全 文 ：第 18 卷 第 6 期
Vol. 18 No. 6
草 地 学 报
ACTA AGRESTIA SINICA
2010 年 11 月
Nov. 2010
紫花苜蓿光敏色素 A基因片段的克隆
及其 RNA干扰载体的构建
张亚军, 严学兵 , 朱见明, 王成章* , 史莹华
(河南农业大学牧医工程学院, 河南 郑州 450002)
摘要: 苜蓿( Medicago sativa L . )的秋眠性是一种光周期效应。研究植物体内重要的光受体-光敏色素 A( phy to-
chromeA, phyA) ,可能揭示其调控苜蓿秋眠性的机理。为研究其与苜蓿秋眠性的关系, 本研究根据 RNA 干扰
( RNA interfer ence, RNA i)技术原理,以紫花苜蓿幼嫩叶片为材料, 提取总 RNA,选取基因 cDNA 序列同源性较低
区域设计特异性引物, 并引入相应的酶切位点, 利用 RT-PCR 克隆 p hyA 正、反向片段, 经过 3 次亚克隆, 构建了
phyA 的 RNAi表达载体,制备了适合转染植物组织的农杆菌菌液,为获得缺失 phyA 植株创超了条件。
关键词:紫花苜蓿; phyA ; RNA i;载体构建
中图分类号: Q785; Q782 文献标识码: A 文章编号: 1007-0435( 2010) 06-0897-05
cDNA Fragment Cloning of Phytochrome A Gene from
Alfalfa and Construction of RNAi Vector
ZHANG Ya- jun, YAN Xue-bing, ZHU Jian-m ing, WANG Cheng-zhang* , SH I Ying-hua
( Engineering College of Animal H usbandry and Veterinary Science, H enan Agricultural University, Zhengzhou, Henan Province 450002, China)
Abstract: Phy to chrome A ( phyA) is a signif icant light recepto rs in plants and may play an important role
in controlling fall dormancy in alfalfa. T o invest ig ate the funct ion of phyA regulating pho toperiodic reac-
t ion in alfalfa, phyA RNAi vectors w ere const ructed in this study . To tal RNA was iso lated f rom fresh,
young leaves, and a pair of part icular primers w ith double enzyme sites w as designed to facilitate the low er
homolo gy region o f phyA genes. T hen, bo th sense and ant-i sense phyA f ragments w ere obtained by RT-
PCR. T he r est rict ion enzyme sites of vecto r pHANNIBAL were used to const ruct the RNAi unit, and in-
serted into plant v ecto r pART 27 to const ruct the phyA RNAi vector. Results laid a foundat ion for obta-i
ning t ransgenic plants w ith p hyA gene silenced.
Key words: Alfalfa; Phytochr ome A; RN Ai; Const ruct ion o f vector
紫花苜蓿(M edicago sativa L. )为长日照植物
( long day plant , LDP) , 在夏末和秋季日照长度逐
渐变短时表现出植株生长速度下降、茎枝匍匐生长
等特性,即为苜蓿的秋眠性( Fall dormancy, FD) [ 1]。
该特性与苜蓿的生产性能直接相关,许多国家栽培
苜蓿时已把秋眠性作为选择其品种时的首要指标。
但是由于苜蓿的秋眠性和抗寒性正相关, 因此在苜
蓿的秋眠性被发现以来的近一个世纪, 大多数科学
家把研究重点放在与抗寒性有关的物质代谢上, 致
使其机理一直不清,苜蓿秋眠性在生产上的应用有
较大的局限性。
苜蓿在晚春和夏季长日下利于其生长发育,而
夏末和秋季短日下休眠, 说明苜蓿秋眠存在着光周
期效应[ 2] 。光敏色素是光周期反应的受体, 参与光
信息的接受和传递, 光敏色素 A ( phytochromeA,
phyA)是双子叶植物体内重要的光敏色素之一, 是
感受光照信号所必需的, 与长日植物( LDP)诱导的
光周期有关, 并且 phyA 可以抑制某些生物合成,
p hyA 突变体的转基因植物光周期的敏感性有所下
降[ 3 ]。对拟南芥和水稻开花光周期的研究, 发现
p hyA 介导对远红光的反应, 推测其可能是光周期
反应中起主要作用的光受体基因 [ 4]。王成章 [ 5]等研
收稿日期: 2010-09-06;修回日期: 2010- 11-23
基金项目:国家自然科学基金项目( 30771527) ;教育部博士点基金项目( 20060466004)资助
作者简介:张亚军( 1986- ) ,女,河南许昌人,在读硕士, 主要从事牧草栽培生理研究, E-mail: z hyaj610@ 163. com; * 通讯作者 Author for
cor resp on dence, E- mail: w angchen gzhang@ 263. net
草 地 学 报 第 18卷
究了 3个不同秋眠型苜蓿在不同光周期条件下叶片
和顶芽中 phyB的含量, 结果表明, 和非秋眠苜蓿相
比,秋眠苜蓿叶片中 phyB含量高, 推测其作为绿色
植物主要光受体可能通过光周期调控或参与了苜蓿
的秋眠, phyA, phyB 确实存在互作效应[ 6] , 由此推
测 phyA 在调控苜蓿秋眠性上可能也发挥了重要作
用。但是迄今为止尚未见有人研究 p hyA 与苜蓿秋
眠性之间的联系。
RNAi技术自发现以来,以其高效性、特异性及
稳定遗传的特点,成为研究植物基因功能的重要手
段。该技术是通过导入双链 RNA ( double st rands
RNA, dsRNA) , 特异性地降解相应序列的靶 mR-
NA ,从而阻断相应基因的表达,在植物中,构建合适
的载体是应用 RNAi的关键。本研究根据 RNA i技
术的原理克隆 phyA 片段, 构建其对应的 RNAi表
达载体,为特异性阻断该基因表达, 得到缺失 phyA
无秋眠表型的植株和确定该基因在苜蓿秋眠性中的
功能奠定了基础。
1 材料与方法
1. 1 材料
1. 1. 1 植物材料 选取实验室盆栽的紫花苜蓿品
种佛纳尔 Vernal为实验材料, 该品种为秋眠 2 级
( Fall do rmancy class 2, FD2)。
1. 1. 2 质粒和菌株 用于构建 phyARNAi表达载
体的载体 pHANNIBAL[ 7] 及 pART27[ 8] 的大肠杆
菌菌液由本实验室提供。克隆载体 PGEM- T eas-
y、大肠杆菌菌株 DH5a 感受态细胞和农杆菌菌株
EH A105 分别购自 Pr omega 公司、QIAGEN 公司
和北京鼎国生物技术有限责任公司。
1. 1. 3 酶和试剂 总 RNA 提取试剂 RNAiso
Plus、RT-RCR试剂盒、凝胶回收试剂盒、T 4 DNA
连接酶和限制性内切酶等购自宝生物工程(大连)有
限公司; PCR M aster Mix、质粒小提试剂盒和 DNA
分子量标准购自 QIAGEN 公司;其他常规试剂为国
外或国产分析纯。
1. 2 方法
1. 2. 1 目的片段的选取 根据 NCBI上已发表的
紫花苜蓿 phyA 基因(编号为 GQ379905. 1)的全序
列,按照以下步骤选取目的片段: 首先利用 Oligo 和
Primer Prem ier 软件对其进行酶切位点分析, 选取
的目的片段上的酶切位点,应与载体上用到的酶切
位点不同,然后在 NCBI 网页上进行Blastn比对,排
除与苜蓿其他基因同源性高的片段,确保 RNAi的
特异性。
1. 2. 2 紫花苜蓿总 RNA 的提取 从紫花苜蓿茎
顶端取约 80 mg( 5~ 6 片)新鲜幼嫩叶片, 在有液氮
的研钵中研磨成粉末状后, 按照总 RNA 提取试剂
RNAiso Plus说明书提供的方法提取总 RNA。
1. 2. 3 RT-PCR 以总 RNA 为模板,进行反转录
反应,按照说明书操作步骤合成 cDNA 第 1链。针
对选取的目的片段设计特异性引物。在正向片段两
端分别引入 Xho 与 Kpn , 扩增的片段命名为
phyA-sense, 简称 phyAs; 反向片段两端分别引入
BamH 与 Cla 限制性内切酶位点, 扩增的片段命
名为 phyA-ant isense, 简称 phyAa。为保证实验操
作顺利进行,引物设计时在酶切位点的前端加入了
相应的保护碱基, 引物序列如表 1所示。预计扩增
产物分别为 623和 622 bp。PCR 反应参数为 94
预变性 4 m in; 94 变性30 s, 56 退火 30 s, 72 延
伸 45 s, 30个循环; 72 延伸 5 min。
表 1 实验特异引物序列及其特征
T able 1 Special primer sequence and it s character s in t his experiment
基因名称
Gene name
引物序列
Primer s equence
扩增片段
Ampl ificat ive f ragm ents, bp
p hy A-正 F CCG CT C GAG TT C GCT T CT T AA CCC T AT CCT
623
p hy A-sense R CGG GGT ACC ATC T CC ATC TT C ATC GCT GTC
p hy A-反 F CGG GAT CCT T TC GCT T CT T AA CCC T AT CCT
622
phyA-ant isense R CC AT C GAT AT C TCC AT C T TC AT C GCT GT C
注:下划线部分为酶切位点
Note: Th e underline indicated sites of enz yme digest ion
1. 2. 4 PCR产物的克隆测序 RT-PCR 产物经琼
脂糖凝胶回收试剂盒回收纯化后, 与克隆载体
PGEM-T Easy 相连接, 利用热击法将连接产物转
化大肠杆菌 DH5a 感受态细胞, 均匀涂布于含
Amp/ IPTG/ X-Gal的 LB 培养基上进行蓝白斑筛
选,挑取阳性克隆并进行菌液 PCR鉴定,将鉴定的
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第 6期 张亚军等:紫花苜蓿光敏色素 A 基因片段的克隆及其 RNA 干扰载体的构建
正向及反向片段阳性克隆分别命名为 T-p hyA s 和
T-phyAa。将鉴定的阳性克隆提取质粒送宝生物工
程(大连)有限公司测序。
1. 2. 5 中间载体的构建 将测序正确的 T-phyAs
质粒和载体 pHANNIBAL 质粒分别进行 Xho 与
Kpn 双酶切,回收 phyAs 和 pHANNIBAL 片段,
利用 T-DNA 连接酶通过相同的粘性末端进行连
接, DN A片段的摩尔数应控制在载体摩尔数的 3~
10倍。重组之后的质粒记为 phyA s- pHAN。然后
对 p hyA s-pHAN 和测序正确的T-p hyA a分别进行
BamH 与 Cla 双酶切, 回收 p hyA s-pHAN 片段
和 phyA a, 利用上述方法进行连接, 将 phyA s 和
phyAa 基因片段插入到载体 pHANNIBA L 内含子
基因片段的两端, 构建中间载体, 记为 phyAs-
pHAN-phyA a。将酶切检测正确的重组质粒送宝
生物工程(大连)有限公司测序鉴定。
1. 2. 6 RNAi表达载体的构建 对 phyA s-pHAN-
phyAa 质粒和植物双元表达载体 pART 27 质粒分
别进行 Not 单酶切,将 Not 酶切 phyA s-pHAN-
phyAa产生的两个片段中的大片段记为 RNA i结
构单元。纯化回收 RNAi 结构单元和 pART 27 片
段,将 pART27DNA 片段与 RNAi 结构单元片段
DNA 按 1: 3(摩尔比)进行混合, 利用 T-DNA 连接
酶定向连接后转化大肠杆菌 DH5a, 构建紫花苜蓿
phyA-RNAi表达载体。利用酶切鉴定重组质粒。
1. 2. 7 转基因工程菌液的制备 经酶切检测,鉴定
出含有 phyA-RNAi载体的大肠杆菌阳性克隆。提
取质粒利用冻融法将其转化到农杆菌菌株EHA105
感受态细胞中, 获得用于转基因操作的农杆菌菌液。
2 结果与分析
2. 1 叶片总 RNA的提取
用 2%琼脂糖凝胶电泳检测提取 RNA 的完整
性,结果如图 1所示。从图中可以清晰看到 RNA
28S, 18S, 5S 三条带, 表明提取的总 RNA 纯度较
高,无明显降解,完全可以满足反转录的要求。
2. 2 phyA正反向片段的克隆与序列分析
以特异性引物扩增 623和 622 bp 的正、反向目
的片段,对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测,结果
如图 2所示, phyA s 和 phyA a 基因片段长度均在
DNA 分子量标准 500 bp和 750 bp 两条带之间, 扩
增长度与设计相符。将二者回收、连接到 PGEM-T
easy载体上,转化大肠杆菌 DH5a,提取质粒的测序
结果经 BLAST 比对分析, 表明本研究所克隆的
p hyA s和 phyAa 基因片段与登录的紫花苜蓿的
p hyA 有 99%的同源性。
2. 3 中间载体的构建
对 p hyA s-pHAN 质粒进行 Xho 与 Kpn 双
酶切及质粒 PCR 鉴定 phyA s 是否连在了 pHAN-
NIBAL 载体上。结果如图 3 所示, 双酶切产物为
600 bp左右的 phyA s片段和 5800 bp 左右的载体
pHANNIBAL 片段,且质粒 PCR 产物片段与酶切
下的 phyA s片段长度一致, 表明已将 phyAs 片段
连入载体 pHANNIBAL。
对 phyAs-pHAN-p hyA a 质粒分别进行 Xho
、Kpn 和 BamH 、Cla 双酶切检测,结果如图
4所示, Xho 、Kpn 和 BamH 、Cla 双酶切产
物均为为 600 bp 左右的目的片段和 5800 bp 左右
的载体 pHANNIBA L 片段。再对 phyA s-pHAN-
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草 地 学 报 第 18卷
phyAa 质粒进行 No t单酶切检测, 结果如图 5 所
示,酶切产物长度分别为 4200 bp和 3000 bp 左右,
表明已将 p hyA s 和 p hyA a 片段连入了载体
pHANNIBAL 的相应位置, 成功构建了含有 RNAi
结构单元的中间载体。RNAi 结构单元如图 6 所
示,由启动子、p hyA s、内含子、phyAa 和终止子组
成。phyAs和 phyA a 片段之间因为有内含子的间
隔,在一定条件下可以形成发夹结构。RNAi 结构
单元总长度 4206 bp。 图 5 Not单酶切检测 p hyAs-pHAN-phyAa 质粒
Fig . 5 Detection of phyA s-pH AN- p hyA a
plasmid w ith Not dig estion
M: DNA 分子标记; 1~ 4: Not 单酶切 p hy As-pHAN-
p hyA a质粒; 5: Not 单酶切载体 pART 27质粒
M : DNA Marker; 1~ 4: p hyA s- pHAN-p hyA a plasmid
w as diges ted w ith Not ; 5: pART27 plasmid
was digested w ith Not
2. 4 RNAi表达载体的构建
对 phyAs-pHAN-phyAa 质粒进行 No t 单酶
切,结果如图 5所示。回收 RNAi结构单元片段,二
者进行定向连接、转化大肠杆菌 DH 5a感受态细胞,
挑取阳性克隆, 对其进行酶切鉴定, 结果如图 7所
示,经 Not 单酶切后, 出现了两条带,其中一条片
段长度为 100000 bp 左右, 另一条长度在 4000 bp
和 5000 bp之间, 与理论值相符。证明已成功构建
了 phyA的 RNAi表达载体。
2. 5 载体在农杆菌中的转化与鉴定
将构建好的植物表达载体通过冻融法导人农杆
菌 EHA105中,用卡那霉素进行筛选, 获得抗性菌
株。对其质粒进行 No t 单酶切检测, 结果如图 7
所示,从农杆菌中提取的质粒与从大肠杆菌提取的
质粒酶切图谱一致。表明质粒载体已成功转入农杆
菌 EHA105中,可直接用于后续的转染工作。
3 讨论
近年来, RNA i技术广泛应用于基因功能的研
究,构建合适的载体是应用 RNAi技术的关键,尤其
是构建可以形成发夹结构( hpRNA)的载体, 以其较
高的 RNAi效率[ 7] 而成为研究的热点。本研究中选
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第 6期 张亚军等:紫花苜蓿光敏色素 A 基因片段的克隆及其 RNA 干扰载体的构建
图 7 RNAi载体质粒的检测
Fig. 7 Detection o f RNA i recombinant
plasmid w ith Not dig estion
M: DNA 分子标记; 1: pART 27空载体质粒/ DH 5a; 2: RNAi表达载
体质粒; 3: Not单酶切 RNAi表达载体质粒/ DH 5a; 4: Not 酶切
RNAi表达载体质粒/ EHA105; 5: pART27空载体质粒/ EHA105
M: DNA Marker; 1: pART 27 plasm id/ DH5a; 2: plasmid of RNAi
cor resp ondin g vector; 3 : plasmid of RNAi corresponding
vector/ DH 5a w as digested w ith Not ; 4: plasmid of RNAi
corresponding vector/ EHA105 w as digested w ith
Not ; 5: pART 27 plasmid/ EHA105
用的 pHANNIBAL [ 7] 和 pART 27[ 8] 载体是专门应
用于植物 RNAi的载体。其中中间载体 pHANNI-
BAL 启动子为 CaMV35s,终止子为 OCS, 扩增的正
反目的片段通过酶切可以直接插入 PDK 内含子的
两侧,在转录时会自发形成发夹结构,内含子会自动
被植物内的核酸酶切除,由此形成引发 RNAi反应
的双链核酸结构 [ 9]。
另外, 选取目的片段的特异性和长度对 RNAi
技术的成功与否有决定作用。本研究中选取的
phyA 目的片段特异性高, 与苜蓿其他基因同源性
极低, 保证了构建此片段的 RNA i载体在导入植物
体后, 能够特异的引起该基因突变。目的片段大小
的选择是构建植物 RNAi表达载体的关键因素, 直
接影响其干扰效率。Helliw ell等的研究结果表明,
选择 50 bp~ 1 kb 长度的目的片段构建载体, 都能
成功诱发目的基因的沉默,但较短片段不易被 Dicer
酶识别,并且特异性较低而使 RNAi效率较低;过长
的发夹结构在寄主细菌中容易发生重组, 形成二聚
体,降低 RNAi效率,以 300~ 600 bp长短的片段更
容易获得比较有效的 RNAi[ 10]。本研究中选取 604
bp长度的目的片段, 避免了过短和过长片段造成的
RNAi效率降低的问题,以期有效抑制靶基因表达。
将 dsRNA 导入植物的方法有很多, 研究比较
多的是基因枪法、病毒诱导基因沉默和农杆菌介导
法。农杆菌介导法是利用农杆菌的转化能力将
dsRNA或能产生 dsRNA 的载体引入植物中, 不需
要注射即可以浸染到植物叶片中,被引入的序列可
整合到植物基因组内并转录产生 dsRNA,从而诱发
RNAi。与上述另外两种方法相比具有快速、可靠和
低成本的优点, 很容易将产生 dsRNA 的载体引入
完整的植株中, 并且可以获得稳定遗传的 RNAi现
象。本研究中应用农杆菌介导 RNAi, 即将植物外
源基因序列或发夹结构 RNA ( hpRNA )的 T-DNA
质粒接种于农杆菌中, 通过农杆菌介导整合到植物
基因组中,诱发 RNAi,为后续得到可以稳定遗传的
转基因植株提供了可能性。
成功构建紫花苜蓿 phyA-RNAi载体为得到
p hyA 突变植株奠定了基础, 是研究 phyA 在调控
苜蓿秋眠性中的功能的必经之路, 同时也为研究苜
蓿其他基因功能的作用提供了借鉴和指导。
4 结论
本研究以 Genebank 中已公布的紫花苜蓿
p hyA 的序列为模板设计引物, 克隆了 phyA 正反
向片段, 并通过中间载体 pHANNIBA L 和植物双
元表达载体 pART 27 构建了 phyA-RNAi表达载
体,将其导入根癌农杆菌 EHA 105 菌株中, 可用于
植物的遗传转化, 为通过反向遗传学方法来观察该
基因的缺失表型, 研究其在苜蓿秋眠性调控中的功
能奠定了基础。
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