全 文 ：书西北植物学报!
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$#"*+&"& % , *-../*#""")$"!(*!"#$*"#*""&" 收稿日期$
!"#%)#")!$&修改稿收到日期$
!"#%)#!)!"
基金项目$福建省大宗蔬菜产业体系" !"#!01%#%2!2$
#&福建省自然科学基金"
!"#!
,
"#"1!
#&福建农林大学校重点建设项目"
&##!3"$"2 # 作者简介$赵瑞丽"
#21+
#!女!在读硕士生!主要从事蔬菜遗传育种研究
4)56-7
$897!"#%(!" ! #&%*3:5 " 通信作者$林义章!教授!硕导!主要从事蔬菜遗传育种研究
4)56-7
$7 ; 8!""%""+ ! #&%*3:5 小白菜 %"1%23$
基因的克隆及表达分析
赵瑞丽!钟凤林!林义章"!高世超!林俊芳!杨碧云!胡海非
"福建农林大学 园艺学院!福州
%("""!
#
摘
!
要$采用 3<=>)>?@A 和 B>C4 技术从小白菜中克隆得到泛素结合酶 4! 基因" DE- F D-G-/3:/ , D H 6G-/ H I/8 ; 5I 4! #!命名为 !"#!$%!
序列分析表明!
"#!$%! 基因 3<=> 全长 1%"E J !包含 # 个$(&E
J
的开放阅读框!编码
#(!
个氨基酸结构分析发现!该序列包含一个泛素结合酶
4!
活性位点和一个高度保守的半胱氨酸进化分析
显示!小白菜
K3LKC4!
蛋白同拟南芥
4!
蛋白的亲缘关系最近
F
BM)ACB
分析表明!
"#!$%! 基因在小白菜根( 茎(叶中均有表达!铜处理 #"N 时 !"#!$%!
基因的表达量最高研究认为!
!"#!$%! 基因可能在铜胁迫响应中 发挥重要作用 关键词$小白菜&泛素结合酶
4!
&
B>C4
&铜胁迫
中图分类号$O+1( & O+1& 文献标志码$
>
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0
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H
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I/9I6N-/
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Y965I
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RB?
#
:Y$(&E J GV6GI/3:NIN#(!65-/:63-N9I.-NDI.*WG9D3GD9676/67) ; .-.9IZI67INGV6GGVI.I F DI/3I3:/G6-/.6/4!DE- F D-G-/)3:/ , D H 6G-/ H I/8 ; 5I63G-ZI.-GI6/N6V- H V7 ; 3:/) .I9ZIN3 ; .GI-/I*AV ; 7: H I/IG-36/67 ; .-..V:[INGV6GK3LKC4! J 9:GI-/V6.GVI37:.I.G9I76G-ZI[-GV4! J 9:) GI-/Y9:5-&.)/0 1 ()(2*3)+* F BM)ACB9I.D7G..V:[INGV6GGVII\-.GI/3I:Y!"#!$%![6.NIGI3G6E7I-/
9::G
!
.GI56/N7I6Y*MVIIJ
9I..-:/7IZI7:Y!"#!$%! H I/I9I63VINGVIV- H VI.GD/NI93: JJ I9.G9I..Y:9#" N*MV-..V:[INGV6GGVI!"#!$%!
H
I/I56
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76
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6/-5
J
:9G6/G9:7I-/GVI9I.
J
:/.IG:3:
JJ
I9.G9I..*
9(
0
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$!&(()""*)+,+()(@* & !"#!$%!
&
B>C4
&
3:
JJ
I9.G9I..
!!
泛 素
)
蛋 白 酶 体 途 径 "
DE-
F
D-G-/)
J
9:GI6.:5I
J
6GV[6
;
!
LAA
#广泛存在于真核生物中!对蛋白质
的降解具有高度选择性!它通过调节功能蛋白质的
周转或降解不正常的蛋白实现对多种代谢过程的调
节!在维持细胞功能以及周期运转!抵御环境胁迫!
胚胎发育!激素响应和衰老等方面发挥着重要的作
用)#)(*泛素结合酶
4!
"
DE-
F
D-G-/3:/
,
D
H
6G-/
H
I/)
8
;
5I4!
#是
LAA
途径的关键作用酶之一!具有结
合并转移泛素到靶蛋白的作用!决定泛素链长度(拓
扑结构和蛋白泛素化效率)&*!对泛素化修饰的特异
性和精确性起着关键作用)$)(*有研究表明!干旱( 重金属(高温等非生物胁迫因素能够诱导植物泛素 结合酶 4! 基因表达!从而提高植物适应不良环境 的能力目前!泛素结合酶 4! 基因响应干旱(高 盐( W> 及重金属汞的研究已有报道)+)2*!而关于该基 因响应铜胁迫的研究尚未见报道 小白菜" !&(()""*)+,+()(@* #是十字花科芸 薹属植物!营养价值较高!栽培面积较广!是备受人 们喜爱的蔬菜之一近年来!由于含重金属农药(化 肥(有机肥的使用以及工业废水的排放!使得土壤中 铜含量越来越高!严重影响了小白菜的产量和品 质)#")#%*因此挖掘小白菜自身所具有的抗逆基因! 研究其机理和通过操纵这些抗逆基因的表达提高小 白菜对不良环境的适应能力就显得非常重要本试 验应 用 3<=>)>?@A " 3<=> 65 J 7-Y-INY96 H 5I/G 7I/ H GV J :7 ; 5:9 J V-.5 #技术分析 #"5 H % @ 铜胁迫下 小白菜基因的差异表达!得到了与小白菜铜胁迫相 关的泛素结合酶 4! 基因的差异表达 M?<br" G96/) .39- J GNI9-ZINY96 H 5I/G #&利用 B>C4 技术克隆获 得该基因 3<=> 全长!命名为 !"#!$%!
&利用生物
信息学对其核苷酸序列以及编码的氨基酸序列进行
了分析&采用
F
BM)ACB
分析该基因在铜胁迫下的
表达模式!为进一步研究其在抗逆过程中的生物学
功能奠定基础
#
!
材料和方法
;*;
!
材料及铜胁迫处理
本试验供试小白菜品种为+上海青,!将种子播
于珍珠岩和草炭土按
%]#1
比例混匀的穴盘中!待
幼苗长到
$" ( 片真叶时!作为试验材料在叶菜类营 养液)#$*中水培!铜质量浓度为
#"5
H
%
@
!以
CDWR
$- (Q ! R 形态加入培养液每隔 (N 更换 # 次!每次 更换前取样分别取处理 " (( #" ( #( ( !"N 时的根( 茎和第 ( 片真叶"去除主叶脉#用液氮速冻后保存于 1"^ 冰箱备用 ;*$
!
方
!
法
;5$5; ! 小白菜总 <=/ 提取与 8>=/ 的合成 ! 采用 M9-8:7 " T/Z-G9: H I/ 公司#试剂提取小白菜总 B=> ! 并进行电泳检测和吸光度" R< #值的测定分别利 用 BIZI9G>-G?-9.G.G96/N3<=>W ; /GVI.-.0-G 试剂 盒" MVI95: 公司#和 W_>BM M_ B>C43<=>>5) J 7-Y-36G-:/ 试剂盒 " C:/GI3V 公司#!将所提取的 B=> 反转录成 3<=> !作为 %`)B>C4 和 (`)B>C4 的模板合成 %`)B>C4 模板 3<=> 的引物为锚定 引物 >A 3<=> 第二链合成采用 @<)ACB 法进 行!双链 3<=> 用紫外分光光度法检测 ;5$5$! 8>=/?/@4A 分析 ! 3<=>)>?@A 分析参照 张凤云)#(*的方法进行将差异表达 M?.<br进行回 收(二次 ACB 后经连接(转化(验证后送上海博尚公 司测序测序后的 M?.<br核苷酸序列于 =CKT 上进 行 K76.G 比对!预测其功能!筛选出与铜胁迫相关的 基因 ;*$*B
!
基因全长的扩增及测序
!
差异表达
M功能分析发现一个与
4!
基因相关的
M片段
根据获得的
M片段设计
%`)B>C4
和
(`)B>C4
引物"表
#
#进行嵌套
ACB
扩增!第一轮
ACB
扩增
产物稀释
#"
倍作为第二轮的模板将所获得的目
的片段回收(纯化后送到上海博尚公司测序根据
测序结果利用
<=>_>=
软件将
(`)B>C4
(
%`)
B>C4
序列与
M片段拼接整合!得到
!"#!$%! 基因的 3<=> 全长序列在全长序列的 %`)LMB 和 (`)LMB 处设计特异引物 LKC)? ( LKC)B 用于克隆 !"#!$%!
基因的
RB?
!进行序列校正
;*$*C ! 生物信息学分析 ! 利用相关软件分析 K3LKC4! 表 ; ! %"1%23$
基因克隆及荧光定量
A%<
所用引物
M6E7I#
!
A9-5I9.Y:937:/-/
H
6/N
F
BM)ACB:Y!"#!$%!
引物名称
A9-5I9/65I
引物序列
A9-5I9.I
F
DI/3I
"
(`
#
%`
# 用途
J
G-:/
LKC)%#
LKC)%!
MC>>S>C>>C>>C>MC>MSCMCMSS
SSS>SM>M>MSCMMSS>C>MCC
%`)B>C4
LKC)(#
LKC)(!
SS>MSMCC>>SC>M>M>CMCCC>MC
C>S>SC>MS>MSMMSMMSMCMMS
(`)B>C4
LKC)?
LKC)B
CC>CSSMM>S>S>SS>SS>MSMCS
CC>>>C>C>>S>S>SS>SSMMC
RB?
扩增
>5
J
7-Y-3-G-:/:YRB?
LKC9G)?
LKC9G)B
63G-/)?
63G-/)B
MSCMCC>C>>S>C>>C>>C>MC
MCCS>S>>>C>>>CCS>>C>
SMCCMSMMCC>SCCMMCSMMC
C>>SMCCMMCCMS>M>MCC>CSMC
F
BM)ACB
>A SSCC>CSCSMCS>CM>M>CMMMMMMMMMMMMMMMMM
反转录
BIZI9.IG96/.39-
J
G-:/
#&
#
期
!!!!!!!!!!!!!!
赵瑞丽!等$小白菜 !"#!$%!
基因的克隆及表达分析
的氨基酸序列$用 K76.G " VGG J$%%
E76.G*/3E-*/75*
/-V*
H
:Z
%
K76.G*3
H
-
#进行同源序列搜索&用
A9:G)
A6965
"
VGG
J
$%% [IE*IJ 6. ; *:9 H % J 9:G J 6965 %#预测 基本的理化性质&用 A9:W367 " VGG J$%%
[IE*IJ
6.
;
*
:9
H
%
J
9:G.367I
%#默认算法"
Q
J
V:E*
%
0
;
GIa<::7-G)
G7I
#预测该蛋白的疏水性&用
M_Q__
"
VGG
J
$%% [[[*3E.*NGD*Nb % .I9Z-3I. % M_Q__ %#预测跨膜 结构&用 W- H /67A$*#WI9ZI9
"
VGG
J
$%% [[[*3E.* NGD*Nb % .I9Z-3I. % W- H /67A %#预测信号肽&选取部分 4! !应用 <=>_>= 进行序列比对&用 _4S>(*! 构建系统进化树 ;5$5D
!
%"1%23$基因特异性表达分析 ! 分别提取 培养 " (( #" ( #( ( !"N 的小白菜总 B=> !用 WD J I9) .39- J G M_ # ?-9.G)WG96/N3<=> W ; /GVI.-.W ; .GI5 Y:9BM)ACB 试剂盒合成第一链利用小白菜 63G-/ 为内参基因设计引物" 63G-/)? ( 63G-/)B #根据已得 到的 !"#!$%!
基因
3<=>
全长设计特异性引物
LKC9G)?
和
LKC9G)B
用
WUKBA9I5-\4\4
5
试
剂盒进行
F
BM)ACB

!
!
结果与分析
$5; ! 小白菜铜胁迫 8>=/?/@4A 分析 利用筛选出多态性较好的 #%( 对引物组合!对 铜胁迫 " (( #" ( #( ( !"N 叶片的 3<=> 进行聚丙烯 酰胺凝胶电泳分析!共筛选出 #1" 条差异表达 M?.<br!从中挑选差异较为明显的 #(! 条 M?.<br进行 二次 ACB 扩增(回收(测序!最终得到 #(# 条有效序 列将获得的 #(# 条 M?.<br进行功能分析!发现 # 个与小白菜泛素结合酶 4! 相关的 M?<br!其表达量 在铜胁迫 #"N 时最高"图 # #测序结果表明!该 M?<br长度为 %2%E J "图 ! #! K76.G 分析表明!该片段 与拟南芥泛素结合酶 4! 蛋白的一致性高达 2+c ! 推测其可能是小白菜泛素结合酶 4! 基因 3<=> 上 的一个片段$5$! %"1%23$
基因
8>=/
全长的克隆与序列分析
利用
B>C4
技术获得
!1%E
J
的
(`
序列和
$(# E J 的 %` 序列"图 % #!将 %` ( 序`列与 3<=>)>?@A 技 术获得 %2%E J 的 M?<br片段拼接后得到 1%"E J 的 泛素结合酶 4! 的 3<=> 全长"命名为 !"#!$%!
!
SI/K6/b
登录号
0?#$1"!% #该序列包含一个$(2
E
J
的开放阅读框!
#("E
J
的
(`)LMB
和
!!#E
J
的
%`)LMB
序列!
%&E
J
A:7
;
>
!推测其编码
#(!
个氨
基酸!含有起始密码子
>MS
和终止密码子
M>S
"图
$#特异引物 LKC)? ( LKC)B 克隆 RB? 测序 结果与拼接后的序列相一致$5B
!
%"1%23$基因生物信息学分析 用 A9:GA6965 软件预测! !"#!$%!
基因编码
的蛋白分子量为
#+*!1b<
!理论等电点为
(*%+
!所
带的正电荷总数"
>9
H
d@
;
.
#为
#1
!负电荷总数
"
>.
J
dS7D
#为
#&
!为酸性蛋白理论推导半衰期是
%"V
!消光系数为
!1"1(
!不稳定指数为
+!*"$!为不 稳定蛋白"参数大于$"
是不稳定蛋白#
利用
4J
6.
;
网站对蛋白质亲水性(疏水性进
行分析!结果显示疏水性氨基酸占
!&*+c
!亲水性
氨基酸占
+%*%c
!为亲水性蛋白!但不存在跨膜区
和信号肽结构域预测!
!"#!$%! 的 3<=> 推导 的氨基酸序列在第 !$)%1
部位存在一个
e<)
重复结
构第
++)2!
残基部位有一个保守结构域!包含
#(
个氨基酸"
?QA=TU>#!是
4!T
型的
酶活性中心)#&*其间第
11
部位存在一个高度保守
且具有催化活性的半胱氨酸残基
C
;
.
"
C
#!能够与泛
素形成高能硫酯键进而将泛素转移到
4%
酶或靶蛋
白上)#+)#2*多序列比对发现"图
(
#!保守结构域的
#(
个氨基酸残基和第
11
位的半胱氨酸残基与其他
真核生物
4!
对应的序列完全匹配!在进化上高度
图
#
!
铜胁迫下小白菜
!"#!$%! 基因 3<=>)>?@A 图谱 ?- H *# ! 3<=>)>?@A56 J :Y!"#!$%!-/
!6"*)+,+()(@*D/NI93:
JJ
I9.G9I..
图
!
!
铜胁迫下小白菜
!"#!$%! 基因的差异表达 M?<br序列 ?- H *! ! MVIM?.I<brF DI/3I:Y!"#!$%!-/!6"*)+,+()(@*D/NI93:
JJ
I9.G9I..
!&
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$卷 图 % ! !"#!$%!
基因
ACB
扩增结果
_*<@!"""
&
>*%`)B>C4
扩增&
K#
(
K!*(`)B>C4
扩增&
C#
"
C%*RB?
?-
H
*%
!
>5
J
7-Y-36G-:/
J
9:ND3G.:Y!"#!$%! _*<@!""" & >*>5 J 7-Y-36G-:/ J 9:ND3G.:Y%`)>C4 & K#6/NK!*>5 J 7-Y-36G-:/ J 9:ND3G.:Y(`)B>C4 & C# " C%*RB? 图$
!
!"#!$%! 基因核苷酸序列及推导氨基酸序列 方框内为起始密码子和终止密码子&单下划线部分为 e<) 重复结构&双下划线部分为 LKC 活性位点&阴影为保守的半胱氨酸 ?- H *$
!
=D37I:G-:NI.I
F
DI/3I6/NNIND3IN65-/:63-N.I
F
DI/3I:Y!"#!$%! MVI-/-G-6G:96/NGI95-/6G:93:N:/. ! >MS6/NM>S ! 69IE:\IN & MVI.-/ H 7I7-/I.-/N-36GIe<)$"9I
J
I6G.6/N
GVIN:DE7I7-/I.-/N-36GIGVI63G-ZI.-GI:YLKC
&
WV6NIN9I.-NDI-/N-36GI3:/.I9Z6G-ZI3
;
.GI-/I
图
(
!
!"#!$%! 基因推测的氨基酸序列与其他同源序列的比对 e 区为 e<) 重复结构! L 区为 LKC 活性位点! " 为保守的半胱氨酸 ?- H *( ! >7- H /5I/G:YNIND3IN65-/:63-N.I F DI/3I.EIG[II/!"#!$%!6/N
V:5:7:
H
:D.
H
I/I.Y9:5!6"*)+,+()(@*6/N.:5I:GVI9
J
76/G.
J
I3-I.
e69I6-.e<)9I
J
I6G.
!
L69I6-.LKC63G-ZI.-GI
!
"
-/N-36GI3:/.I9Z6G-ZI3
;
.GI-/I
%&
#
期
!!!!!!!!!!!!!!
赵瑞丽!等$小白菜 !"#!$%!
基因的克隆及表达分析
保守将小白菜
K3LKC4!
的编码蛋白与
SI/K6/b
中登载的
##
个物种的
4!
蛋白进行聚类分析!构建
4!
进化树!结果"图
&
#显示!小白菜
K3LKC4!
蛋白
与同为十字花科拟南芥的
4!
蛋白的亲缘关系最
近!首先聚为一支!同玉米的
4!
蛋白的亲缘关系
最远
$5C ! %"1%23$
基因在铜胁迫下的特异性表达
为研究小白菜
!"#!$%! 基因对铜胁迫的应 答!用 F BM)ACB 检测铜胁迫 " (( #" ( #( ( !"N 的根( 茎(叶片中 !"#!$%!
基因的表达"图
+
#!结果显示
该基因在根(茎(叶中均有表达!但其表达丰度不同!
图
&
!
小白菜
K3LKC4!
与其他物种泛素
结合酶
4!
氨基酸序列系统进化分析
分支点数字表示
K::G.G96
J
验证中基于
#"""
次重复该节点可信度
?-
H
*&
!
AV
;
7:
H
I/IG-3G9II:Y65-/:63-N.I
F
DI/3I.:Y
K3LKC4![-GV4!Y9:5!6"*)+,+()(@*6/N:GVI9.
J
I3-I.
MVI/D5EI96GGVI/:NI.9I
J
9I.I/G.GVI9I7-6E-7-G
;
J
I93I/G:YE::G.G96
J
.Z67DI.E6.IN:/#"""9I
J
7-36G-:/.
图
+
!
铜胁迫下
!"#!$%! 在根(茎(叶中的相对表达 ?- H *+ ! 4J 9I..-:/6/67 ; .-.:Y!"#!$%!-/9::G
!
.GI56/N7I6YD/NI93:
JJ
I9.G9I..
在根中的表达量最高!其次是茎!说明该基因没有组
织特异性在铜胁迫下!该基因被诱导而上调表达!
处理
#"N
时
!"#!$%! 基因的表达量最高! #"N 后 其表达量降低!但仍高于对照 "处理 "N # % ! 讨 ! 论 泛素结合酶 4! 是一个多基因家族!拟南芥基 因组中有 %+ 个 4! 基因!根据结构和功能可将 4! 基因分为$
大亚类$C76..$
只含有
LKC
结构域!在
许多短命蛋白和异常蛋白的泛素依赖性降解中起重
要作用&
C76..
%
包含有一个
C
端延长的蛋白序列!
能够参与靶蛋白识别(与
4%
酶互作(参与
=)
末端规
则"
=)I/N9D7I
#依赖性蛋白水解途径&
C76..
&
包含
一个在
=
端延长的蛋白序列&
C76..

同时包含有
=
端和
C
端延长的蛋白序列)!"*小白菜
K3LKC4!
与其它物种的
4!
具有极高的相似性!结构域分析
发现该基因含一个
LKC
催化结构域和一个高度保
守的半胱氨酸残基!但不含
C)
末端延伸结构和
=)
末
端延伸结构因此小白菜
!"#!$%! 基因属于小白 菜$
类
4!

泛素结合酶
4!
可与苯丙氨酸解氨酶等防御反
应基因启动子上特定的顺式作用元件结合!实现对
植物防御反应的调节)!#*本研究结果显示!小白菜
!"#!$%! 基因在根(茎(叶中均有表达!在铜胁迫 下该基因被诱导而上调表达!且胁迫 #"N 时表达量 最高! #"N 后表达量降低!这与 SI/.3V-b 等)!!*的研 究结果相似 SI/.3V-b 等用 "*#c Q H C7 ! 处理野 生烟草原生质体发现处理 &V 时泛素 ) 蛋白酶体途 径的 % 种基因表达量达到最大值 4! 基因存在着 种类和功能多样性!在逆境作用下 4! 基因表现出 下调或上调等不同的表达方式)!#* ?ID../I9 等)!%* 研究发现番茄 7,#!$#
基因受热激和重金属诱导
表达增强!拟南芥
-2#!$! 基因对紫外光胁迫和植 物激活因子表现出较强的抗性)!$)!(*这些结果说明
4!
基因可能通过参与不正常蛋白的降解过程!从而
提高植物的抗逆性本研究表明在胁迫发生时!
!"#!$%! 在小白菜根(茎(叶中均能响应铜胁迫! 但其对铜胁迫的响应机制尚不清楚!有待进一步 研究 参考文献! ) # * ! ><>_WX*MVI J 9:GI6.:5I$
.G9D3GD9I
!
YD/3G-:/
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6/N9:7I-/GVI3I7
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