全 文 ：第20卷 第4期
Vol.20 No.4
草 地 学 报
ACTA AGRESTIA SINICA
2012年 7月
Jul. 2012
野生卵穗苔草泛素结合酶基因片段的克隆与序列分析
刘亚玲1,杨红艳1,张 林1,王召明1*,云锦凤2,崔海鹏1,苑 峰1
(1.内蒙古和信园蒙草抗旱绿化股份有限公司,内蒙古 呼和浩特 010030;
2.内蒙古农业大学生态环境学院,内蒙古 呼和浩特 010019)
摘要:苔草(CarexL.)是我国极具研究开发潜力的乡土草坪草种质资源。采自内蒙古大青山的卵穗苔草(Carex
duriuscula)具有较强的抗旱性和耐贫瘠力,是草坪草抗性育种的重要基因源之一。本研究从野生卵穗苔草干旱抑
制性消减杂交的cDNA文库中测序获得一条长度为291bp、编码50个氨基酸的cDNA基因片段,对该基因片段进
行序列分析,确定其属于泛素结合酶(ubiquitin-conjugatingenzyme,E2s)蛋白家族,命名为Cd-UBC2。该基因生物
信息学分析结果表明:氨基酸组成中不含吡咯赖氨酸(Ply)和硒半胱氨酸(Sec),这与其他物种 UBC蛋白成分非常
接近。二级结构预测表明该蛋白主要由α螺旋和无规则卷曲组成,约占92%。从野生卵穗苔草中成功获得了泛素
结合酶基因片段,为克隆野生卵穗苔草泛素结合酶基因全长及最终分离、克隆苔草抗性基因,草坪草遗传改良和新
品种选育奠定了基础。
关键词:卵穗苔草;泛素结合酶;基因;克隆;生物信息学
中图分类号Q943.2: 文献标识码:A 文章编号:1007-0435(2012)04-0788-05
CloningandSequenceAnalysisofUbiquitin-conjugatingEnzyme
GenefromWildCarexduriuscula
LIUYa-ling1,YANGHong-yan1,ZHANGLin1,WANGZhao-ming1*,
YUNJin-feng2,CUIHai-peng1,YUANFeng1
(1.InnerMongoliaHotisionMonsodDrought-ResistanceGreeningCo.,Ltd,Huhhot,InnerMongolia010030China;
2.ColegeofEcologyandEnvironmentalScience,InnerMongoliaAgriculturalUniversitv,Huhhot,InnerMongolia010019,China)
Abstract:Carexhavingresearchanddevelopmentpotentialisoneofnativeturfgrassgermplasm.Carex
duriusculawithstrongdroughtresistanceandbarrenresistancecolectedfromDaqingshanofInnerMon-
goliaisoneofthemostimportantgeneticresourcesofturfgrassdiseaseresistancebreeding.Inthisstudy,
a291bpgeneencoding50aminoacidresidueswasclonedfromwildCarexduriusculacDNAlibrarycon-
structedbysuppressionsubtractivehybridizationunderdroughtstress.Thisgenewasidentifiedasabe-
longingtotheE2sfamilyaccordingtobioinformaticsanalysis,andnamedasCd-UBC2.Sequenceanalysis
showedthataminoacidscontainednoPlyandSec.ThiswasquitesimilartothecomponentsofUBCpro-
teinsfromotherspecies.Secondarystructurepredictionshowedthatα-helixandrandomcoilaccountingfor
92% weremainlystructure.Ubiquitin-conjugatingenzymegenefragmentsweresuccessfulyobtainedfrom
WildCarex.ThisstudyprovidesthefoundationforcloningofCarexubiquitin-conjugatingenzymegene
fullength,finalyseparating,cloningresistancegeneofCarex,geneticimprovingturfgrass.
Keywords:Carexduriuscula;Ubiquitin-conjugatingenzymes;Gene;Cloning;Bioinformaticsanalysis
苔草(CarexL.)是我国极具研究开发潜力的
乡土草坪草种质资源,是草坪草抗性育种的重要基
因库。大量研究表明,苔草属中的卵穗苔草(Carex
duriuscula)从生态学特征、生物学特性和园艺形状
等方面都具备了草坪草的基本属性和优良的园艺性
状,最适宜建植运动场、足球场、高尔夫球场、赛马
场、飞机场和游园草坪,也可用于固土、护坡、固沙草
坪 ,还可以用于园林绿化[1-2]。分离、克隆卵穗苔
收稿日期:2012-02-16;修回日期:2012-04-09
基金项目:呼和浩特科技计划项目(2010150103000058)(2011150103000018)资助
作者简介:刘亚玲(1983-),女,内蒙古赤峰人,硕士,研究方向为牧草种质资源与遗传育种,E-mail:liuyaling0719@162.com;*通信作者
Authorforcorrespondence,E-mail:hxymc2009@163.com
第4期 刘亚玲等:野生卵穗苔草泛素结合酶基因片段的克隆与序列分析
草抗性基因可为草坪草遗传改良和新品种选育奠定
基础。
当植物受到逆境胁迫时,细胞内的受损蛋白增
多,如果蛋白降解酶含量不足,可能造成蛋白降解不
及时而对植物体造成伤害。泛素通过泛素途径降解
逆境下的异常蛋白,对高温、干旱、冷害、光辐射等逆
境响应。在泛素途径中,泛素结合酶(ubiquitin-conju-
gatingenzymes,UBC2)作用下使得泛素活化酶活化的
泛肽被转移至已与泛素-蛋白连接酶连接的目标蛋
白上,然后在泛肽活化的C-末端Gly与目标蛋白Lys
残基之间形成一个共价键,这样就完成了一次泛肽
化,完成了一次逆境下产生的异常或损坏的蛋白降解
过程,从而维持植物体的正常运转,以协助植物度过
不良环境[4]。泛素结合酶是泛素途径的关键酶,在选
择性降解靶蛋白中起决定性作用,对泛素化修饰的特
异性和精确时空性起关键作用。UBC2家族较大,大
多数E2有一个14~16kD的核心,这一区域可能参
与E2和E3的结合,调控不同的生命活动[5]。高等植
物中的UBC大部分都参与且依赖于泛素途径胞内蛋
白的降解,水稻(Oryzasativa)中的RE2被证明属于
这一类,但通过间接途径参与紫外线损伤的防御和
DNA的修复。另外,水稻中的一个UBC被证明参与
赤霉素GA诱导的α-淀粉酶的表达[6]。在拟南芥
(Arabidopsisthaliana)中,泛素结合酶基因是以32个
成员的基因家族形式存在,可被分为几大亚类,说明
其参与的生命活动途径复杂多样[7]。在耐盐灌木柽
柳(Tamarixandrossowi)中获得了E2基因,异源表
达证明该基因能明显提高烟草的耐旱性[8]。分离、克
隆与植物抗逆有关的UBC基因,对研究植物的抗旱
机理和植物的抗逆性基因工程育种,特别是抗旱育种
具有重要意义。近年来,对泛素结合酶基因在植物逆
境响应方面的研究受到普遍关注,已成为植物逆境响
应研究的重点,但在国内外诸多泛素合成酶基因的相
关报道中未见有关苔草UBC基因的文献资料。
本研究以野生卵穗苔草为试验材料,通过自然
干旱处理,采用抑制消减杂交方法,成功获得了卵穗
苔草泛素结合酶基因片段,为克隆卵穗苔草泛素结
合酶基因全长奠定了基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
卵穗苔草于2010年在呼和浩特大青山采集,移
栽在内蒙古和信园蒙草抗旱绿化股份有限公司和林
基地,通过大田筛选出的抗旱植株为供试材料。自
然干旱处理10d的卵穗苔草叶片为试验组,正常浇
水的卵穗苔草叶片为对照组。
1.2 试验方法
1.2.1 RNA的提取 采用上海生工的总RNA提
取试剂Trizol,具体操作步骤参照说明书。
1.2.2 双链cDNA合成 用Clontech公司SM-
ARTTMPCRcDNAsynthesisKit合成全长的双链
cDNA(dscDNA),具体操作步骤参照说明书。
1.2.3 抑制性消减杂交 应用Clontech公司的
PCR-SelectTMcDNASubtractionKit构建消减cD-
NA文库,具体操作按照试剂盒使用说明。
1.2.4 PCR产物的纯化、回收、连接及连接产物转
化 利用全式金公司的EasyPurePCRPurificationKit
对2次PCR产物进行纯化,具体操作按照试剂盒使用
说明。DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒购自上海生工公
司,具体操作参照说明书。连接试剂使用PMD19-T克
隆试剂盒,购自大连宝生物公司,具体作按试剂盒说明
书进行。连接产物转化至大肠杆感受态细胞中,37℃
培养16h,挑取单菌落于液体培养基中培养,提取质粒
送至上海生工生物技术服务有限公司测序。
2 结果与分析
2.1 RNA提取结果
高质量的总RNA是构建高质量的cDNA文库
的前提条件。采用 Trizol裂解液提取苔草的总
RNA,取1μL电泳检测,通过1%的琼脂糖变性凝
胶电泳检测,如图1所示,说明试验得到了高质量的
RNA,可以满足下一步试验要求。
图1 总RNA凝胶电泳(0.1%)
Fig.1 ElectrophoresisoftotalRNA
注:1和2为试验组RNA,3和4为对照组RNA
Note:Lane1,2:RNAextractedfromtestgroup;
lane3,4:RNAextractedfromcontrolgroup
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草 地 学 报 第20卷
2.2 双链cDNA合成与纯化
用Clontech公司SMARTTMPCRcDNAsyn-
thesisKit合成全长的双链cDNA(dscDNA),并对
其进行纯化,琼脂糖凝胶电泳结果显示:dscDNA呈
现出典型的弥散带(smear),大小分布于500~1500
bp之间(图2)。
图2 对照组dscDNA纯化
Fig.2 PurificationofcontrolgroupdscDNA
注:1:未纯化的dscDNA;2:M1kb;3:纯化dscDNA片段,
4:M1kb,5:纯化的dscDNA
Note:Lane1:unpurifieddscDNA;lane2:1kbMarker;
lane3:purifieddscDNAfragments;lane4:1kbMarker;
lane5:purifieddscDNA
2.3 抑制性消减杂交
应 用 Clontech 公 司 的 PCR-SelectTMcDNA
SubtractionKit构建干旱胁迫消减cDNA文库,用
QIAquiek柱纯化dscDNA后,再用Rsal酶切。酶
切过的dscDNA片段进行接头连接后,进行2次杂
交反应。经过2次杂交的产物接着进行2次PCR
扩增,在第1次扩增中只有两端有不同接头的
dscDNA被指数扩增,第2次是巢式PCR能进一步
富集差异表达序列并减少背景。将第1次PCR扩
增产物稀释10倍,进行第2次PCR扩增,2次PCR
结果如图3所示。扩增后的PCR产物都是弥散的
cDNA,主要集中在300~800bp之间。
2.4 消减文库的构建
将消减的第2次PCR产物连接到pMD-19T载
体,然后转化E.coli.DH5α感受态细菌,在LB固体
培养基上37℃培养过夜后可见数百个白色菌落。
这些白色菌落中通常含有阳性的重组质粒,挑取阳
性白色菌落加甘油(终浓度为15%)保存于-80℃。
随机挑选部分阳性克隆进行PCR检测,电泳结果显
示PCR扩增得到的插入片段均为单一的、特异条
带,大小主要分布在500~750bp之间,其大小不同
是由于各基因中Rsal酶切位点之间的距离不同而
产生的,呈随机分布。SSH运用了识别四碱基位点
并产生平头端的Rsal限制性内切酶使得酶切产生
的cDNA片段长度为600bp左右,因此本研究中库
克隆的插入片段大小与预期的结果相符。随机挑选
阳性的单克隆送至上海生工进行测序。
图3 差减的cDNA的2次PCR结果
Fig.3 TwoPCRresultsofsubtractivecDNA
注:1:M,标准分子量1kb;2:对照组第2次PCR;3:对照组第1
次PCR;4:M,标准分子量1500bp;5:试验组第2次PCR;6:对照组
第1次PCR
Note:Lane1:1kbMarker;lane2:thesecondPCRproductsof
testgroup;lane3:thefirstPCRproductsoftestgroup;lane4:
1500bpMarker;lane5:thesecondPCRproductsofcontrolgroup;
lane6:thefirstPCRproductsofcontrolgroup
图4 部分阳性克隆PCR检测
Fig.4 thePCRdetectionofpositiveclones
注:M:2000bpMarker;1:阴性克隆;2~7:部分阳性克隆PCR检测
Note:M:2000bpMarker;lane1:thePCRdetectionofnega-
tiveclones;lane2~7:thePCRdetectionofpositiveclones
2.5 Cd-UBC2基因同源性分析
对随机的阳性克隆序列测定结果在 NCBI的
GenBank中进行BLAST分析,其中有一个基因片
段和泛素结合酶同源性较高(图5)。该基因与葡萄
(Vitisvinifera)ubiquitin-conjugatingenzyme(XM
_003633920.1)、杜仲(Eucommiaulmoides)ubiq-
uitinconjugatingenzymeE2(EU170471.1)、风信
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第4期 刘亚玲等:野生卵穗苔草泛素结合酶基因片段的克隆与序列分析
子 (Hyacinthusorientalis)ubiquitin-conjugating
enzymeUBC2(UbC2)(AF176040.1)基因同源性均
在80%以上。由此推测该序列为 UBC家族成员,
命名为Cd-UBC2基因。
图5 Cd-UBC2基因同源性分析
Fig.5 HomologyanalysisofCd-UBC2gene
2.6 Cd-UBC2基因片段序列分析
利用DNAMAN软件对获得的基因片段cDNA
序列进行分析。所获得的Cd-UBC2cDNA长291
bp,推测编码了50个氨基酸(图6)。利用 Prot-
Param工具(www.expasy.ch/tools/protparam.ht-
ml)对该基因蛋白质物理化学性质进行预测。结果
表明:蛋白质的相对分子质量约为5508.3,理论等
电点(pI)为5.55。序列氨基酸主要由Leu(亮氨
酸)、Pro(脯氨酸)、Ser(丝氨酸)、Asp(天冬氨酸)、
Thr(苏氨酸)、Ile(异亮氨酸)、Lys(赖氨酸)这7种
氨基酸组成,占总量的64%,不含Ply(吡咯赖氨酸)
和Sec(硒半胱氨酸)。用BlastP预测,进一步证实
了该基因属于UBC蛋白基因家族(图7)。
图6 Cd-UBC2氨基酸序列分析
Fig.6 AminoacidsequenceanalysisofCd-UBC2
图7 Cd-UBC2基因家族
Fig.7 GenefamilyofCd-UBC2
2.7 Cd-UBC2基因二级结构预测
在http://npsa-pbil.ibcp.fr/网站在线分析,
Cd-UBC2基因二级结构由α-螺旋组成和无规则卷
曲组成,约占92% (图8)。
2.8 Cd-UBC2基因系统进化树
利用 NCBI中的BLAST和DNAMAN软件,
对卵穗苔草、车前(Plantagomajor)、大豆(Glycine
max)、大麦(Hordeumvulgare)、辣椒(Chilipep-
per)、马铃薯(Solanumtuberosum)、苜蓿(Medicago
truncatula)、拟南芥、葡萄、水稻、豌豆(Pisumsati-
vum)、鹰嘴豆(Cicerarietinum)、玉米(Zeamays)
等植物的UBE 基因在氨基酸水平上进行聚类分
析。由图9可以看出,卵穗苔草和车前聚在了一起,
禾本科、豆科、茄科植物分别聚在了一起,充分说明
UBC 基因具有一定的物种保守性。
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草 地 学 报 第20卷
图8 Cd-UBC2二级结构预测
Fig.8 SecondarystructurepredictionofCd-UBC2
图9 Cd-UBC2分子进化树
Fig.9 MolecularphylogenetictreeofCd-UBC2
3 讨论与小结
3.1 本研究从野生卵穗苔草干旱抑制性消减杂交
cDNA文库中克隆了UBC 基因的片段cDNA 序
列,该序列长291bp,编码了50个氨基酸,分子量为
5508.3,pI值为5.55,氨基酸组成中不含Ply(吡咯赖
氨酸)和Sec(硒半胱氨酸),这与大多数研究结果一
致[8-10]。通过其推导的氨基酸序列与其他物种UBC
序列的比对中发现,该基因属于泛素结合酶家族。
3.2 对各物种中 UBC同源基因的分子进化关系
分析发现,Cd-UBC2基因与车前的进化关系较近,
说明存在于卵穗苔草中的泛素结合酶Cd-UBC2,与
车前UBC 基因可能具有相近的功能。
本研究成功地从野生卵穗苔草cDNA消减文
库中克隆了UBC2基因的cDNA序列片段,其结果
为卵穗苔草 UBC2全长的获得和功能研究奠定了
理论和试验基础;选用生物信息学分析软件对其进
行预测和分析,有助于避免进行后续工作时的盲目
性,也为探讨UBC2系统如何对蛋白进行选择性调
控、以及弄清作用于底物蛋白的特异性泛素连接酶
及识别底物蛋白的信号等研究打下基础。
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(责任编辑 李美娟)
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