全 文 ：　第 16 卷 第 3 期2007 年 9 月 淮海工学院学报(自然科学版)Journal o f Huaihai Institute o f Technolog y(Natural S cien ces Edi tion) Vol. 16　No. 3Sep. 2007
　　文章编号:1672-6685(2007)03-0066-04
制备条斑紫菜原生质体的工具酶研究***
许星鸿 ,王　萍* ,赵素珍
(淮海工学院 海洋学院 , 江苏 连云港　222005)
摘　要:通过比较自制的 4种海螺酶(分别取自单齿螺 、锈凹螺 、短滨螺和石鳖)及国产的纤维素酶 、
果胶酶等对条斑紫菜细胞壁的降解效果 ,探索经济高效制备条斑紫菜原生质体的工具酶 ,并进一步
研究了最佳酶解条件 。结果表明 ,单独使用海螺酶及市售的纤维素酶 、果胶酶制备紫菜原生质体的
效果都不好 ,而用单齿螺酶与质量分数为 1. 5%的纤维素酶制成的混合酶液(体积比 1∶1)效果最
佳 ,在 25 ℃,pH 为 6. 5时酶解能力最强 ,酶解时间以1 h为宜 ,酶解率可达 80. 4%。温度和酸碱性
过高 、酶解时间过长都会造成紫菜细胞的死亡 。加入 2 mo l /L 的葡萄糖作为渗压剂可使制备的原
生质体成活率从 65. 0%提高到 80. 7%。
关键词:条斑紫菜;原生质体;工具酶;酶解条件
中图分类号:Q943. 1　　　文献标识码:A
Study on the Tool Enzymes of Isolating Protoplasts of
Porphyra yezoensis
XU Xing-hong , WANG Ping , ZHAO Su-zhen
(Colleg e of Marine Science , H uaihai Institute of Techno lo gy , L ianyungang 222005 , China)
Abstract:T he efficient and economical to ol enzymes for isolating pro toplasts o f Porphy ra yezoen-
sis f rom the digestive g lands of four shell fish (Monodonta labio , Chlorostoma rusticum , Lit torina
brev icula , Acanthochiton rubrolineatus), cellulase and pectinase f rom internal market w ere stud-
ied. Resul ts indicated that the mix ture o f shellfi sh enzyme and cellulase w as more ef fective than
any single enzyme in isolating pro toplasts of Porphy ra yezoensis . The m ix ture of digestive en-
zyme from Monodonta labio and cellulase w as the best among them . The best condi tions of enzy-
matic iso lation w ere 25 ℃, pH6. 5 and one hour w as enough for isolat ion. The rate of enzymatic
isolat ion could come up to 80. 4%. A high tempe rature , unsuitable pH or a long t ime of iso lation
could raise the cell dead rate. The surviv al rate of pro toplasts could raise f rom 65. 0% to 80. 7%
with 2 mo l /L o f gluco se as pene trant.
Key words:Porphy ra yezoensis;pro toplasts;too l enzyme;condi tions of enzymatic isolation
　　紫菜是味道鲜美 、富含蛋白质 、不饱和脂肪酸的
海产珍品和保健食品 ,是重要的经济海藻之一[ 1] 。
条斑紫菜是我国北方海域主要的养殖品种 ,传统的
育苗方式是以丝状体培养产生孢子囊枝 ,放散壳孢
*
**
收稿日期:2007-04-04;修订日期:2007-07-18
基金项目:江苏省海洋生物技术重点建设实验室开放课题资助项目(2005H S011);淮海工学院自然科学基金资助项目(Z2005017)
作者简介:许星鸿(1970 -),女 ,江苏泰兴人 ,淮海工学院海洋学院副教授 ,硕士 ,主要从事海洋生物学方面的研究 ,(E-mail)xhxu119@
163. com。
通讯作者:王萍(1957 -),女 ,吉林长春人 ,淮海工学院海洋学院教授 ,主要从事植物基因工程研究 ,(E-m ail)y_pw ang@yahoo. com. cn。
子下海养殖成商品紫菜 。但丝状体培育周期长 、受
季节限制且易染病[ 2] 。而新兴的紫菜细胞工程育苗
是利用植物细胞的全能性 ,对紫菜叶状体酶解产生
单细胞和原生质体 ,并作为种苗用于紫菜养殖[ 1] 。
这种育苗方法不经过丝状体培养阶段 ,极大地缩短
了育苗周期 ,简化了育苗工艺 ,促进了大型经济海藻
的育苗和规模化养殖的发展。酶解得到的原生质体
还是紫菜基因工程 、遗传育种等研究的良好材料[ 3] 。
但目前所使用的裂解酶多为进口商品或自制的鲍鱼
酶[ 4-5] ,价格昂贵 、成本高 ,不利于大规模生产。本实
验从低廉的常见海螺 ———单齿螺 、锈凹螺 、短滨螺和
石鳖中提取海螺酶 ,配合国产的纤维素酶 、果胶酶 ,
筛选出制备条斑紫菜原生质体的有效工具酶以及最
佳酶解条件 ,为后续的紫菜育苗及基因工程等研究
工作奠定基础。
1　材料与方法
1. 1　实验材料
条斑紫菜(Porphy ra yezoensis Ueda)采自江苏
连云港高公岛养殖场 ,阴干后用塑料袋密封 ,速冻保
存于 - 20 ℃冰箱中备用。
活体 单齿 螺 (Monodonta labio)、锈 凹 螺
(Chlorostoma rusticum)、短滨螺(Li ttorina brev ic-
ula)和石鳖(Acanthochi ton rubrol ineatus)购于江苏
连云港墟沟海棠路农贸市场和采集于高公岛海滨 。
纤维素酶和果胶酶:河北省承德市天丰生物工
程有限公司生产 。
1. 2　实验方法
1. 2. 1　海螺酶的提取　将海螺洗净 ,暂养于消毒海
水中饥饿 2 ～ 3 d ,去壳取出消化腺 ,放入含有石英砂
的研钵中 ,加入与消化腺体积比为 2∶1的海水 ,快速
研磨至糊状 ,静置 ,吸取上清液 , 12 000 r /min 冷冻
离心 30 min ,取上清液再反复离心 3次得原酶液 ,于
4 ℃保存备用 。
1. 2. 2　纤维素酶液和果胶酶液　分别根据所需浓
度用消毒海水配制成酶液 。
1. 2. 3　紫菜预处理　藻体去除杂质后 ,用消毒海水
洗涤数次 ,在质量分数 0. 7%的碘化钾溶液中处理 5
～ 10 min进行表面消毒 ,在 0. 7 mol /L 的 NaCl 溶
液中漂洗 。
1. 2. 4　酶解实验　取 1 cm2 藻样用吸水纸充分吸
干后 ,在平皿中剪成碎片 ,加 2 mL 酶液覆盖 ,放入
培养箱黑暗酶解 ,定时(0. 5 ,1 , 1. 5 , 2 h)镜检 ,观察
原生质体游离情况并拍照。具体实验方案如下 。
(1) 6种供试酶单独酶解实验 。在 20 ℃培养箱
中 ,分别做各种酶液的单独酶解实验 ,筛选出有酶解
效果的酶。
(2)混合酶酶解实验 。用上述实验筛选到的酶
组合(体积比 1∶1)制成混合酶液 ,在 20 ℃培养箱中
做紫菜酶解实验 ,筛选出有效的工具酶。
(3)温度和 pH 实验。设置 4个温度水平:15 ,
20 ,25 , 28 ℃,用所筛选到的混合酶分别进行酶解实
验 ,求得最佳酶解温度;用磷酸盐缓冲液设置 4个
pH 水平:5. 8 , 6. 5 , 7. 5 , 8. 0进行实验 ,求得最佳酶
解 pH 。
(4)渗透压稳定剂筛选实验。分别用葡萄糖 、
蔗糖 、甘露醇 、山梨醇作为渗透压稳定剂 ,先做预备
实验 ,找出以上 4种渗压剂的合适浓度 ,再比较渗压
剂对紫菜原生质体活性的影响。
各组均设 3个平行实验组。
1. 2. 5　酶解后紫菜细胞活性的检测　离心去除酶
液 ,取一滴细胞悬液用质量分数 1%中性红染色 ,有
活性的细胞会被染成深紫红色 ,而死细胞则被染成
淡红色或不着色(图 1-1)。
1.紫菜中性红染色 , ↑示活细胞 , *示死细胞 , ×400;2.质量分数
1%纤维素酶解离 2 h , ×400;3.混合酶(单齿螺酶+质量分数 1. 5%
纤维素酶)20℃酶解 1h , ×400;4.混合酶(单齿螺酶+质量分数 1. 5%
纤维素酶)25 ℃酶解 1 h , ×400
图 1　条斑紫菜酶解后的光镜照片
Fig. 1　Micrograph of Porphyra yezoensis after
enzyme treatment
2　结果与分析
2. 1　供试酶单独酶解实验
用各种酶液单独解离紫菜的效果均不理想(表
67　第 3 期 许星鸿等:制备条斑紫菜原生质体的工具酶研究
1),其中以 1%(质量分数 ,下同)纤维素酶和单齿螺
酶作用相对较明显:分别在酶解 1 h 和 1. 5 h 后 ,藻
体边缘松动;酶解 2 h后 ,有少量不规则形状的单细
胞及圆球形的原生质体游离出来 ,但多数已死亡(图
1-2)。短滨螺酶 、锈凹螺酶和石鳖酶在作用 2 h后 ,
仅见藻体边缘松动 ,无原生质体游离 ,而 1%(质量
分数 ,下同)果胶酶对藻体无明显作用。
2. 2　混合酶酶解实验
用 4种海螺酶分别与 1%纤维素酶组合制成混
合酶液(体积比 1∶1)在 20 ℃时的酶解效果见表 2。
由单齿螺酶和 1%纤维素酶组成的混合酶液解离效
果较好 ,酶解 1. 5 h后可解离出 50%的原生质体 ,酶
解 2 h虽然可使全部原生质体游离出来 ,但成活率
明显下降 。在确定纤维素酶的适宜浓度实验中发
现 ,在 20 ℃时 ,以单齿螺酶与 1. 5%纤维素酶制成
的混合酶液解离效果最佳 ,可在酶解 1 h 后获得
50%以上的原生质体(图 1-3)。使用 2%纤维素酶
会使细胞成活率降低。
表 1　各种酶对紫菜的酶解效果
Table 1　Effect of enzymes treatment to
Porphyra yezoensis
酶液种类 酶解效果 细胞成活率 /%
0. 5 h 1 h 1. 5 h 2 h 0. 5 h 1 h 1. 5 h 2 h
1%纤维素酶 - + + ++ 87. 4 78. 5 69. 6 46. 8
单齿螺酶 - - + ++ 86. 7 79. 2 70. 3 52. 4
短滨螺酶 - - + + 85. 6 80. 3 68. 5 50. 6
锈凹螺酶 - - - + 87. 2 79. 4 72. 3 51. 8
石鳖酶 - - - + 85. 1 81. 5 71. 6 53. 3
1%果胶酶 - - - - 87. 8 82. 1 73. 8 62. 7
　　注:“ - ”表示无明显变化;“+”表示藻体边缘松动 、表面不平整 ,
无原生质体游离;“ ++”表示约有 10%的细胞游离。
表 2　混合酶对紫菜的酶解效果
Table 2　Effect of mixed enzyme treatment to Porphyra yezoensis
酶液组成(体积比 1∶1) 酶解效果 细胞成活率 /%
0. 5 h 1 h 1. 5 h 2 h 0. 5 h 1 h 1. 5 h 2 h
单齿螺酶+1%纤维素酶 + ++ +++ ++++ 85. 2 72. 4 61. 3 29. 5
短滨螺酶+1%纤维素酶 + ++ ++ +++ 86. 7 75. 5 69. 1 40. 3
锈凹螺酶+1%纤维素酶 + + ++ +++ 87. 4 78. 5 68. 0 43. 4
石鳖酶+1%纤维素酶 - + ++ ++ 86. 8 80. 1 70. 1 55. 3
单齿螺酶+1. 5%纤维素酶 + +++ ++++ ++++ 79. 4 67. 8 50. 2 21. 8
单齿螺酶+2%纤维素酶 + +++ ++++ ++++ 77. 2 62. 4 43. 4 15. 2
　　注:“ -”表示无明显变化;“ +”表示藻体边缘不齐 、表面不平整 , 无原生质体游离;“ ++”表示外层细胞松动 , 约有 30%的原生质体游离;
“+++”表示有 50%以上的原生质体游离出来;“ ++++”表示全部原生质体游离出来。
2. 3　温度和 pH的影响
由单齿螺酶和 1. 5%纤维素酶制成的混合酶液
(体积比 1∶1)在不同温度下 、酶解 1 h后的结果如表
3所示。温度在 25 ℃时 ,混合酶酶解能力较强 ,并
可获得较高的成活率;温度为 28 ℃时酶解率最高 ,
但成活率仅为 19. 5%。
表 3　温度对酶解率和原生质体成活率的影响
　Table 3　Effect of temperature on the efficiency of enzyme
treatment and the rate of protoplast survival
温度 /℃ 酶解率 /% 成活率 /%
15 13. 2 75. 5
20 57. 2 67. 8
25 77. 1 62. 3
28 90. 4 19. 5
pH 对酶解率和原生质体成活率的影响结果如表
4所示 。由单齿螺酶和1.5%纤维素酶制成的混合酶
液在 pH =6. 5 ,温度为 25 ℃酶解 1 h后 ,酶解率和成
活率均较高(图 1-4),分别可达 80.4%和 65. 0%。酸
碱性过高都会造成紫菜细胞的死亡率升高 。
表 4　pH对酶解率和原生质体成活率的影响
Table 4　Ef fect of pH on the efficiency of enzyme treatment
and the rate of protoplast survival
pH 酶解率 /% 成活率 /%
5. 8 48. 1 31. 4
6. 5 80. 4 65. 0
7. 5 75. 6 64. 2
8. 5 56. 3 50. 5
2. 4　渗透压稳定剂的筛选
由预备实验得出 ,各渗压剂的合适浓度均在 2
mol /L 左右。用单齿螺酶和 1. 5%纤维素酶制成的
混合酶液在 25 ℃, pH =6. 5时 ,分别添加 2 mo l /L
的葡萄糖 、蔗糖 、甘露醇 、山梨醇等 4种渗压剂 ,酶解
68 淮海工学院学报(自然科学版) 2007 年 9 月
1 h 后对紫菜原生质体活性的影响结果如表 5所示 。
由表 5可以看出葡萄糖作为渗压剂效果最好 ,可使
酶解所得的原生质体的成活率由上述的 65. 0%提
高到 80. 7%。
表 5　渗压剂对紫菜原生质体成活率的影响
Table 5　Effect of different penetrants on the rate of
protoplast survival
渗压剂 原生质体总数 /个 成活原生质体数 /个 成活率 /%
葡萄糖 815 658 80. 7
山梨醇 758 539 71. 1
甘露醇 744 508 68. 3
蔗糖 802 531 66. 2
3　讨论
单齿螺 、锈凹螺 、短滨螺和石鳖都是藻食性[ 6] 的
贝类 ,理论上都可以作为紫菜的解壁酶源 ,但单一使
用效果不佳 。本研究筛选出单齿螺酶与质量分数
1. 5%的纤维素酶制成的混合酶液可以成分互补 ,取
得了良好的分离效果 。而且单齿螺与国产的纤维素
酶价格低廉 ,与以往报道的鲍鱼和进口酶[ 3-5] 相比可
以大幅降低成本 ,有望成为经济高效的制备条斑紫
菜原生质体的工具酶 。
酶的活性与温度 、pH 有关。对于酶活性而言 ,
最适温度是 40 ～ 50 ℃,纤维素酶的最适 pH 为 5 ～
6[ 7] ,但这对细胞是不合适的 。本实验结果表明温度
为 25 ℃, pH =6. 5 ,酶解 1 h为较合适的酶解条件 。
温度为 28 ℃时虽然可以提高酶解效果 ,但是细胞成
活率降低 ,同样过酸 、过碱和酶解时间过长都会造成
细胞的大量死亡 。
由于酶解去除细胞壁后 ,细胞失去了细胞壁的
保护作用 ,如果溶液和细胞内的渗透压不平衡 ,就会
造成原生质体因膨胀或收缩过度而导致质膜破
裂[ 8] 。加入适当的渗压剂可以维持溶液和原生质体
内的渗透压大致相等[ 7] 。本实验结果表明葡萄糖能
有效提高酶解所得的原生质体的成活率 ,且价格相
对便宜 ,为理想的渗压剂。
酶解后的单细胞或原生质体从色素上可以进行
死活鉴别:明显死亡的细胞色素体解体 ,细胞呈淡绿
色;而活力强的细胞色素体清晰 , 颜色深绿至紫
红[ 9] 。但在实际操作中 ,发现有些细胞的色素体呈
浅绿色 ,模糊但并未解体 ,其死活情况难以确定 。本
实验采用的中性红染色法 ,可以更准确 、客观地计算
出成活率。
藻体在酶解时置于振荡器上 ,轻轻振荡可促使
游离的原生质体从组织块中释放出来[ 3] ,因本实验
的研究重点在于筛选工具酶 ,为避免外力因素的干
扰故未采取该措施 。张士璀等报道[ 7] 在海带(L.
saccharina)的原生质体分离时 ,加入阳离子螯合剂
预处理藻体组织会明显提高原生质体的产率。这种
方法是否适用于紫菜尚需要进一步研究。
参考文献:
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生物工程进展 , 2000 , 20(6):3-4.
[ 2] 　DAI Jixun , ZH ANG Quanqi , BAO Zhenmin. Gene tic
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山东海洋学院学报 , 1982 , 12(4):37-50.
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[ J] . 水产科技情报 , 2000 , 27(6):256-258.
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[ M] .北京:中国农业出版社 , 1996.
[ 7] 　张士璀 , 范晓 , 马军英 , 等. 海洋生物技术原理和应用
[ M] .北京:海洋出版社 , 1998.
[ 8] 　李志勇.细胞工程[ M] . 北京:科学出版社 , 2003.
[ 9] 　王素娟 ,张小平 , 徐志东 ,等. 坛紫菜营养细胞和原生质
体培养研究[ J] . 海洋科学 , 1987 , 11(1):1-7.
(责任编辑:秦海明)
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