全 文 ：文章编号: 1007-0435( 2006) 03-0219-04
白三叶RAPD分析条件优化
张 贤1 , 张英俊1* , 吴维群2
( 1.中国农业大学草地研究所, 北京 100094; 2.云南省草山饲料站, 昆明 650225)
摘要: 对白三叶RAPD 反应体系中的模板DNA 用量、随机引物浓度、dNT P 浓度、T aqDNA 聚合酶浓度、M g2+ 浓度分别
进行了梯度试验。结果表明,在总体积25 L 体系中, 模板DNA 20 ng、引物9. 9 ng、dNT P浓度0. 4 mmo l/ L、TaqDNA 聚
合酶3 U、M g2+ 浓度1 mmo l/ L 的反应体系可得到稳定清晰的RAPD 扩增图谱,该体系可用于白三叶遗传多样性分析。
关键词: 白三叶; RAPD ; 条件; 优化
中图分类号: S 812; Q943 文献标识码: A
Optimization on RAPD Analytical System of White Clover
ZHANG Xian
1 , ZHANG Ying-jun
1* , WU Wei-qun
2
( 1. Inst itute of Grassland S cien ce, Ch ina Agricultural University, Beijing 100094, China;
2. Yunnan Grass land and Feed M anagement Sect ion, Kun Ming 650225, China)
Abstract: T he gr adient tests on the concentr at ion of M g
2+
, dNTP, random primers, template DN A and T aq
DNA polymerase ar e conducted. In the opt im izat ion o f RAPD system with a total v olume of 25 L, containing
20 ng template DNA , 9. 9 ng random pr imer , 0. 4 mmol / L dNTP, 3 U Taq DN A polymerase, 1 mmol/ L M g
2+ ,
the stabile clear w hite clo ver RAPD map was obtained successfully. T his Reaction sy stem can be used in ana-
lyzing the genet ic v ar iat ion o f white clover.
Key words : White clov er ; RAPD; Condit ion; Optim ization
白三叶( T rif ol ium r ep ens)原产欧洲和小亚细亚,
是世界上分布最广的豆科牧草之一[ 1]。白三叶最早于16
世纪中叶后期在荷兰栽培, 后传入英国、美国、新西兰等
国家, 目前在温带、亚热带地区广为种植。在我国白三叶
种植已遍布全国, 尤其在长江以南地区大面积栽培, 长
江中下游平原的鄂、湘、江、浙、皖等省,以及低山丘陵区
的云、贵、川、广等省均有种植,是我国南方的当家豆科
牧草[ 2]。白三叶茎叶柔软细嫩,适口性好, 营养丰富,刈
牧兼用,耐践踏, 再生性好, 是一种优质饲草。
我国野生白三叶分布广泛, 新疆天山的河滩草地、
草甸草原和阿尔泰山地的林缘、泉水溢出带等, 吉林省
长白山脉西南坡中坡地带, 黑龙江省东部有积雪覆盖地
区, 以及我国云南、贵州、四川、江西、湖南、湖北、广西、
江苏等省区也均有野生分布[ 3]。我国白三叶种植资源丰
富, 有必要了解其遗传背景及种质资源多样性状况, 以
期为白三叶种质资源开发合理利用,提供参考。
RAPD ( Random Amplified Polymorphic DNA )
技术以其快速、简单、成本低、多态性检测效率高等优
点,被广泛的应用于遗传多样性研究中。但由于其重复
性差,必须对反应条件进行优化,以提高反应结果的稳
定性。关于RAPD 分析反应体系的优化在许多物种中
均有报道,但检测材料物种不同其结果差别较大。本试
验利用RAPD 技术,以考拉白三叶品种为材料, 探讨
模板 DNA 用量 、随机引物浓度、dNT P 浓度、T aq
DNA 聚合酶的浓度和 Mg 2+ 浓度等因子对白三叶
RAPD扩增效果的影响,旨在建立一个稳定的白三叶
RADP 反应体系, 为后续白三叶遗传多样性RADP 分
析奠定基础。
1 材料与方法
1. 1 材料
材料为澳大利亚培育的中小叶型考拉白三叶
( T rif ol ium rep ens cv . Koala) ,由百绿公司提供。
收稿日期: 2006-03-07; 修回日期: 2006-07-04
基金项目: 云南省省院省校科技合作项目( 2003BFEOOA002)”资助
作者简介: 张 贤( 1979-) ,女,贵州毕节人,博士研究生,主要从事牧草育种及牧草生物技术研究; * 通讯作者 Author for correspondence E-
mail: zh ang yj@ cau. edu . cn
第 14 卷 第3 期
Vol. 14 No . 3
草 地 学 报
ACTA AGREST IA SINICA
2006 年 9 月
Sept . 2006
1. 2 实验药品及仪器
10 碱基随机引物( 5′GT GACGT AGG 3′)购自上
海生工公司。100 bp DNA ladder、Taq DNA 聚合酶、
dNT P 购自天为时代公司。
PCR仪为PT C200型, 电泳仪为DYY-6B型。
1. 3 总DNA提取
采用CT AB法提取白三叶叶片总DNA [ 4]。取供试
白三叶样品10个单株, 将其叶片在液氮中研磨成粉
状, 加入预热至 65℃。CTAB 提取液 ( 100 mmol/ L
Tr is-HCl pH 8. 0, 1. 4 mmol/ L NaCl, 20 mmo l/ L ED-
TA , 2% CT AB, 0. 1%～0. 2% -巯基乙醇) 900 L,
65℃水浴30 min,每间隔2 min轻摇1次,冷却后加入
500 L 氯仿-异戊醇( 24∶1) 12000 r pm 离心 10 min,
取上清液加入等体积冷异丙醇及0. 1体积乙酸钠, 产
生白色絮状体。12000 r pm 离心5 min, 75%冷乙醇洗
涤,干燥,复溶于50 L TE 中, - 20℃冰箱保存备用。
1. 4 RAPD反应程序及其优化条件
PCR 反应程序: 96℃变性4 m in, 36℃ 50 s, 72℃
1 min 45 s, 1 循环; 94℃ 50 s, 36℃ 50 s, 72℃ 1 min
45 s, 42循环; 94℃ 50 s, 36℃ 50 s, 72℃ 2 min 30, 1
循环; 4℃保持 [ 5]。
RAPD 反应条件优化包括 Mg 2+ 浓度、dNT P 浓
度、随机引物用量、模板DNA 用量、TaqDNA 聚合酶
用量优化,在其它因子保持不变的情况下, 按一定梯度
变化单一因子,筛选出最优条件,各因子浓度梯度处理
见表1。
表1 实验因子处理
T able 1 T reatments of experiment al facto rs
实验因子
E xperim ental factors
实验因子处理
Treatments of experimental factors
模板DNA( ng) Template DNA( ng ) 0 1 10 20 50 100 200 - -
引物( ng) Random primers( n g) 0 1 6. 6 9. 9 13. 2 16. 5 19. 8 23. 1 26. 4
Mg 2+ ( mmol/ L) 0 0. 5 1 1. 5 2 2. 5 3 3. 5 4
dNT P ( mmol/ L) 0 0. 05 0. 1 0. 2 0. 3 0. 4 0. 5 - -
T aqDNA 聚合酶( U/ 25 L)
T aqDNA polymer ase( U/ 25 L) 0 0. 4 0. 8 1. 2 1. 4 1. 6 1. 8 2 2. 2
2 结果与分析
2. 1 模板DNA 用量
图 1 不同浓度的模板DNA 扩增结果
F ig . 1 Amplification by template DNA with
differ ent concentr ations
设计的7个模板DNA 浓度梯度( 0～200 ng ) , 用
量0～1 ng 时无扩增,当模板用量在10～100 ng 范围
内均能得到比较清晰一致的扩增产物 (图 1) , 说明
RAPD反应对模板浓度要求不严格。
2. 2 引物浓度
在0～26. 4 ng 范围内设计9个引物浓度梯度。扩
增结果表明,引物浓度过低( 0～1 ng 时)无扩增条带;
在 6. 6 ng 时, 扩增带背景模糊, 出现弥散带, 条带虽
多,但不易辨认; 9. 9～16. 5 ng 范围内扩增带型基本
一致, 扩增效果好; 19. 8～26. 4 ng 时, 随着用量的增
加,条带减少,并变得模糊不清(图2)。
图2 不同浓度的引物扩增结果
F ig . 2 Amplifica tion by random primer w it h
differ ent concentr ations
2. 3 dNTP浓度
dNT P 是RAPD 反应中磷酸根的主要来源。本试
220 草 地 学 报 第 14卷
验设置 7个dNTP 浓度梯度由0 mmol / L 过度到 0. 5
mmol/ L。作为DNA 的合成原料,不加dNT P 无扩增条
带; dNT P 浓度过低,在0. 05～0. 3 mmol/ L 条带少且
不清晰。在0. 4 mmo l/ L 扩增条带效果较好(图 3) ,
dNT P 浓度在此范围内较为合适。
图 3 不同浓度的dNTP 扩增结果
F ig . 3 Am plificat ion by dNTP with
differ ent concentr ations
2. 4 Taq DNA聚合酶浓度
本实验采用了7个Taq DNA 聚合酶浓度梯度0～
2. 2 u/ 25 L。结果如图所示(图4) ,酶浓度为0时,无扩
增, 用量0. 4 u时,扩增带背景模糊, 出现弥散带, 0. 8
u、1. 2 u带型比较清晰一致, 1. 4～2. 2条带渐渐模糊。
图4 不同浓度的Taq DNA聚合酶扩增结果
F ig . 4 Amplification by T aq DNA polymerase with
differ ent concentr ations
2. 5 Mg2+ 浓度
Mg2+ 对RAPD反应的特异性和扩增结果都有影
响,它是Taq酶的激活剂, 适宜的 Mg 2+ 浓度是 RAPD
反应的关键。本实验设置 9个 Mg2+ 浓度梯度( 0～4
mmol/ L ) 。Mg2+ 浓度在0. 5～1 mmol / L 范围内扩增
出清晰条带,浓度 0、3～4 mmol/ L 没有扩增出条带,
1. 5～2. 5 mmol/ L 有极少量条带而且模糊不清(图
5)。表明Mg 2+浓度在0. 5～1 mmo l/ L 范围内适宜。
图5 不同浓度的Mg2+ 扩增结果
F ig . 5 Amplification by Mg 2+ with
differ ent concentr ations
3 讨 论
3. 1 模板浓度是RAPD 反应的重要影响因子, 模板
用量过低,没有扩增产物或扩增不稳定,引起错配和引
物自身扩增; 但如果其用量过高, 则有可能增加杂质,
使非专一性扩增产物相应增加[ 6]。本试验结果表明, 在
20～100 ng范围内,扩增条带较清晰一致。模板用量的
变化在较大的范围内不会影响RAPD反应结果。最佳
的模板浓度可减小杂质对扩增反应的影响,使抑制酶
活性的因子的影响降低到最小 [ 7] , 本试验最终采用模
板用量为20 ng。
3. 2 引物浓度低时, 与模板接触机会降低, 与模板
DNA 结合位点少,扩增将受到影响;引物浓度过高, 可
能会引发碱基错配,导致非特异性扩增。本试验引物用
量采用9. 9 ng 扩增效果较为合适。dNTP 是DNA 合成
的原料, 其浓度低时,扩增产物少; 而高浓度的dNT P
对扩增反应有抑制作用,使扩增带数减少, 甚至无扩增
带型,原因可能是dNT P 与Mg 2+螯合降低了Taq DNA
聚合酶活性而引起的效应[ 8] ,本试验dNTP 浓度采用
0. 4 mmol/ L。
3. 3 RAPD 反应是由 Taq酶催化完成的, Taq DNA
聚合酶的用量及其热稳定性和活力直接影响实验的成
败, Taq DNA 聚合酶浓度低, 导致整个扩增反应不够
充分, T aq DNA 聚合酶用量以3 U 效果较好。
3. 4 T aqDNA 聚合酶需要游离的二价阳离子激活[ 8]。
Mg
2+ 作为Taq DNA 聚合酶的激活剂, 对于RA PD反应
至关重要。同时,引物与模板的双链杂交体的解链与退火
221第 3期 张 贤等:白三叶RAPD 分析条件优化
温度亦受二价阳离子的影响。Mg 2+ 过低时, T aq DNA 聚
合酶的作用效率低; M g 2+ 浓度过高, 将导致非特异性扩
增产物增加,本试验采用Mg 2+浓度为1 mmol/ L。
3. 5 此外,扩增程序与循环周期, 以及PCR型号都会
影响扩增式样[ 7] ,即使同一反应体系并不适合所有的
物种[ 9]。在进行白三叶遗传多样性RAPD分析之前必
须优化RAPD 分析条件。汪小全等的研究证明,同一
实验室, 采用相同的RAPD 反应体系和循环程序, 在
同一型号的PCR仪上运行有良好的重复性[ 10]。对白三
叶RAPD分析体系中各影响因子优化结果表明,只要
保持反应条件,反应体系中试剂来源和浓度的一致性,
并严格控制反应程序, 可获得稳定、可靠的白三叶
RAPD扩增体系。
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(责任编辑 孙 彦)
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(责任编辑 孟昭仪)
222 草 地 学 报 第 14卷