全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2012, 38(5): 808−813 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家自然科学基金项目(31160067, 31000746), 国家公益性行业科研专项(201003021), 云南省重点应用基础研究项目(2008C004)
和云南省自然科学基金项目(2010CD098)资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 程在全, E-mail: czquan-99@163.com, Tel: 13888556318, 0871-5140200
第一作者联系方式: E-mail: linmiaomiaocat@yahoo.com.cn
Received(收稿日期): 2011-10-19; Accepted(接受日期): 2012-01-19; Published online(网络出版日期): 2012-03-05.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20120305.1041.019.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2012.00808
疣粒野生稻泛素结合酶基因的全长 cDNA序列克隆与分析
蒋春苗 1,2 黄兴奇 1 付 坚 1 余腾琼 1 钟巧芳 1 李定琴 1 殷富有 1
张敦宇 1 王玲仙 1 程在全 1,*
1 云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所, 云南昆明 650223; 2 云南大学生命科学学院, 云南昆明 650091
摘 要: 从已构建的疣粒野生稻消减 cDNA 文库中随机挑取阳性单克隆经测序得到 ESTs, 通过生物信息学分析, 选
取与泛素结合酶具有同源功能的 EST 以 RACE 技术分离克隆到 1 个疣粒野生稻泛素结合酶基因的全长 cDNA 序列,
命名为 OmE2 (Oryza meyeriana Baill. ubiquitin-conjugating enzyme), 该序列长 917 bp, 最大开放阅读框为 528 bp, 编
码的蛋白具有 175个氨基酸, 该蛋白的分子量为 19.31 kD, 理论等电点为 9.32。OmE2蛋白与其他物种的泛素结合酶
具有高度的一致性和相似性, 含有泛素结合酶活性位点的保守序列及半胱氨酸残基, 且具有 3 个跨膜结构域, 推测
OmE2是一类泛素结合蛋白兼跨膜蛋白。经 RT-PCR分析, OmE2基因是受白叶枯病病原菌胁迫诱导表达。这是首次
从野生稻中发现可能参与疣粒野生稻胁迫信号传导和抗病应答反应的基因。
关键词: 疣粒野生稻; 泛素结合酶; 序列分析
Cloning and Analysis on Full-Length Cdna Sequence of Ubiquitin-Conjugating
Enzyme Gene from Oryza meyeriana Baill.
JIANG Chun-Miao1,2, HUANG Xing-Qi1, FU Jian1, YU Teng-Qiong1, ZHONG Qiao-Fang1, LI Ding-Qin1,
YIN Fu-You1, ZHANG Dun-Yu1, WANG Ling-Xian1, and CHENG Zai-Quan1,*
1 Biotechnology & Genetic Germplasm Institute, Yunnan Academy of Agricultural Sciences, Kunming 650223, China; 2 College of Life Science, Yun-
nan University, Kunming 650091, China
Abstract: Based on the bioinformatic analysis of the ESTs from the subtraction cDNA library of Oryza meyeriana, we cloned one
of the ESTs which has the homolog function of ubiquitin-conjugating enzyme and obtained a full-length cDNA sequence of ubiq-
uitin-conjugating enzyme gene by RACE, and named it OmE2 (Oryza meyeriana Baill ubiquitin-conjugating enzyme). This
full-length cDNA sequence has 917 bp including 528 bp open reading frame encoding a protein of 175 amino acids, with a pre-
dicted molecular mass of 19.3 kD and pI of 9.32. OmE2 protein, which had significant amino sequence identity and similarity
with ubiquitin-conjugating enzyme from other species contained the conserved sequence and cysteine residue in the active sites of
ubiquitin-conjugating family. OmE2 had three trans-membrane domains. It is predicted that OmE2 protein is a kind of ubiq-
uitin-conjugating protein and transmembrane protein. The expression of OmE2 in Oryza meyeriana was induced by Xanthomonas
campestris pv. oryzae. Therefore OmE2 gene which was first found in wild rice may participate in the signal transduction and the
resistance response in Oryza meyeriana.
Keywords: Oryza meyeriana Baill.; Ubiquitin-conjugating enzyme; Sequence analysis
泛素-蛋白酶体途径在维持细胞功能及细胞周
期运转、抵御环境胁迫、激素响应和衰老等方面发
挥着重要的作用[1-4]。泛素分子主要同泛素活化酶、
泛素结合酶、泛素-蛋白连接酶及靶蛋白结合形成一
条多泛素链, 将底物蛋白泛素化后被 26S 蛋白酶所
识别和降解[5]。其中泛素结合酶是泛素-蛋白酶体途
径的重要组成部分, 对泛素化修饰的特异性和精确
时空性起关键作用[6]。目前对植物泛素结合酶功能
第 5期 蒋春苗等: 疣粒野生稻泛素结合酶基因的全长 cDNA序列克隆与分析 809


的研究主要涉及 DNA修复、生长发育和抗逆境胁迫
响应等方面, 如在植物生长发育的所有过程中, 泛
素结合酶蛋白参与调控光形态建成、维管发育等方
面[3,7], 缺素如缺磷环境[8]、干旱、重金属、高温、
盐碱等[9-10]非生物胁迫因素均能诱导植物泛素结合
酶基因的表达, 从而提高植物对不良环境的适应能
力, 但迄今关于泛素结合酶与植物抗病反应过程的
研究报道甚少。目前已在番茄[9]、柽柳[10]、玉米[11]、
条斑紫菜[12]、小麦[13]等多种植物中克隆了该泛素结
合酶的 cDNA 序列, 然而尚无疣粒野生稻泛素结合
酶全长 cDNA 序列克隆的相关报道, 因此从受到白
叶枯病病原菌胁迫的疣粒野生稻中克隆泛素结合酶
基因, 并研究其与抗病性的关系具有重要的意义。
野生稻是重要的遗传资源, 由于长期处于野生
状态, 使其具有不同程度的抗性和耐不良环境等优
良特性, 这些特性是栽培稻遗传改良的重要物质基
础。云南具有丰富的疣粒野生稻遗传资源, 研究发
现云南疣粒野生稻具有高抗或免疫白叶枯病、抗细
菌性条斑病和褐飞虱、抗稻瘟病及耐荫、耐干旱等
重要的遗传生理生态特性。本研究通过从已构建的
云南疣粒野生稻抑制差减 cDNA 文库的随机测序,
选取具有泛素结合酶同源功能的 EST, 通过 RACE
法获得疣粒野生稻泛素结合酶的全长 cDNA 序列,
并进行序列分析和功能预测, 为研究疣粒野生稻泛
素结合酶基因的功能和揭示其抗病性奠定基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
以白叶枯病病原菌 Y8 (云南典型致病病株)接
种景洪疣粒野生稻, 无菌水接种对照叶片, 其后每
隔 24、48、72、96和 120 h分别收集接菌处理和对
照的叶片, −70℃保存备用。
1.2 试验方法
1.2.1 cDNA 第一链的合成 用 TIANGEN
TRIZOL 试剂盒提取疣粒野生稻叶片总 RNA, 用北
京天根生物公司的 TIANScript cDNA第一链合成试
剂盒合成 cDNA第一链。
1.2.2 OmE2 全长 cDNA 序列的克隆 从已构建
好的疣粒野生稻抑制性差减 cDNA 文库中随机挑选
288 个阳性克隆测序, 在 NCBI 中经 BLAST 比对分
析序列, 根据序列比对分析结果[14], 挑取了一个可
能与泛素结合酶基因具有同源性的 EST 进行全长
cDNA序列的克隆。根据选取的 EST分别设计引物,
扩增RT-PCR引物, 上游为 5-GGTCCGTCAACAGG
GAACAA-3, 下游为 5-CGATCTACGTCGATGGCG
TC-3; 扩增 3和 5末端序列的引物为 5-CTCTTTCA
AAATGTCAAGGCAG-3, 扩增 5末端引物 Neasted1
为 5-CATTCATTTCCCTCCTGATTAT-3, Neasted2
为 5-TGGAAGTATCTGCCTTGACATTTTG-3。通过
RACE 技术分别克隆 cDNA 3末端和 5末端未知序
列, 然后通过 DNAMAN 软件将克隆得到的 3、5
末端序列与已知部分 cDNA序列拼接得到 OmE2的
全长 cDNA序列。
1.2.3 OmE2 基因序列的分析 用 NCBI 的 ORF
Finder软件寻找此基因的开放阅读框; 用 ProtParam
(http://web.expasy.org/protparam/)对泛素基因所推导
出的氨基酸序列进行物理性质分析 ; PSORT 软件
(http://psort.hgc.jp/form2.html)完成亚细胞定位预测;
用 TMHMM (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-
2.0/)预测蛋白质跨膜区结构; 用 BlastP (http://blast.
ncbi.nlm.nih.gov/Blast)进行氨基酸同源性搜索 ,
DNAMAN 作氨基酸同源比较 ; ScanProsite 和
SMART (http://smart.embl-heidelberg.de/)程序对基
因进行蛋白家族预测 , 确定该基因所属蛋白家族 ;
用 DNAMAN作进化树分析。
2 结果与分析
2.1 RT-PCR扩增
以每隔 24、48、72、96和 120 h分别收集接菌
处理后的和对照的疣粒野生稻叶片提取总 RNA, 反
转录得到的 cDNA 为模板进行 RT-PCR 扩增(图 1),
由图 1 可知, 在对照中即没有接菌的疣粒野生稻叶
片中没有检测到 OmE2 的表达, 而在接种白叶枯病
的 5个时间段内均检测到了OmE2的表达, 且OmE2
电泳条带与 β-actin基因条带的光密度比值随时间而
逐步加强(0、0.256、0.281、0.311、0.400和 0.504),
表明 OmE2 是疣粒野生稻中受到白叶枯病病原菌胁
迫诱导而表达的一类基因, 且其表达量随接菌处理
后时间而逐步加强, 因此分离该基因的全长 cDNA
序列具有重要的意义。

图 1 OmE2基因的 RT-PCR扩增
Fig. 1 RT-PCR amplification of OmE2 gene
810 作 物 学 报 第 38卷

2.2 OmE2全长 cDNA序列的克隆和分析
2.2.1 OmE2 3端和 5端未知序列的 RACE扩增
根据已知的 EST序列设计引物分别扩增 3端和
5端, PCR产物用 1%琼脂糖凝胶电泳, 3端扩增出约
400 bp的条带(图 2-A), 5端扩增产物约 500 bp (图
2-B)。将扩增的 PCR 产物分别回收后与 T-vector连
接, 转化大肠杆菌感受态细胞, 筛选重组子进行测
序, 序列分析结果表明, 3端克隆到的片段为 377 bp,
5端为 549 bp。

图 2 OmE2基因 RACE PCR扩增电泳图
Fig. 2 Electrophoretogram of RACE amplification
A: 3′RACE PCR扩增; B: 5′RACE PCR扩增。
A: 3’RACE PCR of OmE2 gene; B: 5’RACE PCR of OmE2 gene.
M: marker 2000; 1, 2: PCR product.

2.2.2 OmE2全长 cDNA的拼接及生物信息学分析
用 DNAMAN 软件将通过 RACE 法得到的 3、
5端序列及已知部分序列拼接得到疣粒野生稻泛素
结合酶全长 cDNA 序列(图 3), 序列长度为 917 bp,
包括一个 528 bp的开放阅读框, 240 bp的 5非编码
区, 149 bp 的 3非编码区, 预测编码的蛋白质具有
174个氨基酸。OmE2编码的蛋白分子量为 19.31 kD,
理论等电点 pI为 9.32。TMHMM对 OmE2进行蛋白
结构预测, 发现 3个跨膜区的存在, 推测OmE2编码
的蛋白为跨膜类蛋白。
2.3 OmE2同源性比较及蛋白家族预测
在 NCBI 中对 OmE2 蛋白进行 Blastp 分析, 结
果发现铁线蕨、拟南芥、甜菜、辣椒、陆地棉、大
颖野生稻、籼稻、粳稻、蓖麻、江南卷柏、番茄、
龙葵和小麦等多种物种的泛素结合蛋白与该蛋白序
列具有极高的相似性。将上述生物的泛素结合蛋白
与 OmE2进行多序列比对(图 4), OmE2蛋白与蓖麻、
江南卷柏的序列一致性为 100%, 与拟南芥、辣椒、
番茄、龙葵、陆地棉的一致性为 98%, 与大颖野生
稻、籼稻、粳稻序列的一致性为 95%。OmE2 与其
他物种的泛素结合蛋白在蛋白质水平上表现较高的
相似性, 说明泛素结合酶基因家族具有高度的保守
性。同时结合 ScanProsite和 SMART对 OmE2蛋白
保守结构域的分析结果(图 5)显示, 该蛋白 4~139位
属于泛素结合酶家族。第 74~89 位为泛素结合酶活
性位点 , 并具有 [FYWLSP]-H-[PC]–[NHL]–[LIV]–
(3,4)-G–X–[LIVP]–C–[LIV]–X(1,2)-[LIVR]保守序列 ,
其中活性位点中的半胱氨酸位于 85位(图 4), 其功能
是与泛素形成高能硫酯键进而参与将泛素转移到
泛素蛋白-连接酶或靶蛋白上的反应。酶活性位点的
15个氨基酸残基与 85位的半胱氨酸残基与其他物种
的泛素结合酶对应的序列完全匹配, 因此可以说明
获得的 OmE2属于泛素结合蛋白家族。

图 3 OmE2全长 cDNA序列分析
Fig. 3 Full-length cDNA analysis of OmE2
加框的 ATG和 TAA分别为启动子和终止子。
ATG and TAA with frames are promoter and terminator, respectively.

2.4 OmE2氨基酸系统发育树分析
为进一步研究泛素结合酶的进化关系 , 选用
NCBI中已登录的 13个植物物种的泛素结合蛋白作
系统发育树分析(图 6)。龙葵、籼稻、粳稻、小麦、
卷柏、铁线蕨、番茄、拟南芥、辣椒、蓖麻、陆地
棉等物种的泛素结合蛋白在进化树中聚为一类, 说
明泛素结合蛋白在这些物种的进化过程中相当保守;
OmE2 与这些物种存在多个氨基酸序列不同而在进
化树中独分一支, 推测 OmE2与龙葵、籼稻、粳稻、
小麦、卷柏、铁线蕨、番茄、拟南芥、辣椒、蓖麻、
陆地棉等物种可能是由不同的分子进化途径产生的。
第 5期 蒋春苗等: 疣粒野生稻泛素结合酶基因的全长 cDNA序列克隆与分析 811



图 4 OmE2蛋白的多序列比对
Fig. 4 Multiple alignment of OmE2 protein
加方框的 74~89位为保守序列; 椭圆框为 85位活性位点的半胱氨酸。
The amino acids between 74 and 89 with box are conserved sequence; the 85th amino acid with ellipse is cysteine of active-site.

图 5 OmE2蛋白功能域预测
Fig. 5 Domains prediction of OmE2 protein


图 6 OmE2氨基酸与其他物种的系统发育树分析
Fig. 6 Phylogenetic analysis of OmE2 and other species
3 讨论
植物基因组编码 37个泛素结合蛋白酶基因和 8
个 E2-like基因, 部分决定着蛋白泛素化的效率和特
异性[15]。泛素结合蛋白酶包含有一个 150 个氨基酸
组成的保守催化结构域, 内含一个高度保守的半胱
氨酸(cysteine)保守位点; E2-like 蛋白则只包含一个
UBC 结构域, 而缺少催化位点半胱氨酸, 因此没有
泛素结合蛋白酶的活性。本研究克隆到的 OmE2 编
码的蛋白与其他物种的泛素结合酶具有高度的一致
性和相似性, 其酶活性位点的 15个氨基酸残基与 85
位的半胱氨酸残基与其他物种的泛素结合酶对应的
序列完成匹配, 且具有半胱氨酸催化位点, 具有泛
素结合酶的活性, 因此 OmE2 属于泛素结合蛋白酶
基因而非 E2-like基因。本研究克隆到的 OmE2蛋白
具有 3 个跨膜结构区域, 推测为泛素结合蛋白兼跨膜
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蛋白。跨膜蛋白处于细胞与外界的交界部位, 介导细
胞与外界之间的信号传导, 参与细胞膜内外物质交
换、能量与信号传递、构成各种信号分子、激素和
底物的受体等[16], 推测含有跨膜结构的 OmE2 蛋白
在抗病进程中也具备跨膜蛋白的这些功能, 在疣粒
野生稻抗白叶枯病过程中可能参与病原菌胁迫信号
的传导。泛素结合蛋白在植物抗逆胁迫反应中具有
重要的作用, 首次从番茄 cDNA 文库分离的植物泛
素结合蛋白基因受热激和重金属诱导且表达增强[7],
通过赤霉素的胁迫, 可以诱导水稻种子中泛素结合
酶基因的表达[17], 说明在胁迫发生时泛素结合蛋白
可能参与了不正常蛋白的降解过程。迄今分析泛素
结合酶与植物抗病性的研究报道甚少, 本研究发现
OmE2 基因在疣粒野生稻中受白叶枯病病原菌胁迫
诱导而表达, 且其表达量在接菌的 120 h 内随着时
间变化而逐步增强, 表明 OmE2 基因可能参与了疣
粒野生稻抗白叶枯病应答过程。同时系统进化树分
析发现, OmE2基因与其他物种有多个氨基酸序列不
同而在进化树中独分一支, 推测 OmE2 蛋白除了参
与抗逆胁迫响应, 可能在疣粒野生稻中还参与了抗
病反应过程, 因此 OmE2 蛋白的功能研究对疣粒野
生稻中与抗病相关的基因及抗病机制的认识具有重
要意义。
目前植物泛素结合酶成为一个研究热点, 但对
大多数植物的泛素结合酶蛋白功能的研究还处于起
步阶段, 且以与抗逆胁迫响应之间的关系报道较多,
而与植物抗病应答的报道甚少, 所以从不同植物的
不同发育时期、不同环境条件下克隆泛素结合酶基
因, 对进一步研究植物体的这一类基因的功能就显
得极为必要。OmE2的克隆, 不仅丰富了泛素结合蛋
白家族的基因信息, 同时为进一步研究疣粒野生稻
泛素结合酶蛋白的功能与抗病特性之间的关系以及
培育优良栽培稻奠定了基础。
4 结论
克隆了疣粒野生稻泛素结合酶基因, 它具有泛
素结合蛋白共有的一些特征, 具有泛素结合酶保守
序列 [FYWLSP]-H-[PC]–[NHL]–[LIV]–X(3,4)-G–X
[LIVP]–C–[LIV]–X(1,2)-[LIVR]和半胱氨酸催化位
点, 同时存在 3个跨膜结构域, 推测OmE2蛋白为泛
素结合蛋白兼跨膜类蛋白; 证明了 OmE2 基因在疣
粒野生稻叶片中受白叶枯病病原菌胁迫而诱导表达,
属于诱导型表达基因, 推测 OmE2 基因参与了疣粒
野生稻抗白叶枯病抗病应答过程。
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