全 文 ：第 19 卷 第 2 期
Vol. 19 No. 2
草 地 学 报
ACTA AGRESTIA SINICA
2011 年 3 月
M ar. 2011
扁蓿豆愈伤组织原生质体分离条件的研究
陶 茸, 李玉珠, 王 娟 , 安惠惠, 郭 婧, 师尚礼*
(甘肃农业大学草业学院,草业生态系统教育部重点实验室, 中- 美草地畜牧业可持续发展研究中心, 甘肃 兰州 730070)
摘要: 以扁蓿豆( Melilotoid es ruthenica ( L . ) Sojak)下胚轴愈伤组织为材料, 研究酶液组合、酶解时间、酶液渗透
压、继代培养时间及预处理措施对其原生质体分离效果的影响,以期确定能够酶解出高数量且高活力的原生质体
的酶解条件。结果表明:获得有活力原生质体的最佳酶液组合为 2%纤维素酶+ 0. 5%果胶酶+ 0. 3%半纤维素酶、
酶解时间为 12 h、酶液渗透压即甘露醇浓度为 0. 55 mol # L- 1 ,愈伤培养天数为 10~ 12 d、预处理措施为黑暗 24 h。
关键词:扁蓿豆; 酶解条件;原生质体
中图分类号: Q943. 1 文献标识码: A 文章编号: 1007-0435( 2011) 02-0288-06
Protoplasts Isolation Conditions of Melilotoides ruthenica Callus
T AO Rong , LI Yu- zhu, WANG Juan, AN Hu-i hui, GU O Jing, SH I Shang- li*
( Pratacultural C ol lege, Gansu Ag ricultural University, Key Laboratory of Grassland Ecosystem of M in ist ry of Educat ion ,
S ino-U . S. Cen ter for Grazingl Ecosystem Sustainabilit y, Lanzh ou, Gansu Province 730070, China)
Abstract: Hydroly sis parameters of protoplast w ith high y ield and activ ity w ere determ ined using hypoco ty l
callus ofM elilotoides ruthenica ( L . ) . The ef fects of enzyme combinations, mannitol concentrat ion in the
mixed enzyme solution, enzymolysis t ime, callus subculture and pret reatment t ime on pro toplast isolat ions
w ere studied. Results show that the opt imum condit ions for the highest yield and viability of pro toplasts
w ere with enzyme combinations containing 2% cellulase + 0. 5% pect inase + 0. 3% hemicellulase w ith 0.
55 mol. L - 1 mannito l, after 24-hour dar k pretr eatment , follow ed by 12-hour enzymo lysis and callus subcu-l
turing for 10 to12 days.
Key words: M eli lotoid es r uthenica ( L ) Sojak; Enzymo lysis condit ions; Protoplast
扁蓿豆( Meli lotoides r uthenica ( L. ) So jak)属
豆科扁蓿豆属多年生草本植物[ 1] , 广泛分布于我国
北方地区, 其营养价值高, 适口性好, 抗旱、抗寒性
强,耐盐碱、耐瘠薄, 在黑钙土、栗钙土和中度盐碱土
上均能良好生长,尤其在紫花苜蓿(M edicago sat i-
va L. )不能越冬生长的寒冷地区和相对较干旱地
区,扁蓿豆都可以良好生长,青草产量可达 11. 2 t #
hm
- 2 [ 2, 3]
,是北方地区良好的牧草资源。
豆科牧草育种多采用传统的选择育种和杂交育
种,但远缘杂交的不亲和性阻碍了这些技术在苜蓿
和扁蓿豆杂交中的应用, 无法将扁蓿豆的优良基因
与苜蓿很好的融合。而以原生质体融合为基础的体
细胞杂交技术可以克服远缘杂交的困难, 实现不同
植物种属间基因组或特异染色体的融合, 在转基因
育种应用中还可以把外源目的基因导入原生质体,
创造出新的种质资源[ 4] 。
近年来, 国内对扁蓿豆生物学特性及组织培养
方面的研究比较完善, 但对其原生质体分离的研究
尚未见报道[ 5, 6]。因此本研究以扁蓿豆为研究对
象,在建立稳定优质的愈伤组织体系基础上,研究影
响其原生质体分离效果的因素, 以期确定能够酶解
出高数量且高活力的原生质体的酶解条件,为苜蓿
和扁蓿豆原生质体融合奠定基础, 也为豆科牧草生
物技术育种提供良好的资源。
1 材料和方法
1. 1 供试材料
材料为扁蓿豆(由甘肃农业大学草业学院提供)
收稿日期: 2010-10-03;修回日期: 2011- 03-11
基金项目:人工草地优质牧草生产技术研究与示范( n yhyzx07-022) ;现代农业产业技术体系建设专项资金资助
作者简介:陶茸( 1984- ) ,女,陕西宝鸡人,硕士研究生,研究方向为牧草种质资源与育种研究, E-mail: t aor27@ 163. com; * 通讯作者: Au-
thor for correspondence, E-m ail: sh ishl@g sau . edu. cn
第 2期 陶茸等:扁蓿豆愈伤组织原生质体分离条件的研究
下胚轴培育所得的最佳愈伤组织。将种子在 98%
硫酸溶液中浸泡 15 m in,蒸馏水冲洗至中性( pH =
7) ,用滤纸吸干种子表面水分后, 放入 70% 乙醇中
振荡 30~ 60 s,再用 0. 1% HgCl2消毒 10 m in,无菌
水清洗 4~ 7 次, 接种到不含激素的 1/ 2M S 固体培
养基,在 25 e 、12 h 光照下培养 10~ 15 d。切取新
生无菌苗的下胚轴, 接种到愈伤组织诱导培养基上
( M S+ 0. 5 mg # L- 1 2, 4-D + 1 mg # L - 1 6-BA+ 1
mg # L - 1 NAA)培养 2~ 3个月后 [ 6] (图 1-A) , 转移
至( M S+ 0. 5 mg # L - 1 2, 4-D+ 0. 5 mg # L - 16-BA )
中培养 10~ 12 d作为酶解的原材料(图 1-B)。
图 1 扁蓿豆的愈伤组织及分离出的原生质体
F ig . 1 Callus and pro toplasts of Melilotoides ruthenica ( L . ) So jak
注: A :水渍状愈伤组织; B:胚性愈伤组织; C:分离出的细胞原生质体( 10@ 20) ; D:有活力的原生质体( 10@ 20)
Note: A: St icky cal lus; B: Embryogenic callus ; C: Freshly isolated protoplast s f rom cal lus; D: Viab le protoplas
1. 2 试验方法
1. 2. 1 原生质体分离纯化
本试验设置 5种酶处理组合用于分离原生质体
(表 1) , 各酶液组合均溶于 CPW-10 溶液中, CPW-
10溶液配方参照赵小强等[ 7] 的方法, 调节 pH = 5. 8
~ 5. 9,然后以直径 0. 45 Lm 的微孔滤膜过滤灭菌
后备用 [ 7~ 9]。针对不同的酶处理组合, 每次提取 1 g
原材料, 置于 10 mL 备用混合酶液的三角瓶 ( 50
mL)中, 在( 25 ? 1) e , 50 r # min- 1摇床上黑暗条件
下酶解 4~ 16 h。酶解后的材料依次经 100、400 目
无菌尼龙网筛过滤,将除去未酶解完全的组织和细
胞团的滤液,经离心机 ( 500 r # min- 1 )离心 5~ 10
min, 收集原生质体。收集到的原生质体用 CPW-10
溶液悬浮,再离心, 反复 2~ 3次。最后用原生质体
培养液洗涤 2次, 得到纯化的原生质体。最终以原
生质体产量和活力最高的组合定为最佳酶液组合。
1. 2. 2 酶解时间, 酶液渗透压, 继代培养时间及预
处理措施
将材料在确定的最佳酶组合中进行酶解, 设置
酶解时间梯度为 4, 6, 8, 10, 12, 14 h 共 6个梯度, 选
择状态及培养时间一致的愈伤组织, 分别放入 6个
处理中,到测定时间取出, 测定其产量及活力,以确
定最佳酶解时间[ 9] 。
以甘露醇作为渗透压调节物质,将材料分别放
入甘露醇浓度为 0. 45, 0. 50, 0. 55, 0. 60, 0. 65 mo l
# L- 1的最佳酶液组合中,采用上述确定的最佳酶
解时间酶解,测定各处理中原生质体的产量和活力,
以确定最佳的渗透压。
选择浅黄绿色,颗粒明显,质密的愈伤组织更换
新的继代培养基, 分别培养 4, 6, 8, 10, 12 d 后酶解,
测定其原生质体的产量及活力, 以确定最佳继代培
养时间[ 10~ 12 ]。
在进行酶解之前对材料进行预处理, 可以改善
细胞及细胞壁的生理状态,提高原生质体产量和细
胞活力,试验设计在酶解前选择状态及质量一致的
愈伤组织,参照金红等 [ 13]研究结果分别进行 4种预
处理措施(表 2) , 与愈伤组织培养条件相同为对照
( CK) , 之后在最佳酶解条件下酶解,测定其原生质
体的产量和活力, 以确定最佳预处理措施。
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草 地 学 报 第 19卷
表 1 分离原生质体的酶液组合配方
Table 1 Concentr ation and combination o f enzyme
酶液编号
No. of enz yme
纤维素酶, %
Cellulase Onozuk a R-10
果胶酶, %
Pect inase Y-23
半纤维素酶, %
H emicellulase Onozuka
离析酶, %
M acerozyme R- 10
崩溃酶, %
Driselase
M1 2 0. 5
M2 2 0. 5 0. 3
M3 2 0. 5 0. 3
M4 2 0. 5 0. 3
M5 2 0. 5 0. 3 0. 3 0. 3
表 2 预处理措施
Table 2 Different pretr eatments
处理编号
Treatment No.
处理条件
T reatm ent condit ions
1 温度( 25 ? 1) e ,黑暗条件下放置 24 h
2 温度 4 e ,黑暗条件下放置 24 h
3 温度( 25 ? 1) e , CPW-10溶液中浸泡 1 h
4 温度( 25? 1) e , 0. 55 mol# L- 1的蔗糖溶液中浸泡 1 h
CK 温度( 25 ? 1) e ,光强为 2000 lx,光照周期 16 h
1. 2. 3 原生质体产量及活力测定
1. 2. 3. 1 原生质体产量的测定
采用血球计数板计数。吸取少量纯化后的原生
质体悬浮于血球计数板上, 在显微镜下观察统计原
生质体的产量, 重复 3 次。计数时逐次计算中央大
方格内 25个中方格里的细胞,然后再根据下式求出
每毫升中的原生质体数[ 14] 。1 mL 悬浮液中的原生
质体数= 1个大方格悬浮液( 0. 1 mm3 , 即 0. 1 LL)
中的细胞数@ 10 @ 1000。
1. 2. 3. 2原生质体活力的测定
用荧光染料荧光素双醋酸盐( F luorescein diac-
etate, FDA)活体染色法对原生质体活力进行染色
鉴定。FDA用丙酮配制成 5 mg # mL- 1溶液, 然后
按照 25 LL #mL- 1 FDA 进行染色。吸取 1滴原生
质体悬浮液置于载玻片上, 在荧光显微镜下检测其
活性。用 FDA 进行染色静置 5 min后观察,随机选
取3个视野统计原生质体的数量[ 14] (图1-D)。原生
质体存活率= (有活力的原生质体数/原生质体总
数) @ 100%。
1. 2. 4 数据处理
数据采用 SPSS 15. 0版进行分析。
2 结果与分析
2. 1 适合于原生质体分离的胚性愈伤组织细胞系
的建立
扁蓄豆下胚轴在MS+ 0. 5 mg # L- 1 2, 4-D + 1
mg # L - 16-BA + 1 mg # L- 1NAA 的培养基上培养
3天后, 下胚轴开始膨大, 形成透明、半玻璃化的愈
伤组织,其成愈率高达 98. 3%, 颜色多为黄绿色、浅
黄绿色,且愈伤组织褐化现象在该培养基中几乎没
有。在继代培养时去除水渍化和褐化的愈伤组织,
选取质地紧密、颗粒状明显的愈伤组织进行继代培
养, 15~ 20 d继代 1次,继代 3~ 5次后, 转移至 MS
+ 0. 5 mg # L - 1 2, 4-D + 0. 5 mg # L- 1 6-BA 的培
养基中继续培养便可获得,外观呈浅黄绿色或淡绿
色,且质地较紧密的颗粒型胚性愈伤组织,其胚性愈
伤的形成率在该培养基中可达 97. 8%。试验证明,
利用这种胚性愈伤组织能够分离出大量的原生质体
(图 1-C 和图1-D)。
2. 2 酶液组合及浓度对原生质体分离的影响
当酶液 pH = 5. 8、甘露醇浓度为 0. 55 mol #
L - 1时,采用不同组合的纤维素酶、果胶酶、半纤维
素酶、离析酶和崩溃酶,分离在新鲜培养基上培养 8
~ 15 d的扁蓄豆下胚轴愈伤组织原生质体 12 h,比
较 5种不同酶液组合对扁蓿豆原生质体分离效果的
影响(图 2)。结果表明: 在 M1, M 3和 M4组合中,
M 4的原生质体产量比 M3高, 但其活力最低,只有
61. 4%;M1中的产量 2. 67 @ 105个# g- 1和活力 66. 2%
均比 M3和 M4高,可见 0. 3%的崩溃酶和 0. 3%离
析酶在此组合中会降低原生质体分离的产量和活
力,其中 0. 3%崩溃酶严重降低了原生质体的活力,
0. 3%离析酶严重降低了原生质体的产量; M2组合
中,原生质体产量 3. 24 @ 105个 # g- 1和活力 72. 1%
均为最高, 且与其他组合存在极显著差异 ( P <
01 01) ;而在 M5组合中,虽然酶的种类比较齐全,但
其原生质体的产量 2. 95 @ 105个 # g - 1和活力
671 3%均不是最高, 可见 0. 3%半纤维素酶会促进
扁蓄豆原生质体的分离并提高其活力。综上可得,
适宜扁蓿豆原生质体分离的酶组合是 2%纤维素酶
+ 0. 5%果胶酶+ 0. 3%半纤维素酶。
2. 3 酶解时间对原生质体分离的影响
酶解时间是影响原生质体分离的关键因素,确
定了最佳酶解组合后( 2%纤维素酶+ 01 5%果胶酶
290
第 2期 陶茸等:扁蓿豆愈伤组织原生质体分离条件的研究
+ 0. 3%半纤维素酶) , 在最佳酶组合条件下比较了
不同酶解时间对扁蓿豆原生质体产量和活力的影响
(图 3)。由图 2可知随酶解时间的延长原生质体的
产量先直线迅速提高后再下降; 而活力的变化为先
缓慢提高后再降低。酶解 4 h 时, 离解出的原生质
体产量 2. 06 @ 105个 # g- 1和活力 67. 24%均不高;
当酶解 12 h时, 扁蓿豆原生质体的产量 3. 37 @ 105
个# g- 1和活力 73. 1%均达到最大值;酶解时间延
长至 14 h时,其原生质体的产量 3. 19 @ 105个# g- 1
和活力 69. 2%均呈现降低的趋势,且伴有大量碎片
产生。结合酶液组合对原生质体分离效果的影响,
确定其最佳酶解时间为12 h。
图 2 酶组合对扁蓿豆原生质体分离的影响
Fig . 2 Effects o f different enzyme combinations on
Melilotoides ruthenica protoplast isolation
注: M 1为 2%纤维素酶+ 0. 5%果胶酶; M2为 2%纤维素酶+ 0. 5%
果胶酶+ 0. 3%半纤维素酶; M3为 2%纤维素酶+ 0. 5% 果胶酶+
013%离析酶; M4为 2%纤维素酶 + 0. 5% 果胶酶+ 0. 3%崩溃酶;
M 5为 2%纤维素酶+ 0. 5%果胶酶+ 0. 3%离析酶+ 0. 3% 崩溃酶+
0. 3%半纤维素酶;甘露醇浓度为 0. 55 m ol # L- 1;酶解时间为 12 h;
pH= 5. 80;显著水平为 P< 0. 01,下同
Note: M1: 2% C ellu las e Onozuka R- 10+ 0. 5% Pect inase Y-23; M2:
2% Cel lulase Onozu ka R-10+ 0. 5% Pectinas e Y- 23+ 0. 3% Hem-i
cellulase Onozuka; M3: 2% Cel lulase Onozuka R- 10+ 0. 5% Pect-i
nase Y-23+ 0. 3% Macerozyme R-10; M 4: 2% C ellu lase Onozuka R-
10+ 0. 5% Pect inase Y- 23+ 0. 3% Dris elase; M5: 2% Cellulase Ono-
zuka R-10+ 0. 5% Pectin as e Y- 23+ 0. 3% Macerozym e R-10+ 0. 3%
Driselase+ 0. 3% H emicellulase Onozuk a; m anni tol concen t rat ion:
0155 m ol # L- 1 ; Enzymolysis t ime: 12 h; pH = 5. 8; Signi ficant
di ff erences ( P< 0. 01) , the same as below
2. 4 甘露醇浓度对原生质体分离的影响
以甘露醇作为渗透压调节物质, 研究其不同浓
度对扁蓿豆下胚轴愈伤组织原生质体分离效果的影
响(图 4)。结果表明, 当甘露醇浓度为 0. 55 mol #
L
- 1时,原生质体的产量 3. 45 @ 105个 # g- 1和活力
73. 6%都最高, 且与其他处理有显著差异,分离出的
原生质体形状、大小基本一致,边缘清晰,内含物多,
碎片少。高于或低于这一浓度原生质体产量和活力
均有所下降,故适宜扁蓿豆下胚轴愈伤组织原生质
体分离的甘露醇浓度为 0. 55 mo l # L - 1。
2. 5 继代培养时间对原生质体分离的影响
在上述最佳酶解条件下, 研究了愈伤组织不同
继代培养时间对扁蓿豆原生质体分离效果的影响
(图 5)。结果表明, 继代培养 4~ 10 d 时, 其原生质
体的产量和活力呈现依次缓慢上升的趋势,第 10 d
时达到最大值,其产量为 3. 51 @ 105个 # g- 1 , 活力
为 73. 9% ,且原生质体质浓, 形状大小较一致;在第
12 d时,其产量为 3. 36 @ 105个# g- 1 ,活力为 69. 3%,
均有下降趋势。由此可见,扁蓿豆下胚轴愈伤组织
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草 地 学 报 第 19卷
最佳酶解继代培养天数是 10~ 12 d。
图 5 扁蓿豆愈伤组织继代时间对原生质体分离的影响
F ig. 5 Effects of callus age on Melilotoides
ruthenica protoplast isolation
注:酶液组合为 2%纤维素酶+ 0. 5%果胶酶+ 0. 3%半纤维素酶;甘
露醇浓度为 0. 55mol# L- 1;酶解时间为 12 h; pH= 5. 80
Note: Enzyme combinat ion: 2% Cel lulase On ozuka R-10+ 0. 5%
Pect inase Y-23+ 0. 3% H em icel lulase Onozuka; Mannitol con cent ra-
t ion: 0. 55 mol# L- 1 ; E nzymolysi s t im e: 12 h; pH = 5. 8
2. 6 预处理措施对原生质体分离的影响
材料的预处理措施对原生质体的分离也有一定
的影响,在上述最佳酶解条件下,研究不同预处理措
施对扁蓄豆下胚轴愈伤组织原生质体分离效果的影
响,并比较了各预处理间的差异性(表 3)。结果表
明,预处理对扁蓿豆下胚轴愈伤组织的原生质体分
离效果的影响较大, 且处理间差异较明显。1号处
理原生质体产量和活力均为最高,对照次之。各处
理对于原生质体产量的影响存在差异: 1号处理和
其他处理相比较, 差异均极显著( P< 01 01) ; 对照与
3号、4号处理差异极显著( P< 0. 01) , 与 2号处理
差异显著( P< 0. 05) ; 3号处理和 4号处理之间差异
不显著。各处理对于原生质体活力的影响也存在差
异: 1号处理和对照分别与其他各处理差异极显著
( P< 0. 01) , 2号、3号和 4号处理之间差异不显著。
可见 1号处理对其原生质体的产量和活力均有明显
提高,且与其他处理差异极显著,故可确定其为最佳
预处理条件。
表 3 不同预处理对扁蓿豆原生质体分离效果的差异比较
T able 3 Com par ison betw een Melilotoides ruthenica protoplast isolat ion from different pretreatments
处理
Treatm ent
原生质体产量均值( @ 105个# g- 1)
Average protoplast yield valu es
原生质体活力均值, %
Average protoplas t viab ilit y values
CK 3. 23bB 69. 94bB
1 3. 59aA 74. 03aA
2 3. 13cB 64. 07cC
3 2. 56dC 64. 53cC
4 2. 60dC 63. 92cC
注:酶液组合为 2%纤维素酶+ 0. 5%果胶酶+ 0. 3%半纤维素酶;甘露醇浓度为 0. 55 m ol # L- 1;酶解时间为 12 h; pH = 5. 80;不同大写字
母表示在 0. 01水平上差异显著;不同小写字母表示在 0. 05水平上差异显著
Note: En zyme com binat ion: 2% Cel lulase Onozuk a R- 10+ 0. 5% Pectin as e Y-23+ 0. 3% H emicellulase Onozuka; M anni tol concent ration :
0. 55 m ol # L- 1; Enzym olysis t ime: 12 h; pH= 5. 8; Dif feren t capital let ters m ean sign ificant dif f erences at the 0. 01 level ; Dif ferent low er case
let ter s m ean signif icant dif feren ces at th e 0. 05 level
3 讨论
3. 1 酶解液的组成、浓度和酶解时间
分离原生质体时,适宜的酶液组合和酶解时间
因植物种类不同有很大差异。在许多植物原生质体
分离的研究中, 多采用纤维素酶、半纤维素酶、果胶
酶、崩溃酶和离析酶,而豆科牧草各种酶的配比及种
类多数与本试验的设计基本一致。结果表明, 2%纤
维素酶+ 0. 5%果胶酶+ 0. 3%半纤维素酶的酶液组
合,酶解 12 h 最佳。这与赵红娟等[ 4] 以苜蓿子叶,
许智宏等[ 15] 以高等植物, 邢朝斌等[ 16] 以刺五加
( A canthopanax senticosus )幼叶为材料游离原生质
体时,所得结果不同。可见,植物最佳酶解条件因植
物种类的不同存在很大差异。扁蓿豆下胚轴愈伤组
织原生质体的分离效果与酶液组合的种类并不成正
比, M5组合中酶的种类最多, 但其产量和活力均不
是最高,由 M3和 M4组合的结果可知, 当将 0. 3%
半纤维素酶分别变换为 0. 3%离析酶和 0. 3%崩溃
酶时,其产量和活力明显下降。当 M5中将半纤维
素酶、离析酶和崩溃酶全部加入时,原生质体产量和
活力均有所提高, 但仍没有 M2高。可见, 0. 3%离
析酶和 0. 3%崩溃酶不利于扁蓿豆原生质体分离,
而 0. 3%半纤维素酶促进扁蓄豆原生质体的分离并
提高其原生质体的活力。同时, 还发现不同的酶解
时间对原生质体的活力和产量也有较大影响,酶解
时间较短不利于原生质体的游离, 过长则会导致原
生质体破碎、活力下降,且不利于原生质体培养。
292
第 2期 陶茸等:扁蓿豆愈伤组织原生质体分离条件的研究
3. 2 甘露醇浓度、继代培养时间及预处理措施
用酶解法降解细胞壁前, 为防止原生质体的破
坏,一般需先用高渗液处理细胞,使细胞处于微弱的
质壁分离状态, 有利于完整原生质体的释放。渗透
压适当,可使原生质体保持圆球状态,渗透压过高或
过低会导致细胞膜发生破裂, 造成细胞死亡 [ 17, 18]。
结果表明,甘露醇浓度为 0. 55 mol # L - 1时,得到的
原生质体产量和活力均最佳, 而高于或低于这一浓
度时,原生质体产量和活力均降低。
由于愈伤组织的质量状态对原生质体的分离效
果影响较明显, 获得高质量、均一的愈伤成为了试验
的重要步骤。试验结果表明, 愈伤在新培养基上继
代培养 10~ 12 d时, 愈伤组织处于旺盛生长期, 呈
浅黄绿色、质地紧密且较疏松,该种状态有利于原生
质体的分离,原生质体的产量和活力均较高。这与
金红等[ 13]研究结论相似。为了改善细胞及细胞壁
的生理状态,提高原生质体产量和细胞活力, 试验采
用了 4种预处理措施,其中黑暗条件下处理 24 h 后
可有效提高原生质体产量和活力,分别提高 11. 14%
和 4. 54%,且与其他预处理差异明显。
即使是同种植物,原生质体分离的最佳参数也
存在明显差异[ 4, 8, 9] ,因此要将该植物的原生质体分
离条件研究清楚,进而降低试验难度,增加试验成功
的几率。本试验在赵小强[ 7]、金红[ 13] 、王娟 [ 18] 等研
究的基础上进行试验设计, 尽可能摸清影响扁蓿豆
原生质体分离的每个因素, 使其原生质体融合能够
顺利且稳定的进行。可能由于扁蓿豆是野生种, 与
其他豆科牧草相比, 其分离出的原生质体产量较
低[ 19, 20] , 但可以较客观的反映影响扁蓿豆原生质体
分离效果的基本因素。试验得到了分离出活力高的
原生质体细胞, 为扁蓿豆原生质体培养、原生质体再
生体系的建立及原生质体的融合提供了有效快捷的
途径。
4 结论
确定稳定高效的原生质体分离条件,必须考虑
原生质体的产量与活力。当酶解条件只有其中一个
或两个达到最佳条件时, 其原生质体的产量和活力
均不能达到最高,只有当酶组合为 2%纤维素酶+
0.5%果胶酶+ 0. 3%半纤维素酶、酶解时间为 12 h、
酶液渗透压即甘露醇浓度为 0. 55 mol # L - 1、愈伤
培养天数为 10~ 12 d、预处理措施为黑暗 24 h 这些
条件都调节到最佳时, 才可以分离出大量且活力高
的原生质体。
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(责任编辑 李美娟)
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