全 文 ：第２１卷　第３期
　Vol．２１　 No．３
草　地　学　报
ACTA AGRESTIA SINICA
　　　　　２０１３年 ５月
　 May　２０１３
doi:１０．１１７３３/j．issn．１００７Ｇ０４３５．２０１３．０３．０２９
紫花苜蓿根瘤菌培养基的优化研究
周冀琼１,邓　波１∗,马晓彤２,张英俊１,周　可１
(１．中国农业大学动物科技学院草业科学系,北京　１００１９３;２．中国农业科学院土肥所,北京　１０００８１)
摘要:以苜蓿根瘤菌(Sinorhizobiummeliloti)ACCC１７６３１和ACCC１７６７６为供试菌株,采用单因素碳氮源利用试验
和正交设计试验,确定最佳碳源、氮源及培养基配方.结果表明:２株供试菌株最佳碳源为蔗糖,最佳氮源分别为大
豆粉和酵母粉.根瘤菌ACCC１７６３１(ACCC１７６７６)的最佳培养基配方(g􀅰L－１)为:蔗糖２０,大豆粉(酵母粉)２．４,
K２HPO４０．２５,KH２PO４０．２５,MgSO４􀅰７H２O０．２,NaCl０．１,pH为６．８~７．０.
关键词:紫花苜蓿;根瘤菌;培养基;优化
中图分类号:S１５４．３８１　　　　文献标识码:A　　　　　文章编号:１００７Ｇ０４３５(２０１３)０３Ｇ０６０７Ｇ０５
OptimizationofAlfalfaRhizobiumMedium
ZHOUJiＧqiong１,DENGBo１∗,MAXiaoＧtong２,ZHANGYingＧjun１,ZHOUKe１
(１．DepartmentofGrasslandScience,ColegeofAnimalScience&Technology,ChinaAgriculturalUniversity,
Beijing１００１９３,China;２．SoilandFertilizerInstitute,ChineseAcademyofAgriculturalScience,Beijing１０００８１,China)
Abstract:TheoptimummediaandformulasofrepresentativestrainsSinorhizobiummelilotiACCC１７６３１
andACCC１７６７６wereconfirmedbysinglefactorcarbonsourceandnitrogensourceutilizationexperiment
andorthogonaldesignexperiment．Resultsshowedthattheoptimumcarbonsourcewassucrose,andthe
optimumnitrogensourcewasyeastextractandsoybeanmeal．Theoptimum mediumformulasofACＧ
CC１７６３１(ACCC１７６７６)was(g􀅰L－１):sucrose２０＋soybeanmeal(yeastextract)２．４＋K２HPO４０．２５＋
KH２PO４０．２５＋MgSO４􀅰７H２O０．２＋NaCl０．１,andpH６．８~７．０．
Keywords:Alfalfa;Rhizobium;Medium;Optimization
　　紫花苜蓿(MedicagosativaL．)作为世界上栽
培面积最大的豆科牧草,素有“牧草之王”的美称,营
养丰富、蛋白质含量高、适口性好,可解决养殖业中
蛋白质饲料不足的问题[１].研究表明,播种前对苜
蓿进行根瘤菌接种,可增加苜蓿的出苗率、抗病虫害
能力,明显提高牧草产量以及营养价值[２].接种根
瘤菌剂已成为世界各国豆科作物增产的一项技术措
施[３],在许多国家都有大规模的商品菌剂生产和出
售,应用面积不断扩大[４].为了适应中国苜蓿根瘤
菌肥生产的需求,本研究通过单因素试验和正交试
验优化筛选最适合苜蓿根瘤菌(SinorhizobiummeＧ
liloti)生长的碳源、氮源及培养基配方,由于不同的根
瘤菌对其培养基中的最佳碳氮源的选择存在差异,故
选择２株苜蓿根瘤菌ACCC１７６３１和ACCC１７６７６作
为供试菌株进行对比[５],以期为苜蓿根瘤菌今后的研
究与菌肥生产提供科学依据.
１　材料与方法
１．１　材料
菌株及其特性:快生型苜蓿根瘤菌ACCC１７６３１
和ACCC１７６７６,由中国农业微生物菌种保藏中心提
供.２株菌均属于苜蓿中华根瘤菌,菌体小杆状,在
根瘤菌培养基上菌落为圆型、乳白色、半透明,边缘整
齐,有粘质,在B．T．B反应中产酸,在石蕊牛奶中均
凝结.２株根瘤菌在pH４．０~９．０范围内均能生长.
根瘤菌ACCC１７６３１在含盐量为４．０％ NaCl的YMA
培养基中生长正常,ACCC１７６７６耐盐性略差,在含盐
收稿日期:２０１２Ｇ１２Ｇ１３;修回日期:２０１３Ｇ０３Ｇ１１
基金项目:国家牧草产业技术体系(CARSＧ３５);公益性行业(农业)科研专项(２０１００３０６１);“十二五”农村领域国家科技支撑计划课题
(２０１２BAD１３B０７)资助
作者简介:周冀琼(１９８７Ｇ),女,甘肃武威人,硕士研究生,研究方向为草地资源、生态与管理,EＧmail:qiongqionghh２２１＠１６３．com;∗通信
作者Authorforcorrespondence,EＧmail:dengbo６７＠cau．edu．cn
草　地　学　报 第２１卷
量３．５％ NaCl的YMA培养基中生长正常,２株菌
均适合华北、东北、西北等盐碱土地区接种使用[６].
培养基:YMA液体培养基(g􀅰L－１):甘露醇１０,
K２HPO４０．２５,KH２PO４０．２５,MgSO４􀅰７H２O０．２,酵
母粉０．８,NaCl０．１,蒸馏水１０００mL,pH６．８~７．０.
１．２　试验方法
菌种活化:在斜面培养基上２８℃培养４８h后,
接种到YMA液体培养基中,２８℃,１５０r􀅰min－１转
速的摇床中震荡培养４８h制成接种液.
培养基碳源的筛选:YMA培养基中分别用等
量蔗糖、葡萄糖、甘露醇及麦芽糖作为碳源,培养基
其他部分保持不变.将活化菌液按１％(V/V)接种
量接入装有５０mL液体培养基的１００mL三角瓶
中,２８℃,１５０r􀅰min－１震荡培养.培养期间用分
光光度计每６h测定菌液OD６００nm吸光度值,连续测
定６０h,分别绘制苜蓿根瘤菌 ACCC１７６３１和 ACＧ
CC１７６７６在不同碳源下的生长曲线并选出各自的
最佳碳源[７],每处理均重复４次.
培养基氮源的筛选:YMA培养基中分别用等量
酵母粉、蛋白胨、大豆粉作为氮源进行试验,培养基其
他成分不变.将活化菌液按１％(V/V)接种量接入
装有５０mL液体培养基的１００mL三角瓶中,２８℃,
１５０r􀅰min－１震荡培养.用分光光度计测定OD６００nm
值,绘制苜蓿根瘤菌ACCC１７６３１和ACCC１７６７６在不
同氮源下的生长曲线并选出最佳氮源.
正交试验:根据上述单因子试验得出结果,对选
定的碳源、氮源、磷源以及 MgSO４􀅰７H２O这４种
主要成分进行L９(３４)正交试验,培养４８h后,用分
光光度计测定OD６００nm值,分析４种物质对苜蓿根瘤
菌的影响度及最佳剂量组合[８Ｇ９].
验证试验:用已筛选得到的最佳培养基与试验
中OD６００nm值最高的培养基进行比较,验证正交试验
的结果.
２　结果与分析
２．１　培养基中的不同碳源对苜蓿根瘤菌生长的
影响
碳源是根瘤菌培养基中必不可少的组成成分,
是构成根瘤菌细胞和代谢产物中碳架来源的重要营
养物质,因此对根瘤菌培养基中碳源进行筛选对根
瘤菌生长有至关重要的作用[１０].蔗糖、葡萄糖、甘
露醇以及麦芽糖４种常见碳源对苜蓿根瘤菌 ACＧ
CC１７６３１和ACCC１７６７６生长的影响结果如图１和
图２所示.不同碳源对苜蓿根瘤菌ACCC１７６３１和
ACCC１７６７６生长具有不同的影响.根瘤菌 ACＧ
CC１７６３１在蔗糖和甘露醇为碳源的培养基中生长
较好,且蔗糖略优于甘露醇,生长６０h后,其OD６００
值最高分别达到１．８８４和１．８１９.在葡萄糖为碳源
的培养基中生长缓慢,对数生长时间短,其OD６００值
最高达到１．２０３,在以麦芽糖为碳源的培养基中生
长最差,其OD６００值最高仅达到０．７４５.根瘤菌ACＧ
CC１７６７６在蔗糖为碳源的培养基中生长最好,其
OD６００值高达１．９２０,在甘露醇中生长次之,６０h后
OD６００值为１．５６３,在以葡萄糖和麦芽糖为碳源的培
养基中生长较差.由于甘露醇在生产成本上远高于
蔗糖,所 以 选 择 蔗 糖 作 为 ACCC１７６３１ 和 ACＧ
CC１７６７６根瘤菌培养基进一步优化的碳源.
图１　不同碳源对根瘤菌ACCC１７６３１生长的影响
Fig．１　Effectsofdifferentcarbonsources
onthegrowthofstrainACCC１７６３１
图２　不同碳源对根瘤菌ACCC１７６７６生长的影响
Fig．２　Effectsofdifferentcarbonsourceson
thegrowthofstrainACCC１７６７６
２．２　培养基中的不同氮源对苜蓿根瘤菌生长的
影响
氮源对比试验结果如图３和图４所示.根瘤菌
ACCC１７６３１在大豆粉为氮源的培养基中的生长速
度远快于在其他氮源中的生长速度,６０h后,ACＧ
CC１７６３１在大豆粉中的OD６００值达到２．１２９,在蛋白
８０６
第３期 周冀琼等:紫花苜蓿根瘤菌培养基的优化研究
胨中却仅为１．１６４.由图４可知,根瘤菌 ACCCＧ
１７６７６在以酵母粉为氮源的培养基中生长效果最
好,OD６００最高达到２．０７９,大豆粉次之,其 OD６００最
高达到１．９０５５,蛋白胨的利用效果最差.故选择大
豆粉作为根瘤菌ACCC１７６３１培养基进一步优化的
氮源,而选酵母粉作为根瘤菌 ACCC１７６７６培养基
中的最优氮源.
图３　不同氮源对根瘤菌ACCC１７６３１生长的影响
Fig．３　Effectsofdifferentnitrogensourceson
thegrowthofstrainACCC１７６３１
图４　不同氮源对根瘤菌ACCC１７６７６生长的影响
Fig．４　Effectsofdifferentnitrogensourceson
thegrowthofstrainACCC１７６７６
２．３　培养基优化试验分析
在筛选培养基碳源、氮源的基础上,对培养基的
主要 成 分:蔗 糖、大 豆 粉 (酵 母 粉)、K２HPO４/
KH２PO４ 和 MgSO４􀅰７H２O做正交设计试验,进一
步优化确定最佳组合剂量.正交设计方案及结构如
表１所示.结果表明:ACCC１７６３１在３号配方的培
养基中生长速度最快,其次为６号培养基(表１);由
表２所示方差分析结果表明:大豆粉、K２HPO４/
KH２PO４ 和 MgSO４􀅰７H２O对根瘤菌 ACCC１７６３１
的活菌数影响极显著(F＞F０．０１);蔗糖对其影响不显
著(F＜F０．０５).表３所示极差分析结果表明:ACＧ
CC１７６３１在优化培养基中培养时,４种营养成分对其
生长速度影响顺序是:酵母粉(B)＞MgSO４􀅰７H２O
(D)＞ K２HPO４/KH２PO４(C)＞葡萄糖(A),最佳表现
组合为 A３B３C１D３,即蔗糖２０g,大豆粉２．４g,
K２HPO４０．２５g,KH２PO４０．２５g,MgSO４􀅰７H２O０．２
g;ACCC１７６７６在８号配方的培养基中生长速度最
快,其次是６号培养基(表１).表４所示方差分析结
果表明:蔗糖、大豆粉、K２HPO４/KH２PO４ 以及 MgＧ
SO４􀅰７H２O对根瘤菌ACCC１７６７６的活菌数影响均
极显著(F＞F０．０１).而表３所示极差分析结果表明:
ACCC１７６７６在优化培养基中培养时,４种营养成分对
其生长速度影响的顺序是:MgSO４􀅰７H２O(D)＞酵母
粉(B)＞葡萄糖(A)＞K２HPO４/KH２PO４(C),最佳表
现组合为 A３B３C１D３,即蔗糖２０g,酵母粉２．４g,
K２HPO４０．２５g,KH２PO４０．２５g,MgSO４􀅰７H２O
０．２g.
２．４　优化培养基的验证试验
对正交试验得出的优化培养基与它们的常规培
养基及２株供试菌株在正交试验中生长速度最快的
表１　正交设计与试验结果
Table１　Orthogonaldesignandexperimentresults
试验号
Code
因素Factors/g 试验结果Results(OD６００)
蔗糖
Sucrose(A)
１７６３１:大豆粉Soybeanmeal
１７６７６:酵母粉Yeastextract(B)
　 K２HPO４　KH２PO４
(C)
MgSO４􀅰７H２O
(D)
１７６３１ １７６７６
１ １(１０) １(０．８) １(０．２５　０．２５) １(０．０５) １．８０１ １．０７８
２ １(１０) ２(１．６) ２(０．４　０．４) ２(０．１) １．６３７ １．７２１
３ １(１０) ３(２．４) ３(０．５　０．５) ３(０．２) ２．０６９ １．８１７
４ ２(１５) １(０．８) ２(０．４　０．４) ３(０．２) １．７７９ １．５０７
５ ２(１５) ２(１．６) ３(０．５　０．５) １(０．０５) １．６３５ １．１４６
６ ２(１５) ３(２．４) １(０．２５　０．２５) ２(０．１) １．９３６ １．８４４
７ ３(２０) １(０．８) ３(０．５　０．５) ２(０．１) １．８０５ １．５６２
８ ３(２０) ２(１．６) １(０．２５　０．２５) ３(０．２) １．８７３ １．９５４
９ ３(２０) ３(２．４) ２(０．４　０．４) １(０．０５) １．８４９ １．４７２
９０６
草　地　学　报 第２１卷
表２　根瘤菌ACCC１７６３１正交试验方差分析表
Table２　AnalysisofvarianceofstrainACCC１７６３１byorthogonaltext
变异系数Variationcoefficient SS DF MS F F０．０５ F０．０１ 显著性Significance
蔗糖Sucrose ０．０１２５６ ２ ０．００６２８ ３．２２ ４．２６ ８．０２
大豆粉Soybeanmeal ０．１７３３４ ２ ０．０８６６７ ４４．４０ ∗∗
K２HPO４/KH２PO４ ０．０４１７５ ２ ０．０２０８７ １０．６９ ∗∗
MgSO４􀅰７H２O ０．０７０５４ ２ ０．０３５２７ １８．０７ ∗∗
试验误差Experimentalerrors ０．０１７５７ ９ ０．００１９５
　　注(Note):∗∗P＜０．０１
表３　L９(３４)培养基优化试验结果的极差分析表
Table３　Resultsofrangeanalysisbyorthogonaltext
A B C D
１７６３１ １７６７６ １７６３１ １７６７６ １７６３１ １７６７６ １７６３１ １７６７６
k１ １．８３５ １．５３９ １．７９５ １．３８２ １．８７０ １．６２５ １．７６１ １．２３２
k２ １．７８３ １．４９９ １．７１５ １．６０７ １．７５５ １．５６７ １．７９３ １．７０９
k３ １．８４２ １．６６３ １．９５１ １．７１１ １．８３６ １．５０８ １．９０７ １．７５９
R ０．０５９ ０．１６４ ０．２３６ ０．３２９ ０．１１５ ０．１１７ ０．１４６ ０．５２７
最优水平Optimizedlevel A３ A３ B３ B３ C１ C１ D３ D３
因素主次顺序Orderoffactors １７６３１:B＞D＞C＞A
１７６７６:D＞B＞A＞C
表４　根瘤菌ACCC１７６７６正交试验方差分析表
Table４　AnalysisofvarianceofstrainACCC１７６３１byorthogonaltext
变异系数Variationcoefficient SS DF MS F F０．０５ F０．０１ 显著性Significance
蔗糖Sucrose ０．０８７１５ ２ ０．０４３５７ ９４．０９ ４．２６ ８．０２ ∗∗
酵母粉Yeastextract ０．３３７３１ ２ ０．１６８６６ ３６４．１８ ∗∗
K２HPO４/KH２PO４ ０．０４１３０ ２ ０．０２０６５ ４４．５９ ∗∗
MgSO４􀅰７H２O １．０１８３０ ２ ０．５０９１５ １０９９．４１ ∗∗
试验误差Experimentalerrors ０．００４１７ ９ ０．０００４６
　　注(Note):∗∗P＜０．０１
３,８,６号培养基进行验证,结果如图５和图６所示.
根瘤菌ACCC１７６３１培养６０h后在优化培养基和３
号培养基中的生长速度相近,OD６００值分别为２．１２６
和２．０９２,在６号培养基中的OD６００值为１．９９,均高
于常规培养基YMA中的１．４３８;同样根瘤菌 ACＧ
CC１７６７６培养６０h后测定的优化培养基和正交试
验８号培养基的OD６００值分别为２．１２３和２􀆰００２,而
对照YMA只有１．６９４,根瘤菌ACCC１７６３１和ACＧ
CC１７６７６的生长曲线(图５和图６)更进一步说明筛
选出来的优化培养基优于常规YMA培养基.
３　讨论与结论
目前,国内外关于根瘤菌培养基优化的研究主
要集中于大豆(Glycinemax)、花生(ArachishyＧ
pogaea)等经济作物,对豆科牧草,特别是紫花苜蓿
的 研 究 鲜 见 报 道[１１]. 苜 蓿 根 瘤 菌 的 常
规培养基是YMA培养基,但由于YMA培养基是
图５　不同培养基中根瘤菌ACCC１７６３１的生长曲线
Fig．５　GrowthcurveofstrainACCC１７６３１
indifferentculturemedia
半合成培养基,用于大规模发酵生产时,成本较
高[１２].本研究在YMA培养基的基础上针对碳源、
氮源以及培养基的其他主要成分做出了优化.碳
０１６
第３期 周冀琼等:紫花苜蓿根瘤菌培养基的优化研究
图６　不同培养基中根瘤菌ACCC１７６７６的生长曲线
Fig．６　GrowthcurveofstrainACCC１７６７６
indifferentculturemedia
源、氮源的利用试验表明,蔗糖和甘露醇是２株供试
菌株比较理想的碳源,但是蔗糖价格相对较低,故选
蔗糖作为碳源更加经济高效.而大豆粉和酵母粉分
别是根瘤菌 ACCC１７６３１和 ACCC１７６７６最佳的氮
源选择.正交试验以及优化培养基的验证试验得出
根瘤菌ACCC１７６３１(ACCC１７６７６)的最佳培养基配
方(g􀅰L－１):蔗糖 ２０,K２HPO４０．２５,KH２PO４
０􀆰２５,MgSO４􀅰７H２O０．２,大豆粉(酵母粉)２．４,
NaCl０．１,pH６．８~７．０.另外,通过２株供试菌株
的对比试验证明,苜蓿根瘤菌对培养基中碳氮源的
选择虽存在差异,但差异并不显著,仅在苜蓿根瘤菌
对培养基中氮源的选择上存在差异,说明优化出的
培养基比常规根瘤菌培养基更加普遍适用于快生型
苜蓿根瘤菌的培养.
选择优化高活菌数的培养基是生产优质苜蓿根
瘤菌肥的第一步,目前,无论是进行根瘤菌拌种或是
根瘤菌种子包衣,根瘤菌仍存在存活时间短、菌种活
性不易保存的问题,如何保持菌肥或包衣中长期高
效的活菌数还有待于进一步的研究.
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(责任编辑　刘云霞)
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