全 文 ：书西北植物学报!
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文章编号$
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#"*+&"&
%
,
*-../*#""")$"!(*!"#$*"#*""&"
收稿日期$
!"#%)#")!$
&修改稿收到日期$
!"#%)#!)!"
基金项目$福建省大宗蔬菜产业体系"
!"#!01%#%2!2$
#&福建省自然科学基金"
!"#!
,
"#"1!
#&福建农林大学校重点建设项目"
&##!3"$"2
#
作者简介$赵瑞丽"
#21+
#!女!在读硕士生!主要从事蔬菜遗传育种研究
4)56-7
$
897!"#%(!"
!
#&%*3:5
"
通信作者$林义章!教授!硕导!主要从事蔬菜遗传育种研究
4)56-7
$
7
;
8!""%""+
!
#&%*3:5
小白菜
%"1%23$
基因的克隆及表达分析
赵瑞丽!钟凤林!林义章"!高世超!林俊芳!杨碧云!胡海非
"福建农林大学 园艺学院!福州
%("""!
#
摘
!
要$采用
3<=>)>?@A
和
B>C4
技术从小白菜中克隆得到泛素结合酶
4!
基因"
DE-
F
D-G-/3:/
,
D
H
6G-/
H
I/8
;
5I
4!
#!命名为
!"#!$%!
序列分析表明!
"#!$%!
基因
3<=>
全长
1%"E
J
!包含
#
个
$(&E
J
的开放阅读框!编码
#(!
个氨基酸结构分析发现!该序列包含一个泛素结合酶
4!
活性位点和一个高度保守的半胱氨酸进化分析
显示!小白菜
K3LKC4!
蛋白同拟南芥
4!
蛋白的亲缘关系最近
F
BM)ACB
分析表明!
"#!$%!
基因在小白菜根(
茎(叶中均有表达!铜处理
#"N
时
!"#!$%!
基因的表达量最高研究认为!
!"#!$%!
基因可能在铜胁迫响应中
发挥重要作用
关键词$小白菜&泛素结合酶
4!
&
B>C4
&铜胁迫
中图分类号$
O+1(
&
O+1&
文献标志码$
>
%&"()!*+
,
-(..#"/)&
0
.#."1%"1%23$
2((1-"3%($44-"$"5-/)/4-445
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@T=U-8V6/
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D/
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C:7I
H
I:YQ:9G-3D7GD9I
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9-3D7GD9I6/N?:9I.G9
;
L/-ZI9.-G
;
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CV-/6
#
/6.7-)87
$
MVIDE-
F
D-G-/)3:/
,
D
H
6G-/
H
I/8
;
5I4!
H
I/I
!
NI.-
H
/6GIN6.!"#!$%!
!
[6.-.:76GINY9:5!&(()"
"*)+,+()(@*E
;
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H
-I.*MVIYD77I/
H
GV.I
F
DI/3I:Y!"#!$%!
H
I/I[6.1%"
E
J
!
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J
I/9I6N-/
H
Y965I
"
RB?
#
:Y$(&E
J
GV6GI/3:NIN#(!65-/:63-N9I.-NDI.*WG9D3GD9676/67)
;
.-.9IZI67INGV6GGVI.I
F
DI/3I3:/G6-/.6/4!DE-
F
D-G-/)3:/
,
D
H
6G-/
H
I/8
;
5I63G-ZI.-GI6/N6V-
H
V7
;
3:/)
.I9ZIN3
;
.GI-/I*AV
;
7:
H
I/IG-36/67
;
.-..V:[INGV6GK3LKC4!
J
9:GI-/V6.GVI37:.I.G9I76G-ZI[-GV4!
J
9:)
GI-/Y9:5-&.)/0
1
()(2*3)+*
F
BM)ACB9I.D7G..V:[INGV6GGVII\-.GI/3I:Y!"#!$%![6.NIGI3G6E7I-/
9::G
!
.GI56/N7I6Y*MVIIJ
9I..-:/7IZI7:Y!"#!$%!
H
I/I9I63VINGVIV-
H
VI.GD/NI93:
JJ
I9.G9I..Y:9#"
N*MV-..V:[INGV6GGVI!"#!$%!
H
I/I56
;J
76
;
6/-5
J
:9G6/G9:7I-/GVI9I.
J
:/.IG:3:
JJ
I9.G9I..*
9(
0
:"-!.
$
!&(()""*)+,+()(@*
&
!"#!$%!
&
B>C4
&
3:
JJ
I9.G9I..
!!
泛 素
)
蛋 白 酶 体 途 径 "
DE-
F
D-G-/)
J
9:GI6.:5I
J
6GV[6
;
!
LAA
#广泛存在于真核生物中!对蛋白质
的降解具有高度选择性!它通过调节功能蛋白质的
周转或降解不正常的蛋白实现对多种代谢过程的调
节!在维持细胞功能以及周期运转!抵御环境胁迫!
胚胎发育!激素响应和衰老等方面发挥着重要的作
用)#)(*泛素结合酶
4!
"
DE-
F
D-G-/3:/
,
D
H
6G-/
H
I/)
8
;
5I4!
#是
LAA
途径的关键作用酶之一!具有结
合并转移泛素到靶蛋白的作用!决定泛素链长度(拓
扑结构和蛋白泛素化效率)&*!对泛素化修饰的特异
性和精确性起着关键作用)$)(*有研究表明!干旱(
重金属(高温等非生物胁迫因素能够诱导植物泛素
结合酶
4!
基因表达!从而提高植物适应不良环境
的能力目前!泛素结合酶
4!
基因响应干旱(高
盐(
W>
及重金属汞的研究已有报道)+)2*!而关于该基
因响应铜胁迫的研究尚未见报道
小白菜"
!&(()""*)+,+()(@*
#是十字花科芸
薹属植物!营养价值较高!栽培面积较广!是备受人
们喜爱的蔬菜之一近年来!由于含重金属农药(化
肥(有机肥的使用以及工业废水的排放!使得土壤中
铜含量越来越高!严重影响了小白菜的产量和品
质)#")#%*因此挖掘小白菜自身所具有的抗逆基因!
研究其机理和通过操纵这些抗逆基因的表达提高小
白菜对不良环境的适应能力就显得非常重要本试
验应 用
3<=>)>?@A
"
3<=> 65
J
7-Y-INY96
H
5I/G
7I/
H
GV
J
:7
;
5:9
J
V-.5
#技术分析
#"5
H
%
@
铜胁迫下
小白菜基因的差异表达!得到了与小白菜铜胁迫相
关的泛素结合酶
4!
基因的差异表达
M"
G96/)
.39-
J
GNI9-ZINY96
H
5I/G
#&利用
B>C4
技术克隆获
得该基因
3<=>
全长!命名为
!"#!$%!
&利用生物
信息学对其核苷酸序列以及编码的氨基酸序列进行
了分析&采用
F
BM)ACB
分析该基因在铜胁迫下的
表达模式!为进一步研究其在抗逆过程中的生物学
功能奠定基础
#
!
材料和方法
;*;
!
材料及铜胁迫处理
本试验供试小白菜品种为+上海青,!将种子播
于珍珠岩和草炭土按
%]#1
比例混匀的穴盘中!待
幼苗长到
$
"
(
片真叶时!作为试验材料在叶菜类营
养液)#$*中水培!铜质量浓度为
#"5
H
%
@
!以
CDWR
$
-
(Q
!
R
形态加入培养液每隔
(N
更换
#
次!每次
更换前取样分别取处理
"
((
#"
(
#(
(
!"N
时的根(
茎和第
(
片真叶"去除主叶脉#用液氮速冻后保存于
1"^
冰箱备用
;*$
!
方
!
法
;5$5;
!
小白菜总
<=/
提取与
8>=/
的合成
!
采用
M9-8:7
"
T/Z-G9:
H
I/
公司#试剂提取小白菜总
B=>
!
并进行电泳检测和吸光度"
R<
#值的测定分别利
用
BIZI9G>-G?-9.G.G96/N3<=>W
;
/GVI.-.0-G
试剂
盒"
MVI95:
公司#和
W_>BM
M_
B>C43<=>>5)
J
7-Y-36G-:/
试剂盒 "
C:/GI3V
公司#!将所提取的
B=>
反转录成
3<=>
!作为
%`)B>C4
和
(`)B>C4
的模板合成
%`)B>C4
模板
3<=>
的引物为锚定
引物
>A

3<=>
第二链合成采用
@<)ACB
法进
行!双链
3<=>
用紫外分光光度法检测
;5$5$
!
8>=/?/@4A
分析
!
3<=>)>?@A
分析参照
张凤云)#(*的方法进行将差异表达
M进行回
收(二次
ACB
后经连接(转化(验证后送上海博尚公
司测序测序后的
M核苷酸序列于
=CKT
上进
行
K76.G
比对!预测其功能!筛选出与铜胁迫相关的
基因
;*$*B
!
基因全长的扩增及测序
!
差异表达
M功能分析发现一个与
4!
基因相关的
M片段
根据获得的
M片段设计
%`)B>C4
和
(`)B>C4
引物"表
#
#进行嵌套
ACB
扩增!第一轮
ACB
扩增
产物稀释
#"
倍作为第二轮的模板将所获得的目
的片段回收(纯化后送到上海博尚公司测序根据
测序结果利用
<=>_>=
软件将
(`)B>C4
(
%`)
B>C4
序列与
M片段拼接整合!得到
!"#!$%!
基因的
3<=>
全长序列在全长序列的
%`)LMB
和
(`)LMB
处设计特异引物
LKC)?
(
LKC)B
用于克隆
!"#!$%!
基因的
RB?
!进行序列校正
;*$*C
!
生物信息学分析
!
利用相关软件分析
K3LKC4!
表
;
!
%"1%23$
基因克隆及荧光定量
A%<
所用引物
M6E7I#
!
A9-5I9.Y:937:/-/
H
6/N
F
BM)ACB:Y!"#!$%!
引物名称
A9-5I9/65I
引物序列
A9-5I9.I
F
DI/3I
"
(`
#
%`
# 用途
J
G-:/
LKC)%#
LKC)%!
MC>>S>C>>C>>C>MC>MSCMCMSS
SSS>SM>M>MSCMMSS>C>MCC
%`)B>C4
LKC)(#
LKC)(!
SS>MSMCC>>SC>M>M>CMCCC>MC
C>S>SC>MS>MSMMSMMSMCMMS
(`)B>C4
LKC)?
LKC)B
CC>CSSMM>S>S>SS>SS>MSMCS
CC>>>C>C>>S>S>SS>SSMMC
RB?
扩增
>5
J
7-Y-3-G-:/:YRB?
LKC9G)?
LKC9G)B
63G-/)?
63G-/)B
MSCMCC>C>>S>C>>C>>C>MC
MCCS>S>>>C>>>CCS>>C>
SMCCMSMMCC>SCCMMCSMMC
C>>SMCCMMCCMS>M>MCC>CSMC
F
BM)ACB
>A SSCC>CSCSMCS>CM>M>CMMMMMMMMMMMMMMMMM
反转录
BIZI9.IG96/.39-
J
G-:/
#&
#
期
!!!!!!!!!!!!!!
赵瑞丽!等$小白菜
!"#!$%!
基因的克隆及表达分析
的氨基酸序列$用
K76.G
"
VGG
J
$%%
E76.G*/3E-*/75*
/-V*
H
:Z
%
K76.G*3
H
-
#进行同源序列搜索&用
A9:G)
A6965
"
VGG
J
$%%
[IE*IJ
6.
;
*:9
H
%
J
9:G
J
6965
%#预测
基本的理化性质&用
A9:W367
"
VGG
J
$%%
[IE*IJ
6.
;
*
:9
H
%
J
9:G.367I
%#默认算法"
Q
J
V:E*
%
0
;
GIa<::7-G)
G7I
#预测该蛋白的疏水性&用
M_Q__
"
VGG
J
$%%
[[[*3E.*NGD*Nb
%
.I9Z-3I.
%
M_Q__
%#预测跨膜
结构&用
W-
H
/67A$*#WI9ZI9
"
VGG
J
$%%
[[[*3E.*
NGD*Nb
%
.I9Z-3I.
%
W-
H
/67A
%#预测信号肽&选取部分
4!
!应用
<=>_>=
进行序列比对&用
_4S>(*!
构建系统进化树
;5$5D
!
%"1%23$
基因特异性表达分析
!
分别提取
培养
"
((
#"
(
#(
(
!"N
的小白菜总
B=>
!用
WD
J
I9)
.39-
J
G
M_
#
?-9.G)WG96/N3<=> W
;
/GVI.-.W
;
.GI5
Y:9BM)ACB
试剂盒合成第一链利用小白菜
63G-/
为内参基因设计引物"
63G-/)?
(
63G-/)B
#根据已得
到的
!"#!$%!
基因
3<=>
全长设计特异性引物
LKC9G)?
和
LKC9G)B
用
WUKBA9I5-\4\4
5
试
剂盒进行
F
BM)ACB

!
!
结果与分析
$5;
!
小白菜铜胁迫
8>=/?/@4A
分析
利用筛选出多态性较好的
#%(
对引物组合!对
铜胁迫
"
((
#"
(
#(
(
!"N
叶片的
3<=>
进行聚丙烯
酰胺凝胶电泳分析!共筛选出
#1"
条差异表达
M!从中挑选差异较为明显的
#(!
条
M进行
二次
ACB
扩增(回收(测序!最终得到
#(#
条有效序
列将获得的
#(#
条
M进行功能分析!发现
#
个与小白菜泛素结合酶
4!
相关的
M!其表达量
在铜胁迫
#"N
时最高"图
#
#测序结果表明!该
M长度为
%2%E
J
"图
!
#!
K76.G
分析表明!该片段
与拟南芥泛素结合酶
4!
蛋白的一致性高达
2+c
!
推测其可能是小白菜泛素结合酶
4!
基因
3<=>
上
的一个片段
$5$
!
%"1%23$
基因
8>=/
全长的克隆与序列分析
利用
B>C4
技术获得
!1%E
J
的
(`
序列和
$(#
E
J
的
%`
序列"图
%
#!将
%`
( 序`列与
3<=>)>?@A
技
术获得
%2%E
J
的
M片段拼接后得到
1%"E
J
的
泛素结合酶
4!
的
3<=>
全长"命名为
!"#!$%!
!
SI/K6/b
登录号
0?#$1"!%
#该序列包含一个
$(2
E
J
的开放阅读框!
#("E
J
的
(`)LMB
和
!!#E
J
的
%`)LMB
序列!
%&E
J
A:7
;
>
!推测其编码
#(!
个氨
基酸!含有起始密码子
>MS
和终止密码子
M>S
"图
$
#特异引物
LKC)?
(
LKC)B
克隆
RB?
测序
结果与拼接后的序列相一致
$5B
!
%"1%23$
基因生物信息学分析
用
A9:GA6965
软件预测!
!"#!$%!
基因编码
的蛋白分子量为
#+*!1b<
!理论等电点为
(*%+
!所
带的正电荷总数"
>9
H
d@
;
.
#为
#1
!负电荷总数
"
>.
J
dS7D
#为
#&
!为酸性蛋白理论推导半衰期是
%"V
!消光系数为
!1"1(
!不稳定指数为
+!*"$
!为不
稳定蛋白"参数大于
$"
是不稳定蛋白#
利用
4J
6.
;
网站对蛋白质亲水性(疏水性进
行分析!结果显示疏水性氨基酸占
!&*+c
!亲水性
氨基酸占
+%*%c
!为亲水性蛋白!但不存在跨膜区
和信号肽结构域预测!
!"#!$%!
的
3<=>
推导
的氨基酸序列在第
!$)%1
部位存在一个
e<)
重复结
构第
++)2!
残基部位有一个保守结构域!包含
#(
个氨基酸"
?QA=TU>#!是
4!T
型的
酶活性中心)#&*其间第
11
部位存在一个高度保守
且具有催化活性的半胱氨酸残基
C
;
.
"
C
#!能够与泛
素形成高能硫酯键进而将泛素转移到
4%
酶或靶蛋
白上)#+)#2*多序列比对发现"图
(
#!保守结构域的
#(
个氨基酸残基和第
11
位的半胱氨酸残基与其他
真核生物
4!
对应的序列完全匹配!在进化上高度
图
#
!
铜胁迫下小白菜
!"#!$%!
基因
3<=>)>?@A
图谱
?-
H
*#
!
3<=>)>?@A56
J
:Y!"#!$%!-/
!6"*)+,+()(@*D/NI93:
JJ
I9.G9I..
图
!
!
铜胁迫下小白菜
!"#!$%!
基因的差异表达
M序列
?-
H
*!
!
MVIMF
DI/3I:Y!"#!$%!-/!6"*)+,+()(@*D/NI93:
JJ
I9.G9I..
!&
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
图
%
!
!"#!$%!
基因
ACB
扩增结果
_*<@!"""
&
>*%`)B>C4
扩增&
K#
(
K!*(`)B>C4
扩增&
C#
"
C%*RB?
?-
H
*%
!
>5
J
7-Y-36G-:/
J
9:ND3G.:Y!"#!$%!
_*<@!"""
&
>*>5
J
7-Y-36G-:/
J
9:ND3G.:Y%`)>C4
&
K#6/NK!*>5
J
7-Y-36G-:/
J
9:ND3G.:Y(`)B>C4
&
C#
"
C%*RB?
图
$
!
!"#!$%!
基因核苷酸序列及推导氨基酸序列
方框内为起始密码子和终止密码子&单下划线部分为
e<)
重复结构&双下划线部分为
LKC
活性位点&阴影为保守的半胱氨酸
?-
H
*$
!
=D37I:G-:NI.I
F
DI/3I6/NNIND3IN65-/:63-N.I
F
DI/3I:Y!"#!$%!
MVI-/-G-6G:96/NGI95-/6G:93:N:/.
!
>MS6/NM>S
!
69IE:\IN
&
MVI.-/
H
7I7-/I.-/N-36GIe<)$"9I
J
I6G.6/N
GVIN:DE7I7-/I.-/N-36GIGVI63G-ZI.-GI:YLKC
&
WV6NIN9I.-NDI-/N-36GI3:/.I9Z6G-ZI3
;
.GI-/I
图
(
!
!"#!$%!
基因推测的氨基酸序列与其他同源序列的比对
e
区为
e<)
重复结构!
L
区为
LKC
活性位点!
"
为保守的半胱氨酸
?-
H
*(
!
>7-
H
/5I/G:YNIND3IN65-/:63-N.I
F
DI/3I.EIG[II/!"#!$%!6/N
V:5:7:
H
:D.
H
I/I.Y9:5!6"*)+,+()(@*6/N.:5I:GVI9
J
76/G.
J
I3-I.
e69I6-.e<)9I
J
I6G.
!
L69I6-.LKC63G-ZI.-GI
!
"
-/N-36GI3:/.I9Z6G-ZI3
;
.GI-/I
%&
#
期
!!!!!!!!!!!!!!
赵瑞丽!等$小白菜
!"#!$%!
基因的克隆及表达分析
保守将小白菜
K3LKC4!
的编码蛋白与
SI/K6/b
中登载的
##
个物种的
4!
蛋白进行聚类分析!构建
4!
进化树!结果"图
&
#显示!小白菜
K3LKC4!
蛋白
与同为十字花科拟南芥的
4!
蛋白的亲缘关系最
近!首先聚为一支!同玉米的
4!
蛋白的亲缘关系
最远
$5C
!
%"1%23$
基因在铜胁迫下的特异性表达
为研究小白菜
!"#!$%!
基因对铜胁迫的应
答!用
F
BM)ACB
检测铜胁迫
"
((
#"
(
#(
(
!"N
的根(
茎(叶片中
!"#!$%!
基因的表达"图
+
#!结果显示
该基因在根(茎(叶中均有表达!但其表达丰度不同!
图
&
!
小白菜
K3LKC4!
与其他物种泛素
结合酶
4!
氨基酸序列系统进化分析
分支点数字表示
K::G.G96
J
验证中基于
#"""
次重复该节点可信度
?-
H
*&
!
AV
;
7:
H
I/IG-3G9II:Y65-/:63-N.I
F
DI/3I.:Y
K3LKC4![-GV4!Y9:5!6"*)+,+()(@*6/N:GVI9.
J
I3-I.
MVI/D5EI96GGVI/:NI.9I
J
9I.I/G.GVI9I7-6E-7-G
;
J
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J
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时
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基因的表达量最高!
#"N
后
其表达量降低!但仍高于对照 "处理
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讨
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论
泛素结合酶
4!
是一个多基因家族!拟南芥基
因组中有
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基因!根据结构和功能可将
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基因分为
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大亚类$
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只含有
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结构域!在
许多短命蛋白和异常蛋白的泛素依赖性降解中起重
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能够参与靶蛋白识别(与
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与其它物种的
4!
具有极高的相似性!结构域分析
发现该基因含一个
LKC
催化结构域和一个高度保
守的半胱氨酸残基!但不含
C)
末端延伸结构和
=)
末
端延伸结构因此小白菜
!"#!$%!
基因属于小白
菜
$
类
4!

泛素结合酶
4!
可与苯丙氨酸解氨酶等防御反
应基因启动子上特定的顺式作用元件结合!实现对
植物防御反应的调节)!#*本研究结果显示!小白菜
!"#!$%!
基因在根(茎(叶中均有表达!在铜胁迫
下该基因被诱导而上调表达!且胁迫
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时表达量
最高!
#"N
后表达量降低!这与
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等)!!*的研
究结果相似
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基因存在着
种类和功能多样性!在逆境作用下
4!
基因表现出
下调或上调等不同的表达方式)!#*
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等)!%*
研究发现番茄
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基因受热激和重金属诱导
表达增强!拟南芥
-2#!$!
基因对紫外光胁迫和植
物激活因子表现出较强的抗性)!$)!(*这些结果说明
4!
基因可能通过参与不正常蛋白的降解过程!从而
提高植物的抗逆性本研究表明在胁迫发生时!
!"#!$%!
在小白菜根(茎(叶中均能响应铜胁迫!
但其对铜胁迫的响应机制尚不清楚!有待进一步
研究
参考文献!
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