全 文 ：第 16 卷 第 5 期
Vol. 16 No . 5
草 地 学 报
ACTA AGRESTIA SINICA
2008 年 9 月
Sep. 2008
云南德宏地区逸生狼尾草属植物的分类学鉴定
周自玮1, 2 , 袁福锦2 , 匡崇义2, 毕玉芬1*
( 1. 云南农业大学, 昆明黑龙潭 650201; 2. 云南省肉牛和牧草研究中心, 昆明小哨 650212)
摘要: 采用传统分类学, 细胞学和 RAPD 分子标记对云南德宏地区逸生狼尾草( Pennisef um Rich. sp. )进行分析和
鉴定。结果表明:逸生狼尾草体细胞染色体数为 2n= 28,经同工酶及 RAPD分析,逸生狼尾草与矮象草( P. p ur-
p ur eum Schum. cv. Mo tt)的遗传距离较近,而与王草( P. amer icanum @ P. ty p hoideum)的遗传距离较远, 说明逸
生狼尾草在分类上属象草,而非当地多年称谓的/ 狼尾草0。
关键词: 逸生狼尾草; 形态学;细胞学; RAPD
中图分类号: Q949 文献标识码: A 文章编号: 1007-0435( 2008) 05-0453-05
Integrated Identification of Naturalized Pennisetum Rich. sp. In Dehong,
Yunnan Province
ZHOU Z-i w ei1, 2 , YU AN Fu-jin2 , KU ANG Chong-y i2 , BI Yu-fen1
( 1. Yunnan Agricultural University, Kunming, Yunnan Province 650214, China;
2. Yunnan Beef Cat t le & Pas tu re Research Center, Kunming, Yunnan Province 650212, Chin a)
Abstract: As the natur alized Pennisetum Rich. sp. , Dehong No. 1 is a nat iv e grass in Dehong, Yunnan
Province, and has a long g row th histo ry of six ty years. Fo r high yield fo rag e, Dehong No . 1 has been used
as sow n pasture in recent y ears and has the potent ial v alue o f ex tensiv e ut ilizat ion. In this study, Dehong
No. 1 w as ident ified using the methods of tr aditional tax onomy, cytolog y, isozyme, and RAPD. The re-
sults show that chromosome number of body cell of Dehong No. 1 is 28. The isozyme and RAPD analysis
show that the genet ic distance betw een M ot t Elephantgr ass ( P . p ur pureum Schum . cv. M ot t ) and De-
hong No . 1 is closer than that betw een Dehong No. 1 and Kingg rass ( P. amer icanum @ P. ty p hoid es) . In
summary , Dehong No. 1 is a kind o f Elephantgrass in tax onomy other than Wo lftailgrass.
Key words: Natur alized P ennisetum Rich. sp. ; M orpholog y; Cy tolog y; RAPD
狼尾草 ( Pennisetum Rich. ) 隶属禾本科黍亚
科,蒺黎亚族,狼尾草属, 该属多为一年生或多年生
草本植物,是热带、亚热带和温带地区广泛种植的牧
草之一。全世界约 140种 [ 1] ,多数产于非洲,广泛分
布于热带和亚热带, 个别种可分布到温带。我国包
括 8个引进种, 几乎遍布于全国, 多为优良草种, 可
供造纸、编织等用[ 2] , 同时,也是很好的育种材料 [ 3]。
德宏逸生狼尾草属植物(当地称狼尾草) , 生长于德
宏州各地,其外形特征与王草差异较大,与江苏最近
培育的宁牧 3 号杂交狼尾草 ( P. p ur pur eum cv.
Ningmu No. 3) (为种内自交系间杂种 1 代 F1 )相
似,但据考证在德宏州出现的时间已超过 60年。袁
福锦 [ 4]等人研究表明,年割 3茬时,逸生狼尾草属植
物的干物质产量达 29. 1 t / hm2 ,年割 5茬时可达 40
t / hm
2
, 是一种极具开发利用价值的草种。但目前
在分类上的归属不清, 推广利用受到限制。
经典植物分类学以形态作为分类证据, 虽取得
了巨大成功,但形态分类也有其自身的局限性, 有些
问题只能通过其它的分类方法加以解决。目前, 细
胞学、同工酶、分子生物学技术已广泛应用于植物分
收稿日期: 2007-11-2; 修回日期: 2008-04-15
基金项目: 云南省自然基金项目( 2004C0063M)资助
作者简介: 周自玮 ( 1966-) , 男,云南腾冲人,副研究员,长期从事牧草资源、栽培技术研究, E-mail: zhouz iw eiyn@ 126. com ; * 通讯作者
Author for correspondence, E-mail: biyufenynnd@ sin a. com
草 地 学 报 第 16卷
类及遗传背景分析。细胞分类学成功的例子之一是
芍药属从毛茛科中的独立 [ 5]。以前芍药属放在毛茛
科中,但根据细胞学研究, 芍药属染色体大,基数 X
= 5, 这和毛茛科大多数属的基数不同, 支持了将芍
药属独立成科的观点。另外, 朱大鸣等对 5个紫花
苜蓿、7个冰草、3个披碱草品种过氧化物酶和酯酶
同工酶进行了研究, 认为同属不同种或同种不同品
种的幼苗可以使用酶电泳法区别 [ 6]。Quir os 通过
对紫花苜蓿叶组织过氧化物酶、酯酶、酸性磷酸酶同
工酶电泳分析, 认为对于四倍体和六倍体苜蓿植株
的鉴定是有效的 [ 7]。乌仁其木格等采用聚丙烯酰胺
凝胶电泳分析比较了胡枝子属和偃麦草属不同种类
酯酶、过氧化物酶同工酶酶谱间的差异, 表明酯酶
同工酶可以作为胡枝子属、偃麦草属植物种间遗传
差异鉴定的重要标准 [ 8, 9]。张建全等利用过氧化物
酶同工酶对5个苏丹草品种进行了品种纯度鉴定技
术的研究, 认为过氧化物酶同工酶是苏丹草品种鉴
定的快速有效技术[ 10]。唐红等通过超薄层等电聚
焦电泳技术研究了 5种草坪草 17个品种 POD同工
酶, 证明等电聚焦电泳方法是鉴别草坪草品种的有
效测定技术 [ 11]。解新明[ 12]采用 RA PD 分子标记技
术对狼尾草属 8 个品种(品系) 间的遗传关系进行
了分析,结果表明在这 8个品种(品系) 间具有较高
的遗传多样性,存在一定的遗传分化。认为 RA PD
分子标记技术在确定狼尾草属品种间遗传关系及品
种鉴定和杂种分析中具有重要的应用价值。李拥军
用种子蛋白 DNA 的 RAPD 技术分析了中国 18 个
苜蓿地方品种和 9个美国品种, 认为我国苜蓿品种
杂合性高,品种间遗传差异小[ 13]。杨青辉等[ 14]利用
RAPD分子标记技术对狼尾草属两个杂交组合的亲
本及其正反交的 4 组杂交后代进行分子鉴定, 认为
根据双亲间的特征带可以对杂交或自交后代作出鉴
定。本文采用传统分类学、细胞学、同工酶及 RAPD
技术研究云南德宏地区逸生狼尾草属植物的形态特
征、细胞学特性和生物学表现,以揭示云南德宏地区
逸生狼尾草的分类地位和归属, 为进一步改良利用
提供理论依据。
1 材料与方法
1. 1 试验区自然概况
试验区地处东经 103b58c,北纬 25b21c,海拔 1980
m,年均气温 13. 7 e , 7 月极端最高气温30. 9 e , 1 月
极端最低气温-7. 4 e ,年均降水量 990 mm。土壤为
石灰岩母质的砖红壤, pH= 5. 4, 有机质 5. 8%, 硝
态 氮 10 mg / kg, 有 效 磷 12 mg / kg, 有 效 钾
85 mg/ kg。
1. 2 材料
矮象草( P . p ur pur eum Schum. cv. M ot t )引
自广西畜牧研究所;王草( P. americanum @ P. ty-
phoides)引自海南中国热带农作物研究院;逸生狼尾
草( Pennisetum sp . )采自云南省德宏州盈江县。王
草和逸生狼尾草种植于云南省肉牛和牧草研究中心
试验地,矮象草种植于温室。
1. 3 方法
1. 3. 1 形态学鉴定 将逸生狼尾草采取后制成标
本,送中国科学院昆明植物研究所禾本科专家鉴定。
1. 3. 2 细胞学鉴定 对植株采取水泡生根,待根尖
长至0. 5~ 1. 5 cm 时,于 7B00~ 7 B40切取其根尖
1~ 2 mm,在冰水混合物中预处理 18~ 24 h,再经卡
诺氏固定液固定 12~ 18 h(低温处理) , 用蒸馏水冲
洗后放入 1N盐酸中在 60 e 下解离 8~ 15 min。解
离后的材料置于 45%的冰醋酸中软化 30 m in, 再用
改良苯酚染色 12 h,然后进行压片。制好的片子在
显微镜下镜检, 选择染色体分散好、形态清晰的片
子,经冰冻脱片封片法制成永久制片。每个种随机
取约 50个细胞进行染色体计数。
1. 3. 3 同工酶分析 同工酶电泳实验步骤参照胡
能书等[ 15] 的方法进行。采用不连续的缓冲液系统,
具体步骤如下:
1. 3. 3. 1 制胶玻璃板及封边条用去污剂彻底清洗,
再用蒸馏水冲洗烘干。
1. 3. 3. 2 琼脂封边 称取 0. 4 g 琼脂,溶于 20 mL
蒸馏水中用于封边。
1. 3. 3. 3 加分离胶 浓度 7. 5%, 加样顺序为蒸馏
水 11. 01 mL, 30%丙烯酰胺 5. 86 mL, 分离胶缓冲
液 5. 88 mL, 10%过硫酸铵 0. 23 mL, T EMED 0. 02
mL。聚合的最适温度为 25 e 。
1. 3. 3. 4 加浓缩胶 浓度 5%, 加样顺序为蒸馏水
2. 45 mL, 30%丙烯酰胺 0. 55 mL, 浓缩胶缓冲液
0. 45 mL, 10% 过 硫 酸 铵 0. 045 mL, TEMED
0. 0045 mL。聚合的最适温度为 25 e 。
1. 3. 3. 5 加样 每个草样重复 5次,分别点样量为
15 LL。加完样品后,加进预冷的电泳缓冲液。
1. 3. 3. 6 为了便于观察, 在每个样品槽内加入 2
LL 的溴酚兰指示剂,作为泳动迁移的标志。
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第 5期 周自玮等: 云南德宏地区逸生狼尾草属植物的分类学鉴定
1. 3. 3. 7 接通电源, 先低压电泳一段时间, 待指示
剂在胶板上成一条直线时,再调成高压。
1. 3. 3. 8 待溴酚蓝指示剂迁移至距下端琼脂边 1
cm 时,关闭电泳仪, 回收电极缓冲液。缓冲液可连
续使用,但每次使用前必须测一下 pH , 若 pH 值发
生改变就不能再使用。
1. 3. 3. 9 剥胶及染色 电泳结束,小心地揭开玻璃
板,用注射器冲洗胶的四周,用小刀轻敲玻璃板的边
缘,使凝胶剥离开玻璃板,滑入事先已准备好的装有
染液的磁盘中。将凝胶在磁盘中轻摇 1 min左右。
当酶带显蓝色时,迅速取出用蒸馏水冲洗,直至蓝色
谱带变为棕色谱带。
1. 3. 3. 10 固定并拍照记录 酶带充分显色后, 用
固定液(体积比为甲醇 B冰醋酸: 水= 5 B 1 B 5)保
存。然后照相记录。
酶谱的相似系数的计算:
酶谱相似系数= 两个分类群中相同的带数/俩
个分类群中酶带总数
1. 3. 4 RAPD分子标记
1. 3. 4. 1 DNA 提取 采用 CTAB法 [ 16] ,加以改进
提取基因组 DNA,步骤如下:
1) 取 1 g 新鲜叶片剪碎, 放入研钵中, 加入适
量的液氮研磨;
2) 研磨后转入1. 5 mL 的离心管,加入1 mL 2%
CTAB 提取缓冲(内含 2%CTAB、0. 1 M Tris-HCl、20
mM EDTA、1. 4 M NaCl、2%B-巯基乙醇) , 65 e 水浴
锅中保温 60 min,然后 12000 rpm 离心 10 min;
3) 取上清液移入 1. 5 mL 的离心管,加 1/ 2 体
积的氯仿:异戊醇(体积比为 24: 1) , 轻缓振荡混匀,
然后 12000 rpm 离心 5 min;
4) 取上层清液移入 1. 5 mL 的离心管, 加入 1/
10体积的醋酸铵溶液( 7. 5M )和等体积的冰冻过的
无水乙醇,轻缓振荡摇匀, - 20 e 冰箱静置 30 min,然
后12000 rpm离心 15 min,获得 DNA 沉淀;
5) 除去上清液,加入 70%乙醇洗涤沉淀 2~ 3
次,自然风干;
6) 加适量 TE 溶解 DNA,置于 4 e 冰箱备用。
1.3. 4. 2 DNA扩增 反应总体积为 25 LL, 各反应
成分终浓度分别为: 2. 5 LL 10 @ Buffer、MgCl2
2. 5 mM、dNT Ps 0. 2 mM、随机引物 0. 3 LM, 模板
DNA 20 ng、TaqDNA聚合酶1. 5 U;反应混合物用20
LL 石蜡油覆盖。首先于94 e 预变性5 min;其后的反
应包括 40个循环,每个循环包括 94e 变性 40 s, 36 e
退火 40 s, 72 e 延伸 1 min;最后 72 e 终延伸5 min。
1. 3. 4. 3 DNA 检测 用含 EB( 0. 5 ug/ mL) 1. 5%
的琼脂糖凝胶电泳检测, 然后用凝胶成像仪进行拍
照。同时用 Lambda DNA/ Ó+ EcoRI M ar ker 作
为分子量标记。
1. 4 数据处理
采用分子进化遗传学分析软件( Mo lecular Ev-
olut ionary Genet ics Analy sis) MEGA3. 1[ 17] , 对有
关数据进行处理。按照软件的要求, RAPD 扩增产
物以 a 或 t 字符进行统计,扩增带存在时记为 t ,否
则记为 a , 以 MEGA3. 1 的 p-distance 距离系数模
型分析相似系数。
2 结果与分析
2. 1 逸生狼尾草形态学鉴定
制作标本后分别送至云南大学和中国科学院昆明
植物研究所进行鉴定,分类专家鉴定意见均认为逸生
狼尾草属狼尾草属,但与认为是美洲狼尾草或象草者存
在争议。为进一步提高其归属证据,笔者开展了细胞学、
分子生物学研究。
2. 2 细胞学分析
细胞学研究结果(图 1)说明, 云南德宏地区逸
生狼尾草体细胞染色体数目为 28, 为四倍体。从染
色体数目可推断, 逸生狼尾草应为象草,因为目前的
资料表明,狼尾草染色体存在 2n= 18、14、36 三种,
而象草染色体有 2n= 28、56二种[ 18]。
图 1 逸生狼尾草染色体( 2n= 28, 放大 1200 倍)
Fig. 1 Chromosomes of naturalized Pennisetum sp. in
Dehong , Yunnan( 2n= 28; magnified 1200X)
2. 3 同工酶分析
从 POD同工酶分析结果(表 1)可知, 云南德宏
地区逸生狼尾草与矮象草之间的亲缘关系近于与王
草之间的亲缘关系( 0. 727> 0. 417)。EST 同工酶分
析结果说明:逸生狼尾草属植物德宏 1号与矮象草之
455
草 地 学 报 第 16卷
间的亲缘关系近于与王草( 0. 750> 0. 625) ; 两种酶分 析的结果一致(表 2、3,图 2)。
表 1 3 种牧草 POD同工酶酶带 Rf 值
T able 1 Rf values of POD iso zyme bands o f three for ages
草种名称
Grass name
酶带 Rf值 Rf valu e of en zyme band
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C3 C4 C5 C6
逸生狼尾草
Naturalized P enni setum sp.
0. 129 0. 205 0. 268 0. 411 0. 468 0. 527 0. 642 0. 697 0. 784 0. 840 0. 852
王草
Kin ggras s
0. 129 0. 205 0. 268 0. 468 0. 527 0. 666 0. 784 0. 840 0. 852
矮象草
M ot t Elephantgras s
0. 129 0. 205 0. 268 0. 411 0. 468 0. 642 0. 697 0. 784 0. 840 0. 852
表 2 3 种牧草酯酶同工酶酶带 Rf 值
Table 2 Rf values o f EST isozyme bands of three fo rag es
草种名称
Grass name
酶带 Rf值 Rf valu e of enz yme band
A1 A2 A3 B1 B2 B3 B4 B5 B6
逸生狼尾草
Naturalized P enni setum sp.
0. 137 0. 288 0. 443 0. 572 0. 629 0. 687 0. 802
王草 Kinggrass 0. 137 0. 443 0. 474 0. 572 0. 629 0. 687 0. 802
矮象草 M ot t Elephan tgrass 0. 137 0. 231 0. 288 0. 572 0. 629 0. 687 0. 802
表 3 3 种牧草 POD和 EST同工酶酶谱相似系数
Table 3 Zymogram similarit y coefficients of POD and EST isozyme of thr ee fo rag es
草种名称
Gras s n ame
POD EST
逸生狼尾草 Naturaliz ed
Pennisetum sp.
王草
Kinggrass
矮象草
Mot t E leph antgrass
逸生狼尾草
Naturalized P enni se tum sp.
王草
Kinggrass
矮象草
M ot t Elep han tgrass
逸生狼尾草
Natural ized
P enni se tum sp.
0. 417 0. 727 0. 625 0. 705
王草 Kin ggras s 0. 417 0. 333 0. 625 0. 444
矮象草 Mot t
Elephantgras s
0. 727 0. 333 0. 750 0. 444
图 2 3 种牧草 EST及 POD同工酶酶谱
(左为 EST, 右为 POD)
Fig . 2 Idiog ram o f EST ( left par t) and POD
( r ight part) iso zyme o f three for ages
D= 逸生狼尾草( Naturaliz ed P enni setum sp. ) , W= 王草( King-
grass ) , A= 矮象草( Mot t Elephantgrass)
2. 4 RAPD分析
本实验选用了 95条 RAPD引物对 3种植物的
基因组 DNA 进行 PCR扩增(图 2) ,其中检测到多
态性的有 7条(表 4)。从相似系数分析结果(表 5)
可看出,逸生狼尾草与矮象草的相似系数( 0. 948)大
于与王草之间的相似系数( 0. 690)。支持云南德宏
地区逸生狼尾草在分类上属于象草的结论。
图 3 引物 OPA-11、OPY-05、OPZ-06、OPX-17、
OPY-16 扩增结果( 1= 王草、2= 逸生狼尾草、3= 矮象草)
F ig. 3 RAPD results o f pr imers of OPA-11, OPY-05,
OPZ-06, OPX-17, and OPY-16 ( 1= K ingg rass; 2= Natu-
ralazed Pennisetum sp. ; 3= Mo tt Elephantg rass)
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第 5期 周自玮等: 云南德宏地区逸生狼尾草属植物的分类学鉴定
表 4 多态性随机引物的碱基序列
Table 4 Sequences of polymo rphic pr imers
引物
Primer
引物序列
Primer sequence
引物
Prim er
引物序列
Primer s equence
引物
Prim er
引物序列
Primer sequen ce
OPQ-05 CCGCGT CTT G OPY-16 GGGCCA ATGT OPA-11 CAATCGCCGT
OPX- 17 GACACGGACC OPV-17 ACCGGCT TGT OPO-10 TCAGAGCGCC
OPY-15 AGT CGCCCTT
表 5 3 种牧草 RAPD结果相似系数
Table 5 Genetic simila rity coefficient among 3 for ages
王草
Kinggr ass
逸生狼尾草
Naturalized
Penni setum sp.
矮象草
Mot t
Elephantgras s
王草 Kinggras s 1. 000
逸生狼尾草
Naturaliz ed
Pennisetum sp.
0. 690 1. 000
矮象草 Mott
Elephantgras s
0. 676 0. 948 1. 000
3 结论与讨论
3. 1 采用经典分类法难于从形态上确定云南德宏
地区逸生狼尾草在分类上属狼尾草还是象草, 因此
需要其它分类证据的支持。细胞学研究表明, 逸生
狼尾草染色体为 2n= 4x= 28, 属四倍体, 从染色体
数目来看, 德宏狼尾草在分类上应属象草。脂酶及
过氧化物同工酶、RAPD分析结果说明,云南德宏地
区逸生狼尾草与矮象草的遗传距离较近, 进一步证
明逸生狼尾草在分类上属象草。
3. 2 梁英彩 [ 19] 采用聚丙烯酰胺凝胶电泳对桂牧 1
号进行研究, 认为杂交狼尾草、矮象草、桂牧 1号 3
者之间的酯酶同工酶有较大差异, 利用酯酶同工
酶可为品种鉴定及选育提供证据。从表 1、2可以
看出, 本实验中德宏逸生狼尾草、王草、矮象草的
EST、POD同工酶同样具有多样性, 能够进行 3者
之间的鉴定。本实验中因同属品种较少, 不能确
定各草种或品种的特征谱带, 因此 EST 和 POD同
工酶能否用于狼尾草属不同种或同种不同品种鉴
定尚有待进一步研究。
3. 3 杨青辉[ 14]认为根据双亲间的特征带可以对杂
交或自交后代作出鉴定。本实验中, RA PD分析说
明, 3 种草之间的谱带存在多样性, 可以鉴定 3 种
草,但要将 RAPD用于同属不同种或同种不同品种
的鉴定,还需经过大量样品分析,确定不同种或不同
品种的分子标记位点 [ 20, 21]。
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(责任编辑 孟昭仪 李 扬)
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