35Spromoter.ThetransgenicplantswereselectedonMSmediumsupplemen-
tedwithkanamycinandanalyzedbyPCR,RT-PCRandGUSassay.TheseresultsshowedthatMsRBP
wasintegratedintotobaccogenomeandexpressedintransgenictobacco.
Keywords:Alfalfa;RNAbindingprotein(RBP);Real-timeRT-PCR;Expressionanalysis;Tobaccotransformation
RNA结合蛋白(RNA-bindingproteins,RBPs)
是一类在RNA加工过程中起重要作用的蛋白,普
遍存在于各种生物体中。RNA加工过程主要包括
mRNA前体的剪接(pre-mRNAsplicing)、mRNA
5′端的加帽(capping)、mRNA的3′端合成多聚腺
苷酸(PolyA)尾(polyadenylation)、mRNA的转运、
收稿日期:2012-11-02;修回日期:2012-12-10
基金项目:“十二五”国家科技支撑计划项目(2011BAD17B01-01-3)资助
作者简介:王慧敏(1986-),女,山东聊城人,硕士研究生,研究方向为牧草及草坪草育种,E-mail:maohai_1201@163.com;∗通信作者 Au-
thorforcorrespondence,E-mail:qchyang66@yahoo.com.cn
草 地 学 报 第21卷
mRNA稳定和翻译等[1-2],这些过程都需要通过
RBPs直接或间接的调控来完成。植物中具有多种
不同结构和功能的RBPs。在已知的RBPs中,研究
最多的一类是具有RNA识别基序(RNArecogni-
tionmotif,RRM)的 RBPs[3]。在结构上,RRM 约
由90个氨基酸组成,中间有2段RNA结合活性所
必需的保守序列,分别被定义为 RNP1和 RNP2。
RNPl有8个保守的氨基酸残基,主要由芳香族和
带正电荷的氨基端组成,序列为(K/R)G(F/Y)(G/
A)FVX(F/Y);RNP2含6个保守的氨基酸残基,
序列为 (L/I)(F/Y)(V/I)(G/K)(G/N)L。对不同
的蛋白质而言,RRM的数量从1个到4个不等[1]。
目前,已从水稻(Oryzasativa)[4-5]、拟南芥
(Arabidopsisthaliana)[4,6-12]、玉 米 (Zeamays)
[13]、烟草(Nicotianatabacum)[14-15]、菜豆(Phaseo-
lusvulgaris)[16]、蚕豆(Viciafaba)[17]、二色补血草
(Limoniumbicolor)[18]等植物中克隆得到了多种
RNA结合蛋白基因,并推测RBPs基因可能参与一
些重要的生理防御过程。大量研究表明,RBPs基
因的表达受多种环境因素的诱导[5,7-20],进而参与植
物对多种逆境胁迫的应答。低温、高温、干旱、水涝、
机械损伤、盐胁迫、外源脱落酸(ABA)或水杨酸
(SA)处理等条件均可以使某些RBPs的 mRNA表
达水平明显提高,从而增强植物对逆境胁迫的耐受
性。例如:Ayarpadikannan等[19]在200mM NaCl
处理条件下从碱蓬(Suaedaheteroptera)中筛选出
了SaDhn和SaRBP1基因,酵母过表达SaDhn和
SaRBP1基因后,对渗透胁迫、冷害和热激胁迫的抗
性增强;Kim 等[4]研究指出低温胁迫下,水稻中
OsGRPs表达量升高;而拟南芥grp7突变体表现出
对低温敏感。这些结果表明RNA结合蛋白在植物
逆境应激调控过程中发挥着重要作用。因此,克隆
并验证苜蓿(Medicagosativa)RNA结合蛋白基因
功能将为解析苜蓿抗逆的分子机理及通过分子育种
或基因工程的方法提高苜蓿的抗逆性有重要意义。
但至今尚未见有关紫花苜蓿RNA结合蛋白基因及
其参与逆境胁迫调控的研究报道。
本研究以耐盐苜蓿品种中苜一号(Zhongmu
No.1)为材料,以 EST 序列(GenBankaccession
No.FE896907.1)为模板设计引物,通过PCR和
RACE技术克隆得到紫花苜蓿中编码RNA结合蛋
白基因的全长cDNA序列,并对其进行生物信息学
分析、亚细胞定位、基因表达分析和转基因研究,为
进一步了解该基因的结构、功能及其参与逆境调控
机制和深入揭示紫花苜蓿耐逆调控机理奠定基础,
也为该基因在苜蓿抗逆性分子育种中的应用积累了
基础资料。
1 材料与方法
1.1 材料
植物材料:耐盐苜蓿品种中苜一号种子,野生型
烟草品种NC89无菌苗由本实验室保存。将中苜一
号种子用75%酒精消毒10min后播种于铺有2层
滤纸的培养皿中,待子叶展开后,将幼苗转移到28
cm×21cm×6cm的塑料盆中进行水培,并在其中
加入 Hoagland水培液。培养条件为:光照(3000
lx)16h/黑暗8h,相对湿度为75%,培养温度为
25℃。
试剂、菌株和载体:SMARTRACEcDNAAm-
plificationKit购自Clonetech公司,Trizol试剂、凝
胶回收试剂盒、质粒小提试剂盒、基因组DNA提取
试剂盒购自北京博迈德生物技术公司,T4DNA连
接酶、M-MLV反转录酶和限制性内切酶、克隆载体
pMD-19T 购自 Takara公司,TaqDNA 聚合酶、
DNA Marker、大肠杆菌DH5ɑ感受态菌株购自北
京全式金生物公司。引物合成及测序工作交由北京
博迈德生物技术公司完成。载体pA7-GFP、pBI121
和农杆菌LBA4404菌株由本实验室保存。其他药
品和试剂均为进口或国产分析纯。
1.2 方法
总RNA提取:取生长4周的幼苗,采用Trizol
试剂提取总RNA,经1.5%变性琼脂糖凝胶和紫外
分光 光 度 计 检 测 RNA 质 量 和 浓 度 后,参 照
SMART RACEcDNA Amplification Kit(Clone-
tech)说明书进行反转录及 MsRBP 基因两端序列
的克隆。
RACE引物的设计:根据从紫花苜蓿盐胁迫
cDNA文库中获得的一段长321bp的EST序列
(GenBankaccessionNo.FE896907.1),设计3′-
RACE特异引物P1和5′-RACE特异引物P2(表
1),用于扩增目的基因的3′和5′端序列。引物由北
京博迈德生物技术公司合成。
MsRBP3′端序列克隆:取5μL总RNA加入
DNaseI(Fermentas)37℃处理30min,然后加入3′-
RACEoligodT接头在M-MLV反转录酶作用下合
成cDNA。以此cDNA为模板,使用基因特异性引
083
第2期 王慧敏等:紫花苜蓿MsRBP基因的克隆、分析及烟草的遗传转化
物P1和接头引物 UPM 进行PCR扩增,得到目的
基因3′端序列。PCR程序为:95℃预变性3min;
95℃变性30s,68℃退火30s,72℃延伸2min,30
个循环;72℃延伸10min。1%琼脂糖凝胶电泳检
测PCR产物,切胶回收特异性条带。回收产物连接
克隆pMD-19T载体,并转化DH5α感受态。挑取
单菌落,PCR检测后送北京博迈德生物技术公司
测序。
表1 引物序列
Table1 Primersequences
引物名称 Nameofprimer 引物序列(5′-3′)Primersequences(5′-3′)
P1 AGTTTATTAGCCGTGCTGGTGCTGAGA
P2 AACAGCAACATCAACAACAACCACCCT
P3 TACTCGAGATGATGCAACCAGGAGGACCAG(XhoⅠ)
P4 GCACTAGTCTATATCCTAATTGCTGTTGCT(SpeⅠ)
P5 CCGATGAAGTCAAAACTCTCTGGAT
P6 GCACGGCTAATAAACTCAAGAAACC
P7 TGGGCTGCCACAGAACATTTGA
P8 GCTGTGGTTGCTTTTTTGGTGTCTC
P9 TATCTAGAATGATGCAACCAGGAGGACCAG(XbaⅠ)
P10 ATCCCGGGCTATATCCTAATTGCTGTTGCT(SmaⅠ)
35Sf CGACACACTTGTCTACTCCAAAAAT
35Sr CTCCAAATGAAATGAACTTCCTTAT
MsRBP5′端序列克隆:取5μL总RNA加入
DnaseI37℃处理30min,然后加入5′-RACE接头引物
在M-MLV反转录酶作用下合成cDNA。以此cDNA
为模板,使用基因特异性引物P2和接头引物UPM扩
增获得5′端序列。其他操作同3′端序列克隆。
MsRBP基因及其编码蛋白的生物信息学分
析:用DNAMAN软件将得到的目的基因3′端和5′
端序列以及已知的EST序列进行拼接得到目的基
因全长序列。使用NCBI中的Blastx程序(http://
blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast)对拼接得到序列进
行比对分析,结合ORFfinder程序查找基因的开放
阅读框。使用ComputepI/Mw程序(瑞士生物信
息 学 研 究 所 网 站 http://us.expasy.org/)对
MsRBP基因编码蛋白等电点和分子量进行预测,
并运用ProtScale和ScanProsite程序对编码蛋白疏
水性和作用位点进行预测分析。采用PBILLYON-
GERLAND信息库对蛋白质序列进行二级结构预
测。采用SMART软件对编码蛋白结构域进行预
测 (http://smart.embl-heidelberg.de/)。 使 用
ProtCompVersion9.0软件(http://linux1.soft-
berry.com/berry.phtml)对目的基因进行亚细胞定
位预测。在GenBank中查找到23个其他物种中与
目的基因具有较高相似性的RNA结合蛋白氨基酸
序列,使用 ClustalX1.81 进行多序列比对,用
MEGA5.0邻接法构建系统进化树。
MsRBP编码蛋白的亚细胞定位:ProtComp
Version9.0软件对MsRBP 基因亚细胞定位预测
结果表明其定位于细胞核的可能性较大。根据测序
获得的MsRBP基因cDNA序列设计分别含有Xho
Ⅰ 和SpeⅠ酶切位点的引物P3/P4(表1),以cD-
NA为模板进行扩增。PCR凝胶回收产物与pA7-
GFP载体经XhoⅠ/SpeⅠ双酶切后回收,经 T4
连接酶连接后转化大肠杆菌。经酶切鉴定和测序验
证,成功构建了绿色荧光蛋白与MsRBP 基因融合
瞬时表达载体 GFP-MsRBP。参照丁旺等[21]的方
法,将构建好的表达载体用基因枪轰击洋葱(Alli-
umcepa)表皮细胞,以空载体pA7-GFP为对照,通
过绿色荧光蛋白基因在洋葱表皮细胞内的表达情况
对目的基因编码蛋白进行亚细胞定位。
MsRBP基因的表达模式分析:4周后,分别向
Hoagland水培液中加入300mM NaCl,20% PEG
6000和100μM ABA进行逆境胁迫试验。胁迫处
理24h,分别在0,2,4,10,24h取幼苗茎叶和根,用
Trizol试剂提取总RNA,反转录后用于实时定量分
析。使用荧光定量PCR法研究NaCl,PEG和ABA
胁迫条件下MsRBP基因在紫花苜蓿各组织中的表
达情况。MsRBP 基因定量 PCR 引物 P5/P6(表
1)。以紫花苜蓿β-actin 基因为内参,其定量PCR
引物为P7/P8(表1)。进行3次独立重复试验,使
用相对定量法公式(2-ΔΔCt)计算MsRBP 基因的相
对表达量。
MsRBP基因在烟草中超表达:根据测序获得
的MsRBP基因cDNA序列并结合载体pBI121多
克隆位点,设计分别含有XbaⅠ 酶切位点和Sma
183
草 地 学 报 第21卷
Ⅰ酶切位点的P9/P10(表1),以cDNA为模板进行
扩增。PCR 回收产物与pBI121载体经 Xba Ⅰ/
SmaⅠ双酶切后回收,经T4连接酶连接后转化大
肠杆菌。经酶切鉴定和测序验证,证明植物超表达
载体pBI121-MsRBP 构建成功。用CaCl2 冻融法
将 载 体 pBI121-MsRBP 转 入 到 根 癌 农 杆 菌
LBA4404中,参考王关林和方宏筠[22]的方法,对烟
草进行遗传转化和再生。以再生烟草的基因组
DNA为模板,35Sf/P10为引物,进行PCR检测,扩
增片段长度为1652bp;以初步筛选出的阳性再生
烟草总 RNA 为模板,P9/P10为引物,进行 RT-
PCR检测,扩增片段长度为1242bp;为进一步确定
MsRBP在烟草内表达并被翻译成蛋白,使用组织
化学染色法[22-23]检测GUS基因在再生烟草中的表
达情况。
2 结果与分析
2.1 MsRBP基因全长序列及生物信息学分析
3′-RACE和5′-RACE分别得到1127bp和424
bp的序列,经拼接得到MsRBP基因全长cDNA序列
(图1)。该序列全长1551bp,包含一个1230bp的最
大开放阅读框,编码409个氨基酸。氨基酸序列比对
发现其与截形苜蓿中的一种RNA结合蛋白氨基酸序
列相似性在97%以上,将此基因命名为 MsRBP
(GenBankaccessionNo.JN986878.1)。
图1 MsRBP基因序列及推测的氨基酸序列
Fig.1 NucleotideandpredictedaminoacidsequenceofMsRBP
注:粗体氨基酸序列为RRM;划线氨基酸序列为谷氨酰胺和脯氨酸富含区域;70号与1299号碱基之间的序列为编码区;
70号与72号碱基之间序列为起始密码子;1297号与1299号碱基之间序列为终止密码子
Note:TheaminoacidsinboldistheRNARecognitionMotif(RRM);theaminoacidsunderlinedistheGlutamine-richregionandProline-
richregion;thenucleotidesequencebetween70and1299isacodingregion;thenucleotidesequencebetween70and72isastartcodon;thenu-
cleotidesequencebetween1297and1299isastopcodon
生物信息学分析表明:MsRBP 编码蛋白的分
子量约为45.6kDa,等电点PI为6.31;疏水性分析
结果表明大部分区域为亲水区;二级结构预测结果
表明含有大量无规卷曲和α螺旋结构;包含3个
RRM结构域,分别位于第72到152、165到244、
272到344个氨基酸之间,表明其具有RNA识别与
结合能力;C端第4到65个氨基酸之间的区域为谷
氨酰胺和脯氨酸富含区域(图2)。进化树分析结果
283
第2期 王慧敏等:紫花苜蓿MsRBP基因的克隆、分析及烟草的遗传转化
表明:MsRBP编码蛋白与截形苜蓿编码的RNA结
合蛋白亲缘关系最近,其次是红三叶(Trifolium
pratense)和大豆,与其他物种或其他类别的 RNA
结合蛋白基因的亲缘关系较远(图3)。
图2 MsRBP基因编码蛋白理化性质的预测分析
Fig.2 AnalysesofthecodingproteinofMsRBPgene
注:a.编码蛋白亲疏水性;b.编码蛋白二级结构;c.编码蛋白特异性作用位点
Note:a.HydrophobicityandhydrophilicityanalysisofMsRBP;b.ThesecondarystructureofMsRBP;
c.ThespecificalyfunctionalsiteofMsRBP
383
草 地 学 报 第21卷
图3 MsRBP蛋白与其他植物结合蛋白的进化树分析
Fig.3 PhylogenetictreeanalysisofMsRBPandotherRBPs
注:图中数字为进化树的自展值
Note:Numberisbootstrapvalue.MedicagosativaaccessionAEW68341.1;MedicagotruncatulaaccessionXP_003610417.1;Trifolium
pratenseaccessionBAE71244.1;GlycinemaxaccessionXP_003549897.1;ArabidopsislyrataaccessionXP_002889883.1;Arabidopsisthali-
anaaccessionNP_172630.1;RicinuscommunisaccessionXP_002518499.1;OryzasativaJaponicaGroupaccessionAAG59664.1;Hordeum
vulgareaccessionBAJ85753.1;VitisviniferaaccessionXP_002280601.1;PiceasitchensisaccessionABK24911.1;Solanumtuberosumacces-
sionABB86246.1;BetavulgarisaccessionCAC85246.1;LimoniumbicoloraccessionGQ398238.1;ZeamaysaccessionNP_001105707.1;
NicotianasylvestrisaccessionBAA03742.1;SorghumbicoloraccessionAAM94322.1;ZeamaysMA16accessionAAR29370.1;Solanumly-
copersicumaccessionCAA39218.1;ArabidopsisthalianathalecressaccessionAEE74812.1;LycopersiconchilenseaccessionAAK29467.1;
ViciafabaaccessionBAJ78240.1;ArabidopsisthalianaGPRPaccessionCAA59059.1;OryzasativaIndicaGroupaccessionAAQ24632.1
2.2 MsRBP蛋白的亚细胞定位
亚细胞定位结果发现:转化了pA7-GFP载体
的洋葱细胞在细胞膜、细胞质和细胞核中都有荧光
信号(图4-a,4-b,4-c),而转化了融合表达载体
GFP-MsRBP的洋葱细胞,只有在细胞核中才有荧
光信号(图4-d,4-e,4-f),说明MsRBP基因编码蛋
白定位于细胞核。这一结果与软件预测结果相吻
合,进一步证明该蛋白定位于细胞核。
2.3 MsRBP基因表达模式分析
采用实时荧光定量PCR的方法,对紫花苜蓿受
到不同环境胁迫时,MsRBP 基因的表达情况进行
了分析。结果表明:正常生长(0h)时,MsRBP基因
在地上(茎叶)和地下(根)组织中均有一定量的表
达,且表达强度相似;NaCl,ABA和PEG胁迫时(2
~24h),可诱导 MsRBP 基因表达量上调,且
MsRBP基因在植物地上部和地下部的表达水平有
差异(图5)。
NaCl胁迫时,MsRBP 基因表达量上调,表达
水平呈升高(0~2h)-降低(2~4h)-升高(4~10
h)-降低(10~24h)的趋势;MsRBP在根中的表达
水平始终高于茎叶,处理24h时,其在根中的表达
强度是茎叶中表达强度的3倍(图5-a)。ABA处理
同样可诱导MsRBP 基因的高水平表达,其在地上
部和地下部的表达模式相似;2h内该基因的表达
量急剧上升,之后有所下降,但仍远远高于对照(图
483
第2期 王慧敏等:紫花苜蓿MsRBP基因的克隆、分析及烟草的遗传转化
5-b)。PEG胁迫时,MsRBP 基因在地上部组织和
地下部组织中的表达模式略有不同;2h时,该基因
在地上部的表达量最高,且表达水平略高于地下部
组织;而其在地下部组织中的表达水平先升高后降
低,10h时表达量处于最高水平,且远高于地上部
组织(图5-c)。以上结果说明紫花苜蓿根系对盐胁
迫、干旱胁迫的反应较茎叶敏感,ABA在植物正常
生长发育过程中起着重要的作用。
图4 GFP-MsRBP融合蛋白在洋葱表皮细胞瞬时表达情况
Fig.4 Fluorescenedetectionintheskincelsofonion
注:a,b,c:pA7-GFP瞬时表达;d,e,f:GFP-MsRBP瞬时表达
Note:a,b,c:Transientexpressionofemptyvector;d,e,f:GFP-MsRBPtransientexpression
图5 MsRBP基因在胁迫条件下的定量表达
Fig.5 ExpressioncharacterofMsRBPindifferentstresses
注(Note):a.NaCl处理;b.ABA处理;c.PEG处理
583
草 地 学 报 第21卷
2.4 转基因烟草的获得及鉴定
经抗生素筛选(Kan50mg·L-1),得到8株
烟草再生苗,对其中6株生长健壮的再生烟草进
行PCR检测,结果显示有5株再生烟草的基因组
DNA能扩增得到与目的片段大小一致的条带(图
6-a)。对初步筛选出的5株阳性植株进行 RT-
PCR鉴定,结果显示有3株烟草能够扩增得到目
的片段(图6-b),证明这部分烟草能将 MsRBP基
因转录成mRNA。为提高筛选鉴定转基因阳性植
株的准确率,进一步确定目的基因在转基因烟草
中有表达,对以上3株经 RT-PCR检测的阳性再
生烟草进行了 GUS组织化学染色检测。结果显
示:这3株再生烟草的叶片经GUS染色后呈现蓝
色斑点(图6-c)。
图6 转基因烟草的(a)PCR检测(b)RT-PCR检测(c)GUS检测
Fig.6 PCRdetection(a),RT-PCRdetection(b)andGUSassay(c)oftransgenictobacco
注:M.DNAmarker;1~6.阳性再生烟草;CK+.阳性对照;CK-.阴性对照
Note:M.DNAmarker;1~6.Transgenictobacco;CK+.Positivecontrol;CK-.Negativecontrol
3 讨论
作为转录后加工的主要作用因子,RNA结合蛋
白普遍存在于真核生物中。迄今已从多种植物中分
离得到了许多种类的RNA结合蛋白,并有许多研
究报道RNA结合蛋白参与了植物逆境诱导反应的
调控。Kim等[4]研究表明:4℃低温胁迫下,水稻中
OsGRPs表达量升高;20℃低温胁迫下,过表达水稻
OsGRPs基因可以增强EscherichiacoliBX04的生
存能力;11℃低温胁迫下,过表达了OsGRP1,Os-
GRP4和OsGRP6的拟南芥grp7突变体表现出种
子萌发早的现象。Park等[5]研究指出水稻 Os-
DEG10基因编码的RNA结合蛋白受低温、ABA、
NaCl等胁迫的强烈诱导,RNAi的转基因植株对强
光和低温较野生型更敏感。Ayarpadikannan等[19]
在酵母中过表达SaDhn和SaRBP1基因后,增强
了酵母对渗透胁迫、冷害和热激胁迫的抗性。Sahi
等[25]研究表明过表达水稻Osgr-rbp4基因能增强
酵母细胞对高温胁迫(50℃,30min)的抗性。还有
研究表明过表达 GR-RBP2,AtRZ-1a 或者GR-
RBP7的EscherichiacoliBX04突变株降低了对低
温的敏感性,而功能缺失体则对低温高度敏感[26-27]。
本研究以紫花苜蓿耐盐品种中苜一号为材料,
克隆得到了紫花苜蓿MsRBP 基因全长,并对该基
因进行了逆境胁迫下的表达分析以及转基因研究。
对该基因在不同胁迫条件下的表达特性进行分析,
结果表明:300mM NaCl,20% PEG6000和100
μMABA均能诱导MsRBP基因表达。这与前人对
烟草 NtGRP1 基 因、黑 麦 草 (Lolium perenne)
LpGRP1基因、高粱(Sorghumbicolor)sbGR-RNP
683
第2期 王慧敏等:紫花苜蓿MsRBP基因的克隆、分析及烟草的遗传转化
基因、碱蓬SaDhn和SaRBP1基因,以及水稻Os-
gr-rbp4和OsGRPs基因在受到盐胁迫、ABA、低
温、高温或者DTT等逆境胁迫时mRNA表达量明
显增加的结果相一致[15,20,24-25],推测 MsRBP 基因
可能与这些胁迫的抗性相关。300 mM NaCl或
20% PEG6000处理时MsRBP基因在根中的表达
量显著增加,且表达水平高于茎叶,这一结果与根系
是植物对盐胁迫反应最敏感的器官的理论相符合。
本研究通过构建植物高效表达载体,选用模式
植物烟草作为转基因材料,通过农杆菌介导得到了
超表达MsRBP基因的转基因烟草,为下一步研究
转基因烟草的耐逆性,深入探讨MsRBP 基因在烟
草中的功能奠定了试验基础,为该基因的功能解析
及其在苜蓿分子育种中的应用积累了基础资料。
参考文献
[1] BurdCG,DreyfussG.Conservedstructuresanddiversityof
functionsofRNA-bindingproteins[J].Science,1994,265
(5172):615-621
[2] DreyfussG,KimVN,KataokaN.Messenger-RNA-binding
proteinsandthemessagestheycarry[J].NatureReviewsMo-
lecularCelBiology,2002,3(3):195-205
[3] 杜光伟,强伯勤,袁建刚,等.RRMRNA结合蛋白的结构与功
能[J].生物化学与生物物理进展,1999,26(4):305-307
[4] KimJY,Kim W Y,KwakKJ,etal.Glycine-richRNA-
bindingproteinsarefunctionalyconservedin Arabidopsis
thalianaandOryzasativaduringcoldadaptationprocess[J].
JournalofExperimentBotany,2010,61(9):2317-2325
[5] ParkH Y,KangIS,HanJS,etal.OsDEG10encodinga
smalRNA-bindingproteinisinvolvedinabioticstresssigna-
ling[J].BiochemicalandBiophysicalResearchCommunica-
tions,2009,380(3):597-602
[6] HanM H,GoudS,SongL,etal.TheArabidopsisdouble-
strandedRNA-bindingproteinHYL1playsaroleinmicroR-
NA-mediatedgeneregulation[J].ProceedingsofNationalA-
cademyofSciencesoftheUSA,2004,101(4):1093-1098
[7] VermelM,GuermannB,DelageL,etal.AfamilyofRRM-
typeRNA-bindingproteinsspecifictoplantmitochondria[J].
ProceedingsofNationalAcademyofSciencesofthe USA,
2002,99(9):5866-5871
[8] KwakKJ,Kim YO,KangHS.Characterizationoftrans-
genicArabidopsisplantsoverexpressingGR-RBP4underhigh
salinity,dehydration,orcoldstress[J].JournalofExperi-
mentalBotany,2005,56(421):3007-3016
[9] CaoSQ,JiangL,SongSY,etal.AtGRP7isinvolvedinthe
regulationofabscisicacidandstressresponsesinArabidopsis
[J].Celular& MolecularBiologyLetters,2006,11(4):526-
535
[10]RaabS,TothZ,deGrootC,etal.ABA-responsiveRNA-
bindingproteinsareinvolvedinchloroplastandstromulefunc-
tioninArabidopsisseedlings[J].Planta,2006,224(4):900-
914
[11]SchoningJC,StreitnerC,MeyerIM,etal.Reciprocalregu-
lationofglycine-richRNA-bindingproteinsviaaninterlocked
feedbackloopcouplingalternativesplicingtononsense-media-
teddecayinArabidopsis[J].NucleicAcidsResearch,2008,36
(22):6977-6987
[12]FusaroAF,BoccaSN,RamosRLB,etal.AtGRP2,a
cold-inducednucleo-cytoplasmicRNA-bindingprotein,hasa
roleinflowerandseeddevelopment[J].Planta,2007,225(6):
1339-1351
[13]GendraE,MorenoA,AlbaM M,etal.Interactionofthe
plantglycine-richRNA-bindingproteinMA16withanovelnu-
cleolarDEADboxRNAhelicaseproteinfromZeamays[J].
PlantJournal,2004,38(6):875-886
[14]NaqviSMS,ParkKS,YiSY,etal.Aglycine-richRNA-
bindingproteingeneisdifferentialyexpressedduringacutehy-
persensitiveresponsefolowingTobaccoMosaicVirusinfection
intobacco[J].PlantMolecularBiology,1998,37(3):571-576
[15]LeeMO,KimKP,KimBG,etal.Floodingstress-induced
glycine-richRNA-bindingproteinfromNicotianatabacum[J].
MoleculesandCels,2009,27(1):47-54
[16]KelerB,SauerN,LambCJ.Glycine-richcel walproteins
inbean:Genestructureandassociationoftheproteinwiththe
vascularsystem[J].EMBOJournal,1988,7(12):3625-3633
[17]LiJ,KinoshitaT,PandeyS,etal.ModulationofanRNA-
bindingproteinbyabscisic-acid-activatedproteinkinase[J].
Nature,2002,418(6899):793-797
[18]潘妍,王玉成,张大伟,等.二色补血草LbGRP基因的克隆及
抗逆能力分析[J].遗传,2010,32(3):278-286
[19]AyarpadikannanS,ChungE,ChoCW,etal.Explorationfor
thesaltstresstolerancegenesfromasalt-treatedhalophyte,
Suaedaasparagoides[J].PlantCelReports,2012,31(1):35-
48
[20]ShinozukaH,HisanoH,YoneyamaS,etal.Geneexpression
andgeneticmappinganalysesofaperennialryegrassglycine-
richRNA-bindingproteingenesuggestaroleincoldadapta-
tion[J].MolecularGeneticsandGenomics,2006,275(4):399-
408
[21]丁旺,杨青川,康俊梅,等.紫花苜蓿 MADS-box 基因 NMH7
的亚细胞定位与表达分析[J].中国草地学报,2011,33(5):
15-20
[22]方宏筠,王关林.植物基因工程[M].2版.北京:科学出版社,
2005:795-853
[23]张丽华,程智慧,李霞.GUS基因分泌型植物表达载体的构建
及对烟草的转化[J].西北农林科技大学学报:自然科学版,
2004(S1):94-96
[24]Aneeta,Sanan-MishraN,TutejaN,etal.Salinity-andABA-
inducedup-regulationandlight-mediatedmodulationofmRNA
encodingglycine-richRNA-bindingproteinfromSorghumbi-
color[J].BiochemicalandBiophysicalResearchCommunica-
tions,2002,296(5):1063-1068
[25]SahiC,AgarwalM,SinghA,etal.Molecularcharacteriza-
tionofanovelisoformofrice(OryzasativaL.)glycinerich-
RNAbindingproteinandevidenceforitsinvolvementinhigh
temperaturestressresponse[J].PlantScience,2007,173(2):
144-155
[26]KimJS,JungHJ,LeeHJ,etal.Glycine-richRNA-binding
protein7affectsabioticstressresponsesbyregulatingstomata
openingandclosinginArabidopsisthaliana[J].PlantJour-
nal,2008,55(3):455-466
[27]Kim YO,PanS,JungCH,etal.Azincfinger-containing
glycine-richRNA-bindingprotein,atRZ-1a,hasanegativeim-
pactonseedgerminationandseedlinggrowthofArabidopsis
thalianaundersaltordroughtstressconditions[J].Plantand
CelPhysiology,2007,48(8):1170-1181
(责任编辑 刘云霞)
783