全 文 ：第 16 卷 第 2 期
Vol. 16 No . 2
草 地 学 报
ACTA AGRESTIA SINICA
2008 年 3 月
Mar . 2008
MsNHX1基因转化紫花苜蓿及转基因植株的鉴定
刘小琳1 , 康俊梅1 , 孙 彦2 , 王继峰1, 胡晓艳1, 3 , 杨青川1*
( 1. 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所, 北京 100094; 2. 中国农业大学草地研究所, 北京 100094;
3.西北农林科技大学资源环境学院, 陕西 712100)
摘要:以紫花苜蓿中苜 1 号 (Medicago sativa L . cv. Zhongmu No. 1) 7 日龄无菌苗子叶为外植体, 建立适用于农杆菌
介导的转基因组织再生体系,并进行 MsNH X 1基因转化试验。MsNHX 1基因编码中苜 1号液泡膜 Na+ / H+ 逆向
转运蛋白,将其转化到中苜 1 号中,以期获得耐盐性更好的苜蓿材料。利用 PCR技术、RTPCR 技术及 Dot Blotting
技术对转基因植株进行鉴定,结果显示:MsNH X1 基因已经整合到中苜 1号基因组内,并且可以转录为 mRNA。
关键词:中苜 1 号; 紫花苜蓿; MsN H X 1 基因; 转化; 转基因植株鉴定
中图分类号: Q785 文献标识码: A 文章编号: 10070435( 2008) 02011506
Agrobacteriummediated Transformation of Alfalfa by MsNHX1 Gene
and Molecular Detection for Transgenic Alfalfa
LIU Xiaolin1 , KANG Junmei1 , SU N Yan2 , WANG Jifeng1 ,
HU Xiaoyan1, 3 , YANG Qingchuan1*
( 1. Institute of Animal Science, Chinese Academy of Ag ricultur al Sciences, Beijing 100094, China;
2. China Ag ricultur al Univ er sity , Beijing 100094, China; 3. Co llege o f Resources
and Environment, No rthwest A& F Univer sity, Yang ling , Shaanx i Pro vince 712100, China)
Abstract: In order to obtain the mater ials w ith bet ter perfo rmance of sal t to ler ance, the plant regener at ion
system mediated by A gr obacter ium tumef aciens was established using the co ty ledons as the explants f rom
the sterile 7day old seedling s of Medicago sativa L. cv Zhongmu No. 1 and the genet ic t ransfo rmat ion of
MsN H X 1 gene w as conducted. The vacuo lar Na+ / H + ant iporter o f Zhongmu N o. 1 w as coded by gene
MsN H X 1 and then transformed back into Zhongmu N o. 1. PCR, RTPCR, and Dot Blo tt ing analy sis w ere
used to verify the t ransgenetic plants and the results indicate that MsN H X 1 gene had been inserted into
the genome of the t ransgenic plants and the ex t rinsic gene had been transcr ipted to mRNA.
Key words: M edicag o sativa L. cv. Zhongmu No. 1; Alfalfa; MsN H X 1 gene; T ransformation; T ransgen
ic plants identif icat ion
目前,土壤盐渍化问题已成为限制农业可持续
发展和生态环境恢复所面临的主要问题 [ 1~ 3] , 而苜
蓿有限的耐盐能力限制着其栽种范围, 急需对其耐
盐性状进行改良,培育耐盐性强的紫花苜蓿(M. sa
ti va)新品种,扩大在盐碱地区的种植范围。随着分
子生物学的快速发展, 借助植物基因工程手段改良
苜蓿性状已成为现代育种的重要途径, 最常用的转
基因方法是建立在植物组培基础上的农杆菌介导
法。1988年, H inchee 等首先用根癌农杆菌介导法
获得了大豆转基因植株 [ 4] , 本实验利用紫花苜蓿遗
传转化中应用最多的根癌农杆菌 LBA4404, 通过
PCR, Southern Blot, RTPCR的方法检测再生植株。
M sN H X 1基因是从中苜 1号中克隆的与耐
盐性相关的基因, 对植物耐盐性起重要作用[ 5]。在
烟草中基因 HRPC的导入可以超量表达[ 6] ,在拟南
芥中, PAP1基因的转入可以 MYB转录因子超量表
达[ 7] ,本研究利用农杆菌介导法将 MsNH X 1基因再
次转化中苜 1号,希望能使 Na+ / H+ 逆向转运蛋白
收稿日期: 20070607; 修回日期: 20070914
基金项目: 十五国家高技术发展计划( 863计划) ( 2002AA241101) ;国家自然科学基金项目( 30471110)
作者简介: 刘小琳( 1982 ) ,女,内蒙古赤峰市人,硕士研究生,研究方向为牧草生物技术; * 通讯作者 Author for correspondence, Email: qchy
ang66@ yahoo. com. cn
草 地 学 报 第 16卷
得到超量表达, 以期进一步提高苜蓿的耐盐性。
1 材料与方法
1. 1 植物材料
中苜 1号 (M edicago sativa L. cv. Zhongmu
No. 1) 7日龄无菌苗子叶;农杆菌菌株为 LBA4404;质
粒为 pBINHX,质粒载体含有 MsN H X 1基因。
1. 2 试剂
Taq DNA 聚合酶、Taq TM Hot Start DNA poly
merase、限制性内切酶 BamH、EcoR、EcoR 、H ind
和 Pst均购自 TaKaRa 公司。DEPC为 AMRESCO
公司产品, Tris 和 RNase A 为 Sigma公司产品,异硫
氰酸胍购自 Promega公司, dNTP 为 TaKaRa 公司产
品。其余常规药品均为进口或国产分析纯级。
逆转录试剂盒为 Promega 公司产品, 核酸纯化
试剂盒为 TaKaRa 公司产品, 点杂交试剂盒为
Roche 公司产品。
1. 3 试验方法
1. 3. 1 苜蓿的转化 a. 直接从- 80 冰箱中取 1
mL 用甘油长期保存的菌液, 加入到 40 mL YEB+
Rif 25 mg / L+ Str 50 mg/ L+ Km 50 mg/ L 液体培
养基中, 180 r/ min 离心, 28 培养过夜至 A 600
0. 6, 准备侵染用。b.将切好的培养 7 d的苜蓿无菌
苗子叶浸泡到农杆菌菌液中, 侵染 8 min;留出一部
分子叶作对照, 分别为: CK 1 : 未侵染的外植体放入
UM+ 2. 4D 2 mg/ L+ KT 0. 25 mg/ L 上,检测培
养基的有效性; CK2 : 未侵染的外植体放入 UM+
2. 4D 2 mg / L+ KT 0. 25 mg/ L+ 75 mg/ L Km+
500 mg/ L Cef上,检测抗生素的有效性。c. 将侵染
过的外植体接种到加盖一层无菌滤纸的 UM+ 2. 4D
2 mg/ L+ KT 0. 25 mg/ L 培养基上,共培养 7 d。d.
取出共培养后的子叶放入三角瓶中,按以下步骤清洗
外植体表面的农杆菌:灭菌ddH 2O;灭菌 ddH2O+ Cef
( 500 mg/ L) ;液体 UM+ Cef( 500 mg/ L) ;每步清洗 20
min,期间不断振荡。e. 将外植体转入诱导愈伤组织
形成的筛选培养基上培养( UM+ 2, 4D 2 mg/ L+ KT
0. 25 mg/ L+ 75 mg/ L Km+ 500 mg/ L Cef) ,约 20 d
继代 1次,并逐渐减少 Cef用量到 100 mg/ L。f .当
子叶分化出抗性愈伤组织时,将其换到诱导体胚分
化的筛选培养基培养( UM + 2. 4D 0. 5 mg/ L+ KT
2 mg / L+ 75 mg/ L Km+ 100 mg / L Cef ) , 约 25 d
继代 1次。g.当抗性芽长到 1~ 1. 5 cm 时,将其转
到 1/ 2M S+ 100 mg/ L Cef 培养基中生根成苗, 约
30 d后生根完全,即可移栽温室。
1. 3. 2 再生植株的 PCR检测 利用 CT AB[ 8] 法少
量提取再生植株的 DNA,以备 PCR扩增检测用。
1. 3. 3 再生植株的 RTPCR鉴定 利用异硫氢酸
胍法提取上述结果呈阳性的植株总 RNA, 用无
RN ase的 DNase I 消化可能存在的 DNA, mRNA
逆转录后, 用引物 GUSF、GU SR进行 RTPCR 电
泳检查(表 1)。
表 1 再生植株特异片段的检测
Table 1 Detect ion of specific fragments o f regenerat ion plants
名称
Name
上游引物
Upstream probe
下游引物
Dow nst ream probe
长度
Lengt h
( bp)
退火温度
Annealing
t emperat ure ( )
GU S部分片段
GUS fragment
GUSF: 5GCAACTGGAC
AAGGCACT3
GUSR: 5GAGCGTCGC
AGAACATTACA3 750 54
35S 启动子片段
35S promot er f ragment
P35S1: 5CTTACGCAG
CAGGTCTCATCA3
P35S2: 5CCACCTTCCTTTT
CCACTATCTT3 530 54
MsNHX 1基因中间片段
MsNHX 1 gene fragment
NHXF: 5CCACCTAT ( AT )A T (A T )
TT (CT )AATGC(AGC) GG( AG) TT3
NHXR: 5CAC( AT ) ACACC( CT )TC(AG)
CC( CAG)AAGAC(AG)AG(AC) CT3 250 52
MsNHX 1基因全长
Whole M sNH X1 gene
Psy: 5CACAATCCCACTATCCTT
CGCAAG3
Pgy: 5CAATTCCACAGTTTT
CGCGATCCA3 1700 60
1. 3. 4 再生植株的 Dot Blot t ing 检测
1. 3. 4. 1 探针标记 以 pBINHX为模板, 用特异引
物(上游引物 5CACAATCCCACTAT CCT T CG
CAAG3, 下 游 引 物 5CCAAAGTT AT T
GAAAGCACCAG3)扩增的 DNA 片段为探针, 探
针标记按照 Roche 公司的 Dig H igh Prime DNA
Labeling and Detect ion Starter Kit 的操作手册
提供的方法进行。
1. 3. 4. 2 Dot Blot t ing 检测 参考 Sambrook 等[ 9]
方法和 Roche公司的 Dig H igh Prime DNA Labe
ling and Detect ion Starter Kit 的操作手册提供
的方法进行。
116
第 2期 刘小琳等: MsN HX 1基因转化紫花苜蓿及转基因植株的鉴定
2 结果与分析
2. 1 目的基因MsNHX1对苜蓿的转化
培养 7 d的苜蓿无菌苗子叶,经农杆菌侵染, 共
培养结束后,转至诱导愈伤组织形成的筛选培养基
中进行愈伤组织的诱导, 约 2 周后即可看到愈伤组
织产生(图 1A) ; CK 2 中几乎所有的子叶都未能分
化出愈伤组织, 并随着时间的推移逐渐褐化死亡(图
1B) ;而 CK1 中的子叶近 100%分化出愈伤组织,且
其愈伤组织比转化的生长更加迅速(图 1C)。抗性
愈伤组织生长到足够大时,转到诱导体胚分化培养
基中诱导体胚的分化(图 2A) , 当体胚长出的抗性芽
约2~ 3 cm长时(图 2B) ,将其移入生根培养基中诱导
生根(图 2C) ,诱导生根的小苗转移到事先浸透的(营
养土:蛭石= 1: 1)小花盆中繁种(图 2D)。当苜蓿小
苗长出健壮的根、茎、叶时,可将其移入大田(图 2E)。
图 1 不同处理下愈伤组织的分化情况
F ig. 1 Callus induction under differ ent tr eatments
图 1( A) 子叶经浸染且有 500 mg/ L Cef胁迫的愈伤组织;图 1( B) 子叶未浸染但有 500 mg/ L Cef胁迫的生长情况;图 1( C) 子叶未浸染且
无 C ef胁迫的愈伤组织
Fig. 1( A) Cal lus of cotyledon af ter th e inoculat ion of A gr obacer ium and under the st ress of 500 mg/ L Cef; Fig. 1( B) Cotyledon w ithout in
ocu lat ion of A g robacer ium, but under the st ress of 500 mg/ L Cef ; Fig. 1( C) Callus of cotyledon neither through the inoculat ion of Ag robac eri
um n or un der the st ress of Cef
图 2 转基因苜蓿的组培
F ig . 2 The tissue culture o f transgenic alfalfa
图 2( A) 转化苜蓿的胚状体;图 2( B) 具有抗性芽的愈伤组织;图 2( C) 生根的转基因小苗;图 2( D) 栽入小花盆中的转基因小苗;图 2( E )
栽入土中的转基因小苗
Fig. 2( A) T he somat ic embryo of t ransgenic alfal fa; Fig. 2( B) T he callus w ith sh oots; Fig. 2( C) T he transg enic plant let w ith root s ; Fig.
2( D) The t ransg enic plant let in pot ; Figur e 2( E) T he t ransgenic plant let in field
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草 地 学 报 第 16卷
2. 2 再生植株的 PCR检测
以再生植株基因组 DNA 为模板, 用引物
GU SF、GU SR 扩增 GU S 基因部分片段, 其大小约
750 bp, P35S1、P35S2扩增 35S 启动子部分片段,
约 530 bp。发现所选植株的 DNA 中都能扩出目的
片段(如图 3A、B) , 从而初步确定它们有可能为转
基因阳性植株。再用引物 NHXF、NHXR对上述结
果呈阳性的植株进行 M sN H X 1 基因中间片段的
PCR扩增(如图 3C) , 在所选的 4株植株中, 3 号植
株 PCR结果为阴性,说明该植株可能是被空载体转
化或未被转化,其它 3 株初步确定为转基因阳性植
株。对于上述 PCR结果为阳性的植株,为检测基因
组中外源基因的完整性, 选用引物 Psy、Pgy 进行
M sN H X 1基因全长的 PCR扩增(如图 3D) ,所扩增
的片段包括 35S 启动子部分片段、M sN H X 1 基因
全长和 GUS 基因的部分片段,约 1. 7 Kb,在所选的
11株植株中,有 7株 PCR结果为阳性, 初步判定它
们为转基因阳性植株。
图 3 再生植株的 PCR检测
F ig . 3 PCR ident ification o f reg ener ation plants
图 3( A) GU S片段PCR 鉴定;图 3( B) 35S启动子片段的PCR鉴定;图 3( C) MsN H X 1基因中间片段的 PCR鉴定;图 3( D) MsNH X 1基
因全长的 PCR 鉴定
- 为未转化植株阴性对照; + 为质粒阳性对照。M 1:分子量标准 DL2000; M 2 :分子量标准 DGL4000
Fig. 3( A) PCR ident if icat ion of GU S f ragm ent ; Fig. 3 ( B) PCR ident ificat ion of 35Promoter fragment ; Fig. 3 ( C ) PCR ident if icat ion of
M sN H X 1 gene f ragm ent ; Fig. 3( D) PCR ident ifi cat ion of w hole M sN H X 1 gen e
- : Negat ive cont rol; + : Posit ive con t rol ( plasm id pBINHX) ; M 1 : DL2000 marker; M 2: DGL4000 mar ker
2. 3 再生植株的 RTPCR鉴定
总 RNA 的质量是关系逆转录 cDNA 完整性的
重要因素。提取的紫花苜蓿总 RNA用无 RNase 的
DNase 处理,除去污染的基因组 DNA, 结果见图 4
( A)。28S RNA 和 18S RNA 条带清晰,浓度比例
符合要求,表明提取的 RNA 完整性较好。
以未转化的阴性对照和再生植株的叶片总
RNA 为模板逆转录合成 cDNA 第一链, 用引物对
扩增 GUS部分片段,检测结果如图 4( B)。阴性对照
泳道2中没有扩增条带,而泳道 1转化的植株中扩增
出明显的特异条带。这表明表达元件中 GUS基因已
经整合入基因组,并且可以转录为 mRNA。
2. 4 Dot Blotting检测
用地高辛( DIG)标记的 692 bp的探针对 PCR
检测呈阳性的植株进行 DNA Dot Blot t ing 检测(图
5)。结果表明, A1 质粒 pBINHX 和植株 A3、B4、
C2、C5、D4出现杂交信号,而 B1非转化植株和其它
植株没有出现杂交信号。DNA Dot Blot t ing 进一
步证明了部分转化植株中外源 MsN H X 1已稳定整
合到了苜蓿的基因组中。
3 讨 论
苜蓿的离体再生体系目前还不像模式植物如烟
草那样稳定和高效。在外源基因转入苜蓿时,几乎
所有器官或组织都可作为外植体, 但是外植体的选
择是决定组织培养成功的一个关键因素。Galleg o
等在利用子叶、下胚轴、叶柄和叶片做外植体时, 得
出叶柄是最好的外植体的结果, 平均产生 18个体细
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第 2期 刘小琳等: MsN HX 1基因转化紫花苜蓿及转基因植株的鉴定
胞胚, 8% 的体细胞胚转变为正常的植株 [ 10] ;
Cuadrado 等在实验中也得到了同样的结论 叶
柄是最好的外植体[ 11] ; Iantcheva 等利用杂花苜蓿
品种 R108的根作外植体, 根先被 1 mol/ L 蔗糖溶
液预处理 48和 72 h 后,在液体培养基中培养,预处
理 72 h的根完成再生所用时间最短, 需要 55 d, 体
细胞胚转化为完整植株的比例最大,达到 70% [ 12]。
由于苜蓿生长周期长的生物学特性以及该属种类繁
多,基因组大等原因,要想获得比较统一可行的诱导
和分化培养基, 目前是比较困难的[ 13] ,不同的品种
需要不同的再生体系。
在本试验中, 以苜蓿品种中苜 1号为材料,
以子叶为外植体, 以 UM+ 2, 4D 2 mg/ L+ KT 0.
25 mg/ L 为诱导愈伤组织生成的最佳培养基,这与
陈晨等的研究结果一致 [ 14]。
在对转基因植株鉴定方面, PCR法是建立在核
酸水平上最常用的检测方法,近年来,一些实验室尝
试通过复合 PCR来检测转基因植株。在复合 PCR
检测中,需在同一反应管中加入多对引物,反应中易
产生二级结构和引物竞争, 因而结果不够稳定, 可同
时检测的目标产物数量也会受到限制, 且其中产物
片段较大的往往扩增受到抑制 [ 15]。所以本试验采
取常规 PCR 的方法, 分别对 GU S 基因部分片段、
35S启动子部分片段进行 PCR 检测,但进一步的研
究表明, 一些整合有 Gus 基因、35S启动子基因的
转基因株系的基因组中并 不含有目的基因
M sN H X 1, 这可能与外源基因的整合机制有关, 例
如染色体上易位、倒位及重组的发生, 都可能导致
目标序列的删除或缺失,所以又对 M sN H X 1基因
中间片段及 M sN H X 1基因全长进行 PCR检测,初
步确定结果呈阳性的植株为转化植株。DNA Dot
Blot t ing 检测,可有效地去除经 PCR结果为假阳性
的植株, 并具有较高的准确性, 是转基因研究中快
速有效的手段。但是对转 MsN H X 1基因的中苜1
号来说,探针的设计上要注意特异性, 探针只能与
转化植株的 DNA 结合,才能起到筛选作用, 这点与
其他转外源基因植株的检测有所差别。
在核酸水平上对转基因植株进行检测后,转录
水平检测 RTPCR 也是必要的。RTPCR 结果说
明,经 PCR、DNA Dot Blo tt ing 鉴定为阳性的转化
苜蓿植株中,表达元件已经整合入基因组,并且在转
录水平上未沉默。
4 结 论
以紫花苜蓿中苜 1号7日龄无菌苗子叶为外
植体,建立了适用于农杆菌介导的转基因组织再生
体系,所选用的培养基、抗生素浓度、农杆菌菌液侵
染浓度适合中苜 1号的转基因研究。本研究共获
得 42 株再生植株, 对它们进行的针对报告基因
GUS, 35S 启动子, MsN H X 1 基因全长的 PCR 鉴
定,结果表明有 18株的检测结果呈阳性; 然后再对
其中 8株进行了 RTPCR鉴定, 共得到 2个阳性株
系;最后,又对这 18 个植株进行 DNA Dot Blot 检
测,共得到 5个转基因植株。因此,我们得出的结论
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草 地 学 报 第 16卷
是:在 42株再生植株中有 5 株目的基因 MsN H X 1
已经整合到苜蓿基因组中, 转化率为 11. 9% , 并在
转录水平上得到表达。
该实验将编码中苜 1号液泡膜 N a+ / H + 逆
向转运蛋白的 MsN H X 1 基因转化到中苜 1 号
中,以期获得耐盐性更好的苜蓿材料。此外, 探针的
设计上注意了探针的特异性, 使探针只能与转化植
株的 DNA结合起到筛选作用[ 16] , 这点与其他转外
源基因植株的检测有所差别。
本实验为其他基因转入中苜 1号建立了适用
于农杆菌介导的转基因组织再生体系, 为其基因转
化工作打下基础,为苜蓿新品系的培育提供了重要
种质资源,对分子育种体系的建立具有重要的指导
意义,为以后的生产实践奠定了理论基础。
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(责任编辑 梁艳萍)
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