全 文 ：研究与探讨
2012年第18期
Vol . 33 , No . 18 , 2012
山杏仁多肽的制备及
清除自由基能力研究
山杏仁是营养价值很高的药食两用型食品。山
杏仁中含有大量营养成分，丰富的蛋白质，含量达
20%多，比一般谷类作物的两倍还要多，此外山杏仁
的蛋白质含有人体所需的18种氨基酸，与谷物氨基
酸种类能够互补，是一种优质的植物蛋白资源[1]。蛋
白质经蛋白酶水解制成多肽产品具有一定的抗氧化
活性。陈美珍等[2]研究发现大豆分离蛋白酶解物具有
清除羟自由基的能力，包怡红等[3]研究了核桃风味蛋
白酶酶解产物的抗氧化活性。大量报道证明，自由基
的氧化与多种疾病发生机制相关，过多的自由基会
直接破坏人体蛋白质，从而引发心脑血管疾病，糖尿
病，高血压等[4]。张强等[5]报道米糠蛋白酶解前4h内，
随着水解度（DH）提高，其抗氧化活性逐渐增强，但
酶解4h后其抗氧化活性有所下降；而陈力宏等[6]对蚕
茧层抗氧化肽的研究发现，蚕茧层酶解物的抗氧化
活性并未随DH的提高而增强。仅以DH作为考察指
标不能完全确定酶解工艺条件。目前，对山杏仁蛋白
的酶解工艺研究仅限于内切酶，而对外切酶的研究
报道较少，而不同的蛋白酶酶解所产生的活性肽也
不同。本文以风味蛋白酶对山杏仁蛋白进行酶解，以
酶解物的DPPH自由基清除率为指标进行二次旋转
正交组合实验，确定高体外抗氧化活性的脱脂山杏
仁酶解物的制备工艺条件。然后通过超滤分离技术，
获得不同分子量的山杏仁多肽，研究不同分子量对
DPPH自由基清除率的影响。
黄 昆1，顾 欣1，王文江1，李 迪2，李雅松1，王建中1，*
（1.北京林业大学生物科学与技术学院，北京 100083；
2.河北化工医药职业技术学院，河北石家庄 050026）
摘 要：以DPPH自由基清除率为指标，对风味蛋白酶酶解脱脂山杏仁的工艺进行研究。在单因素实验的基础上，采用
二次回归正交旋转组合设计对其酶解工艺进行优化。建立脱脂山杏仁酶解液的DPPH自由基清除率与蛋白酶用量、酶
解温度及酶解pH，3个实验因素的正交回归模型方程，通过频率分析法得到酶解最佳工艺条件：蛋白酶用量0.50%，酶
解温度55℃，酶解pH7.2，酶解时间4h，最佳条件下酶解液的DPPH自由基清除率为56.8%。 在此条件下，山杏仁蛋白酶
解液清除DPPH自由基的IC50值为4.18mg/mL。 经过超滤分离获得不同分子量的抗氧化多肽，用DPPH自由基清除率评
价其抗氧化性，得分子量小于5ku的肽清除DPPH自由基能力最强。
关键词：山杏仁，DPPH自由基，酶解条件，分子量
Research of the preparation of peptides derived from almond
and its potential on free radical scavenging
HUANG Kun1，GU Xin1，WANG Wen-jiang1，LI Di2，LI Ya-song1，WANG Jian-zhong1，*
（1.College of Biological Science and Technology，Beijing Forestry University，Beijing 100083，China；
2.Hebei Chemical & Pharmaceutical College，Shijiazhuang 050026，China）
Abstract：Almond which were prepared after extraction of oil were hydrolyzed using flavour proteases，and the
effect of proteases concentration，hydrolysis temperature and initial pH on the enzymolysis degree were studied
（evaluated by DPPH free radical scavenging potential）. The enzymatic hydrolysis process was optimized by
conducting quadratic orthogonal rotation regression combination design test. The optimum condition for
enzymatic hydrolysis of the almond dregs was：amounts of enzyme 0.50%，temperature 55℃，pH7.2，time was
4h. Under such conditions，the DPPH free radical scavenging potential could reach 56.8%. On this condition，the
IC50 of DPPH reductive activity was 4.18mg/mL. Antioxidant activities of almond polypeptides with different
molecular weights which were separated by ultrafiltration were investigated. Results showed that the fraction of
＜5ku exhibited the highest activity.
Key words：almond；DPPH radical；enzymatic hydrolysis conditions；molecular weight
中图分类号：TS201.2 文献标识码：A 文 章 编 号：1002-0306（2012）18-0107-05
收稿日期：2012－03－22 * 通讯联系人
作者简介：黄昆（1987－），女，硕士，研究方向：天然产物研究与开发。
基金项目：林业公益性行业科研专项（201004081）。
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Science and Technology of Food Industry 研究与探讨
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1 材料与方法
1.1 材料与仪器
脱苦山杏仁 露露集团；风味蛋白酶（酶活力
500LAPU/g） 丹麦诺维信（Novo）公司；1，1一二苯基
苦基苯肼（DPPH）、无水乙醇、石油醚、盐酸、氢氧化
钠、甲醛 北京蓝弋试剂有限公司，分析纯。
HHS4恒温水浴锅 上海浦东跃新科学仪器厂；
752紫外可见分光光度计 上海光谱仪器有限公司；
台式离心机、FD-1冷冻干燥机 美国Thermo Fisher
Scientific公司；PHS-25 pH计 上海精密科学仪器有
限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 原料预处理 将脱苦山杏仁粉碎，在室温下
用石油醚脱脂3次，置通风橱中24h以挥发有机溶剂，
得脱脂山杏仁粉，过60目筛，于冰箱4℃保存备用。
1.2.2 山杏仁蛋白的酶解 取1g脱脂山杏仁粉，按
1∶30底物浓度加入蒸馏水，放入恒温振荡水浴锅中，
待温度恒定后，调至适当的pH，按一定的酶底比加入
风味蛋白酶开始水解，水解一定时间后，终止反应，
沸水浴灭酶15min。冷却后以8000r/min离心30min，取
上清液调节pH为中性，冷冻干燥，4℃贮藏备用。
1.2.3 分析测定方法
1.2.3.1 对DPPH自由基体系抗氧化性的测定[7] 取
2mL不同水解度的酶解液加入 2mL DPPH溶液
（0.1mmol/L DPPH 95%乙醇溶液），混匀后在室温下
避光反应30min，在517nm下测吸光值Ai，空白组为
2mL 95%乙醇代替DPPH溶液，加入2mL去离子水测
定吸光值为Aj，对照组为2mL DPPH溶液加上2mL去
离子水代替样品在517nm下测定其吸光值A0，并以等
体积去离子水和95%乙醇混合液空白调零。平行测3
次，取平均值。
清除率按下式计算：
清除率（%）=[1-（Ai-Aj）/A0]×100
式中：A0-对照组吸光值；Ai-样品组吸光值；Aj-
空白组吸光值。
样品对DPPH自由基的半数清除浓度IC50的计算
方法为：制作浓度-清除率曲线，建立线性回归方程，
根据方程求得IC50[8]。
1.2.3.2 蛋白含量的测定 采用微量凯氏定氮法
测定[9]。
1.2.3.3 水解度的测定 采用甲醛滴定法[10]。在3个
标有号码的100mL三角瓶中，分别加入2mL山杏仁酶
解液，再分别加入5mL蒸馏水及1%的酚酞溶液3滴，
摇匀。用0.1mol/L标准氢氧化钠溶液滴定3号瓶内溶
液至微红色，作为终点标准并记下读数V2，向1、2号
瓶内分别加入2mL中性甲醛溶液混匀，再用标准氢
氧化钠溶液滴定至和3号瓶内溶液颜色相同为止，记
下读数，求出平均值V1，按下式计算水解度。
游离氨基氮（mg/mL）= NNaOH（V1-V2）×142 式（1）
DH（%）=[游离氨基酸（mg/mL）×上清液体积（mL）
×0.001]/[样品量（g）×总氮含量]×100 式（2）
1.2.4 酶解单因素实验 分别选取对酶解物抗氧化
性影响的四个因素，即酶解时间（1～12h），酶解液初
始pH（6、6.5、7、7.5、8），酶解温度（40、45、50、55、
60℃），加酶量（0.15%、0.3%、0.45%、0.6%、0.75%），
分别考察其对DPPH自由基清除率的影响。
1.2.5 二次旋转正交组合设计优化酶解工艺 根据
单因素实验的结果分析确定各因素水平范围，取单
因子实验中效果较好的参数作为各因素的零水平，
以DPPH清除率为指标，进行三元五次回归正交旋转
组合实验设计[11]。整个实验设23个组合，用DPS数据
处理系统对实验结果进行分析，从而确定最优酶解
工艺。因素编码见表1。
1.2.6 酶解物半数抑制浓度计算 在最优酶解条件
下，山杏仁蛋白酶解产物经冷冻干燥后，制成不同的
浓度梯度，计算半抑制浓度。分别配制质量浓度为
12.5、10、7.5、5、2.5mg/mL 的样品溶液，做DPPH自由
基清除率实验。
1.2.7 酶解产物超滤分离 在最优酶解条件下，对
酶解后的产物进行分离纯化，冷冻干燥。依次使用
30、10、5ku的超滤膜对酶解液进行超滤处理截留不
同分子量的山杏仁多肽，得到不同组分的肽段，分子
质量范围：PⅠ，＞30ku；PⅡ，10~30ku；PⅢ，5~10ku；
PⅣ，＜5ku。对以上不同组分分别测定其DPPH自由基
清除的能力。
2 结果与分析
2.1 单因素实验结果
2.1.1 酶解时间对酶解效果的影响 设定酶解温度
为50℃，酶解pH为6.5，加酶量为0.30%，分别测定不
同时间下脱脂山杏仁粉的酶解物水解度及DPPH自
由基的清除率。
由图1可见，未经水解的脱脂山杏仁粉具有一定
的DPPH清除能力，随着酶解时间的增加，清除率逐
步增大，在4h处，清除率达到了最大值42.87%。随着
因素
下星臂号
-1.682
下水平
-1
零水平
0
上水平
1
上星臂号
1.682
X1蛋白酶用量（%） 0.35 0.40 0.45 0.50 0.55
X2酶解温度（℃） 45 50 55 60 65
X3酶解液初始pH 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5
表1 二次回归正交旋转组合设计因素水平编码表
Table 1 Factors and levels of quadratic orthogonal rotation
regression combination design
图1 酶解时间对山杏仁蛋白水解度和DPPH自由基清除率的影响
Fig.1 Influence of enzymolysis time on degree of hydrolysis and
DPPH free radical scavenging potential
30
25
20
15
10
5
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
水
解
度
（
%）
酶解时间（h）
50
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0 D
PP
H
自
由
基
清
除
率
（
%）
水解度 DPPH自由基清除率
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酶解时间的增加，酶解产物的 DH逐渐增大，具有特
定功能的活性肽是分子量较小的短肽，风味蛋白酶
主要是外切酶，只水解肽链两端氨基酸所形成的肽
键，若单纯地追求高DH指标，必然会导致产生较多
的游离氨基酸，所以选取酶解时间为4h。
2.1.2 加酶量对酶解液清除DPPH自由基效果的影
响 温度为55℃，酶解液pH为7，酶解时间4h，研究不
同蛋白酶添加量0.15%、0.30%、0.45%、0.60%、0.75%，
对山杏仁蛋白酶解液抗氧化性的影响。由图2可知，
随着加酶量的增加，清除率逐渐增高，当加酶量到
达0.45%时，清除率达到了最大值54.23%，随着加酶
量的增加，清除率无明显变化，综上考虑，选取0.45%
为最适加酶量。
2.1.3 酶解温度对酶解液清除DPPH自由基效果的
影响 研究在40、45、50、55、60℃五个温度水平下，
加酶量为0.50%，酶解液pH为7，酶解时间为4h的山
杏仁酶解液的抗氧化性的影响。由图3可知，当温度
达到55℃时清除率达到最大值58.77%，而后温度上
升，清除能力显著下降。
2.1.4 酶解pH对酶解液清除DPPH自由基效果的影
响 温度为50℃，加酶量为0.50%，酶作用时间为4h。
研究反应体系不同pH6、6.5、7、7.5、8，对杏仁蛋白水
解液抗氧化性的影响。由图4可知，pH在6.5时，清除
率到达最大值59.86%，之后随着pH的增加，清除率
显著下降。
2.2 山杏仁蛋白酶解工艺的优化
2.2.1 经验数学模型的建立 实验结果见表2。
采用DPS数据处理系统对数据进行处理拟合，得
到自由基清除率的回归方程：
Y =0.57379 +0.02215X1 +0.00417X2 +0.01262X3 -
0.01579X12 -0.01869X22 -0.01557X32 +0.00747X1X2 +
0.00100X1X3+0.00157X2X3
2.2.2 模型显著性检验及参数重要性分析 为检验
回归方程的有效性，按F1=失拟均方/误差均方，F2=回
归均方/剩余均方的程序进行检验。由表3可知，失拟
项F值达到了0.01显著水平，但未达到0.05水平上的
显著，说明所建立的二次正交旋转组合设计回归方
程虽然有意义，但是存在失拟因素。二次回归模型的
F值为14.65，p＜0.01，说明所建立的模型的拟合极显
著，实验数据和二次数学模型是吻合的，不需要改变
回归模型，方程能较好地表达DPPH自由基清除率与
蛋白酶用量，酶解温度和酶解初始pH之间的关系。各
因素的F值反映其对实验指标的重要性，其值越大，
对实验的影响越大，由表3可知，影响酶解液清除率
的主次因素排序为：蛋白酶用量（X1）＞酶解液初始pH
（X3）＞酶解温度（X2）。
脱脂山杏仁粉酶解液的DPPH自由基清除率与
试验号 X1 X2 X3 DPPH自由基清除率（%）
1 -1 -1 -1 58.32
2 -1 -1 1 52.55
3 -1 1 -1 53.94
4 -1 1 1 52.87
5 1 -1 -1 49.52
6 1 -1 1 48.22
7 1 1 -1 52.20
8 1 1 1 47.46
9 -1.682 0 0 50.64
10 1.682 0 0 56.57
11 0 -1.682 0 51.73
12 0 1.682 0 53.84
13 0 0 -1.682 52.37
14 0 0 1.682 54.96
15 0 0 0 57.37
16 0 0 0 56.67
17 0 0 0 57.30
18 0 0 0 56.88
19 0 0 0 56.08
20 0 0 0 58.40
21 0 0 0 57.98
22 0 0 0 58.26
23 0 0 0 57.23
表2 二次回归正交旋转组合设计及试验结果
Table 2 Results of quadratic orthogonal rotation regression
combination design test
图3 温度对山杏仁蛋白水解物清除DPPH自由基的影响
Fig.3 Influence of temperature on DPPH free radical
scavenging potential
60
58
56
54
52
50
48
46
44
42
40
35 40 45 50 55 60 65
DP
PH
自
由
基
清
除
率
（
%）
温度（℃）
图4 pH对山杏仁蛋白水解物清除DPPH自由基的影响
Fig.4 Influence of pH on DPPH free radical scavenging potential
60
58
56
54
52
50
48
46
44
42
40
5.5 6 6.5 7 7.5 8 8.5
DP
PH
自
由
基
清
除
率
（
%）
pH
图2 加酶量对山杏仁蛋白水解物清除DPPH自由基的影响
Fig.2 Influence of proteases concentration on DPPH free
radical scavenging potential
60
55
50
45
40
35
30
25
20
15
10
0.00 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 0.60 0.70 0.80 0.90
DP
PH
自
由
基
清
除
率
（
%）
加酶量（%）
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酶用量、温度及pH的相关系数R=回归平方和/总平方
和=91.2%，表明建立的数学模型的因素对清除率的
影响占91.2%，而其他因素的影响和误差仅占8.8%。
对回归系数显著性检验，在0.01显著水平剔除不
显著项后得到优化后的回归方程为：
Y=0.57379+0.02215X1+0.01262X3-0.01579X12-
0.01869X22-0.01557X32
2.2.3 最高清除率模拟分析 通过DPS软件分析，采
用频率分析法寻优 [11]，经分析，其中DPPH自由基清
除率高于54%的方案有22个，对数学回归的模型分
析结果见表4。
由表4可以看出，在95%的分布区间内，杏仁蛋
白酶解液DPPH自由基的清除率高于54%的酶解方
案为蛋白酶用量0.48%～0.52%，酶解温度为53～57℃，
酶解液初始pH为7.1～7.4。为实际操作方便，取优化
方案的平均值为最优酶解方案，即，蛋白酶用量为
0.50%，酶解温度为55℃，酶解初始pH7.2，酶解时间
为4h。经验证，此时酶解液的DPPH自由基清除率为
56.8%。与理论值Y=58%较为接近，进而验证了回归
模型的合理性。
2.3 山杏仁蛋白酶解产物的半数抑制浓度（IC50）
由图5可知，山杏仁多肽对DPPH自由基的清除
能力随着浓度的增加而增大。其回归方程为
Y=-0.0061x2+0.1494x+0.0046，R2=0.998，得山杏仁蛋
白酶解物的IC50为4.18mg/mL，高于绿豆多肽 [12]，对
DPPH自由基有较好的清除作用。
2.4 超滤分离山杏仁多肽
在最优酶解条件下，对山杏仁蛋白酶解液进行
超滤分离，得到四种不同的组分PⅠ，PⅡ，PⅢ，PⅣ，
冻干后配制成不同浓度梯度的山杏仁多肽溶液，按
照1.2.3.1的方法测定其DPPH自由基的清除能力。由
图6可知，山杏仁多肽的抗氧化性与其分子量有关，
且目前相关报道报道已经证实分子量的大小与多肽
活性间存在相关性[13-14]。组分PⅣ（＜5ku）的DPPH自由
基清除率最高，其IC50值达到了3.14mg/mL，表明抗氧
化活性肽主要集中在一些小分子多肽，组分PⅡ，PⅢ，
PⅣ之间差异显著（p＞0.05），组分PⅣ清除率略高，可
能由于样品本底颜色偏黄所干扰及与风味蛋白酶的
酶切位点有关。
3 结论
通过二次正交回归旋转设计和多项式回归统计
分析，得到山杏仁蛋白酶解液的DPPH自由基清除率
Y与蛋白酶用量（X1）、酶解温度（X2）、酶解液pH（X3）3
个实验因素之间的正交回归模型方程，确定了风味
蛋白酶酶解山杏仁蛋白最佳酶解方案：蛋白酶用量
为0.50%，酶解温度为55℃，酶解液pH为7.2，酶解4h。
在最佳酶解条件下，酶解液DPPH自由基清除率为
56.8%，与理论值较为接近。
在最优条件下测得山杏仁多肽粗品的IC50值为
4.18mg/mL，酶解液经超滤膜分离后，得到四种组分，
用DPPH自由基清除率作为测定指标，考察其抗氧化
图6 不同分子量的山杏多肽对DPPH自由基的清除能力比较
Fig.6 The DPPH free radical scavenging potential of
almond polypeptides at various molecular weight
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
0 5 10 15 20 25 30
DP
PH
自
由
基
清
除
率
（
%）
浓度（mg/mL）
PⅠ
PⅡ
PⅢ
PⅣ
变异来源 平方和 自由度 均方 F比值 p
X1 0.0067 1 0.0067 38.8017 0**
X2 0.0002 1 0.0002 1.3719 0.2625
X3 0.0022 1 0.0022 12.5944 0.0036**
X12 0.004 1 0.004 22.9266 0.0004**
X22 0.0055 1 0.0055 32.1206 0.0001**
X32 0.0039 1 0.0039 22.3145 0.0004**
X1X2 0.0004 1 0.0004 2.5881 0.1317
X1X3 0 1 0 0.0463 0.8329
X2X3 0 1 0 0.1149 0.74
回归 0.0228 9 0.0025 F2=14.64837 0**
剩余 0.0022 13 0.0002
失拟 0.0018 5 0.0004 F1=6.14091 0.0126*
误差 0.0005 8 0.0001
总和 0.025 22
注：标有** 和*的数值显著水平分别为p＜0.01和p＜0.05。
表3 方差分析表
Table 3 The variance analysis
水平
X1 X2 X3
次数 频率 次数 频率 次数 频率
－1.682 0 0 0 0 0 0
－1 0 0 6 0.2727 2 0.0909
0 8 0.3636 10 0.4545 9 0.4091
1 8 0.3636 6 0.2727 9 0.4091
1.618 6 0.2727 0 0 2 0.0909
合计 22 1 22 1 22 1
加权均数 0.822 0 0.471
方差 0.144 0.157 0.156
95%的分布区间 0.539～1.105 －0.309～0.309 0.165～0.777
最优方案 0.48%～0.52% 53～57 7.1～7.4
表4 变量取值的频率分析
Table 4 Frequency analysis of variables
图5 山杏仁蛋白酶解产物对DPPH自由基的清除能力
Fig.5 The DPPH free radical scavenging potential of
almond polypeptides at various concentrations
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
0 2.5 5 7.5 10 12.5
DP
PH
自
由
基
清
除
率
（
%）
浓度（mg/mL）
（下转第115页）
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能力，得分子量小于5ku的组分抗氧化性最强，其IC50
值为3.14mg/mL，表明风味蛋白酶虽为外切酶，但控
制好酶解工艺，仍可得到抗氧化活性较高的多肽，在
改善风味的同时发挥更好的功能性质。
参考文献
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