全 文 ：第 33卷第 5期
2009年 9月 　　　　　　　　　　
水　产　学　报
JOURNALOFFISHERIESOFCHINA　　　　　　　　　　　　
Vol.33, No.5　
Sep., 2009　
文章编号:1000 -0615(2009)05 -0719 -08
收稿日期:2008-10-31　　　修回日期:2009-03-10
资助项目:国家科技支撑计划(2007BAD29B03);江苏省海洋生物技术重点实验室开放课题(2008HS004)
通讯作者:刘楚吾 , E-mail:liucw@gdou.edu.cn
条斑紫菜泛素结合酶基因的 cDNA序列克隆与分析
易乐飞 1 , 　刘楚吾 2 , 　王　萍 1 , 　周向红 1
(1.淮海工学院江苏省海洋生物技术重点实验室 ,江苏 连云港　222005;
2.广东海洋大学水产学院 , 广东 湛江　524088)
摘要:泛素 蛋白酶体系统(ubiquitin-proteasomessystem, UPS)是真核生物重要的翻译后修饰
系统 ,参与了许多重要的生理反应 ,同时也参与了蛋白质的质量控制和细胞的稳态维持 ,因此
研究条斑紫菜 UPS有助于阐明条斑紫菜在逆境胁迫下通过 UPS降解异常蛋白和调节蛋白的
生物学活性 。泛素结合酶(ubiquitin-conjugatingenzyme, E2)是 UPS的重要组成部分 。根据电
子克隆结果指导 RT-PCR实验 ,成功克隆了条斑紫菜泛素结合酶基因(PyE2)的 cDNA序列
(GenBankaccession:FJ232910)。该 cDNA序列含有长 444 nt的完整 ORF,编码蛋白(PyE2)
的分子量 16.6 ku,长 147 AA。 PyE2与其它物种的 E2具有高度的一致性和相似性 ,反映出
E2在进化上相当保守。 PyE2含有 E2活性位点的保守序列及半胱氨酸残基 ,其三维结构与人
的 I类 E2高度一致。 PyE2不含 C端和 N端延伸结构 ,所以在条斑紫菜 E2家族中属于 I类
E2。
关键词:条斑紫菜;泛素结合酶;克隆;生物信息学
中图分类号:S917;Q559+.2;Q785　　　　　　　文献标识码:A
　　大量研究表明泛素 蛋白酶体系统
(ubiquitin-proteasomessystem, UPS)是真核细胞
内十分重要的细胞功能调控系统 ,可以精确地选
择性降解蛋白质;UPS能够快速 、及时 、单向地催
化多种生物学过程 ,包括细胞周期 、DNA修复 、细
胞死亡(如凋亡)、信号传导 、转录 、新陈代谢 、免
疫 、胁 迫 响 应 、蛋 白 质 稳 态 等 [ 1-5] 。 泛 素
(ubiquitin)需经过一系列的酶反应才能与靶蛋白
共价结合。首先 ,泛素激活酶(ubiquitin-activating
enzyme, UBA或 E1)以 ATP依赖性方式激活泛
素 ,在泛素和 E1之间形成高能硫酯键;然后 ,激
活的泛素从 E1转移到泛素结合酶 (ubiquitin-
conjugatingenzyme, UBC或 E2)上 ,在泛素和 E2
之间也形成类似的高能硫酯连接;最后 , E2可直
接 , 也可在泛素蛋白连接酶 (ubiquitin-protein
ligase, E3)参与下 ,将泛素的 C-末端甘氨酸残基
与靶蛋白的赖氨酸残基的 ε-氨基基团共价连接;
重复上述反应 ,在已结合到靶蛋白的泛素上继续
催化 ,并形成多泛素链(polyubiquitinchain)。大
部分被多泛素链标记的靶蛋白随后被 26S蛋白酶
体(proteasome)降解 [ 6 -7] 。其中 , E2是 UPS的重
要组成部分 ,对泛素化修饰的特异性和精确时空
性起关键作用[ 2] 。目前已在多种生物中克隆了
该酶的 cDNA序列 ,例如在 GenBank中登录的酵
母(Saccharomycescerevisiae)E2有 13种 ,拟南芥
(Arabidopsisthaliana)有 17种 。然而目前尚无条
斑紫菜(PorphyrayezoensisUeda)的相关报道。
条斑紫菜是我国重要的海水养殖种类之一 ,
随着养殖规模逐步扩大 ,条斑紫菜养殖面临着环
境恶化和病害频发的局面 ,暴露出条斑紫菜基础
研究相对薄弱的问题 。 2004年 5月召开的 “海洋
生物基因资源的研究与利用 ”科学会议 [ 8] 指出 ,
为了解决水产养殖的 “质 ”、“量”和 “病 ”的问题 ,
必须对功能基因进行深入研究 。因此本文利用生
物信息学技术指导实验 ,克隆了条斑紫菜泛素结
合酶基因(PyE2)的 cDNA序列 ,并对其序列进行
了分析;有助于进一步研究条斑紫菜在高温 、干
出 、重金属 、环境污染等逆境下通过 UPS降解异
常蛋白和调节蛋白的生物学活性;本文的技术路
线也可为条斑紫菜功能基因的快速克隆以及进一
步开发 、利用条斑紫菜资源奠定基础 。
1　材料与方法
1.1　电子克隆
以拟南芥 E2 的氨基酸序 列 (GenBank
accesion:AAM63316)作为 查询序 列 , 使 用
tBlastn程序[ 9]检索 GenBank中条斑紫菜表达序
列标签 (expressedsequencetag, EST)数据库
(dbEST)。将检索到的相似性高且含有 E2保守
序列的 EST序列作为种子序列 ,接着用 Blastn程
序 [ 9]去检索条斑紫菜 dbEST,将检索到的 EST序
列用 CAP3程序 [ 10]组装和延伸 。重复检索 、延伸
步骤直到不能延伸为止 ,最后得到 PyE2 cDNA的
叠连群(contig)。
1.2　实验克隆
　　实验材料和主要试剂　　条斑紫菜叶状体采
集于 连 云港 近 海 海 域。 TRIzol试 剂 购 于
Invitrogen,反转录试剂盒购于 MBIFermentas,
TaqPlusI(Taq+Pfu)购于 BioBasicInc.,引物
由上海生工合成 。
　　条斑紫菜叶状体总 RNA分离　　条斑紫菜
叶状体总 RNA抽提参考 TRIzol试剂说明书 ,稍
作改动 。在氯仿抽提之前增加一次离心;将异丙
醇沉淀改为 1∶1(v/v)的异丙醇和高盐溶液(含
1.2 mol/L氯化钠和 0.8 mol/L柠檬酸钠)沉淀。
电泳检测 RNA的完整性 ,核酸蛋白定量检测仪
检测 RNA的含量和纯度。
　　引物设计　　根据电子克隆得到的 contig序
列设计下列引物:上游引物 5′-CTCTGCCGCTGG
AGTATCGT-3′, 下游引物 5′-CTCACAAGAGCA
GCACCAGTA-3′。预计扩增片段长 553 bp,且包
含 PyE2的完整开放阅读框(openreadingframe,
ORF)。
　　RT-PCR反应与测序　　取 2 μg总 RNA,以
Oligo(dT)为引物 ,用 MBI的第一链 cDNA合成
试剂盒 ,按说明书的反应条件合成单链 cDNA。
PCR反应体系为 50 μL,其中含 5 μL10 ×PCR反
应缓冲液 , 2 mmol/LMgCl2 , 200 μmol/LdNTP,
上下游引物各 0.5 μmol/L, 3 UTaqPlusI, 1 μL
RT产物为模板 。反应条件为 95 ℃预变性 3 min,
然后 30个循环 ,每个循环 95 ℃变性 30 s, 55 ℃退
火 30 s, 72 ℃延伸 40 s, 最后 72 ℃充分延伸 5
min,反应后取 1 μL电泳 。将 PCR产物送上海生
工进行正反双向测序 ,获得 PyE2的 cDNA序列。
1.3　生物信息学分析
分析测序结果 , 推导 ORF及编码蛋白
(PyE2)的氨基酸序列 , 利用 ProtParam[ 11] 进行
PyE2的各种基本理化特性分析 ,以 PyE2为探针
对 GenBank中的非冗余的蛋白质数据库进行
BlastP[ 9]分析 ,使用 ClustalW程序 [ 12]进行多序列
比对 ,使用 ScanProsite[ 13]和 CDD[ 14]进行功能结
构域分析 ,使用 Swiss-model[ 15]和 BioDesigner[ 16]
进行三维结构预测与三维结构比对 ,进而判断该
蛋白是否为新序列 ,并推导蛋白质功能。
2　结果
2.1　PyE2的电子克隆
用 AAM63316对条斑紫菜的 dbEST进行
tBlastN分析 ,选出高度相似并且含有 E2保守序
列的一条条斑紫菜 EST。再以该 EST序列为种
子序列检索条斑紫菜 dbEST,收集符合聚类条件
的 EST(聚类条件是 2条 EST序列的重叠区超过
40 nt,且该区域的碱基一致性大于 94%[ 17] ),然
后将这些 EST拼接 。重新检索 、拼接 ,直至获得
的序列长度不能用此法继续延伸为止 ,最后共获
得 了 7 条 EST序 列 (GenBank accession:
AV438053、 AU188725、 AV436414、 AV438411、
AU192883、AV435890、AV438115), 拼接出一条
长 641 bp的 contig。
2.2　条斑紫菜叶状体总 RNA的提取
取 TRIzol试剂提取的条斑紫菜叶状体总
RNA2 μL在 70 ℃水浴中温浴 1 h后与 -20 ℃
保存的 RNA一起电泳检测 ,电泳图(图 1)显示了
清晰的 25S和 18S两条 rRNA条带 ,经温浴处理
后的 RNA与未处理并无明显差异 ,说明 RNA样
品中没有残留的 RNase污染。核酸蛋白定量检
测仪测量结果显示 , RNA样品的 A260 /A230 =
2.113、A260 /A280 =2.134,浓度为 1 020.8 ng/μL。
上述检测结果表明总 RNA质量良好 ,适于进行
后续反应。
720 水　产　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　33卷
图 1　条斑紫菜叶状体总 RNA的电泳
1:电泳前 -20℃保存的总RNA;2:电泳前 70 ℃温浴 1h的总
RNA
Fig.1　Ge1 electrophoresisoftotalRNAextracted
from Porphyrayezoensis
1:TotalRNAstoredat-20 ℃ beforeelectrophoresis;2:Total
RNAincubatedat70℃ for1 hbeforeelectrophoresis
2.3　RT-PCR与测序结果
PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分析呈现出一
条长约 550 bp的特异性条带(图 2),与预期设计
的 553bp的扩增片段相符。双向测序获得了 PyE2
cDNA序 列 (GenBankaccession:FJ232910)。
PyE2 cDNA序列与电子克隆所得 contig序列比
图 2　PyE2的 PCR扩增产物电泳
1:PyE2的 PCR扩增产物 ,扩增产物大小约 550 bp;M:DNA
MarkerE
Fig.2　Ge1 electrophoresisofPCRproduct
1:PCRproductofPyE2.Theproductwasabout550 bp;M:
DNAMarkerE
对结果表明两者的差异碱基仅 2个 , 一致性达
99.62%。PyE2 cDNA序列编码一个含 147 AA
的蛋白质序列 ,与电子克隆的相应蛋白质序列的
比对结果显示差异残基仅 1 个 , 一致性达
99.32%。如果将个体间多态性和 EST固有的错
误率等因素考虑进去 ,测序所得序列与电子克隆
所得对应序列是一致的。
2.4　PyE2 cDNA序列的生物信息学分析
ORFFinder程序在 PyE2 cDNA序列的第 78 ～
521 nt处发现有一连续 ORF,第 78 ～ 80 nt处是该
cDNA序列的第一个 ATG密码子 ,其下游的 +4
位是 G,上游 -3位是 A,符合 kozak规则 ,且同一
读码框上游存在终止密码子 ,再结合推导的氨基
酸序列 N端同源性比较结果 ,可以认定第一个
ATG是该基因的起始密码子 [ 18] 。因此本文克隆
得到的 cDNA序列含有完整的 ORF,编码一个长
147 AA的蛋白序列。
ProtParam对 PyE2的分析表明:分子量大小
为 16.6 ku, 其碱性氨基酸(K、R)、酸性氨基酸
(D、E)、疏水性氨基酸(A、I、L、F、W、V)和极性
氨基酸(N、C、Q、S、T、Y)含量分别为 15、16、44
和 44个 ,等电点为 pH6.3。
以 PyE2为探针对 GenBank中的非冗余蛋白
质数据库进行 Blastp分析 ,结果发现日本凋毛藻
(Grifithsiajaponica)、水稻 (Oryzasativa)、拟南
芥 、酿酒酵母 、斑马鱼 (Daniorerio)、小鼠 (Mus
musculus)等多种动植物和微生物的 E2与该蛋白
序列具有极高的相似性(similarity),但在条斑紫
菜的蛋白质数据库没有找到与之高度相似的序
列 。
将上述生物的 E2与 PyE2进行多序列比对 ,
结果(图 3)表明在进化上 PyE2与同属红藻的日
本凋毛藻的 E2距离最近 。PyE2与日本凋毛藻 、
水稻 、拟南芥 、酿酒酵母菌 、斑马鱼和小鼠的序列
一致性 (identity)分别为 91%、77%、 76%、 76%、
82%和 79%;若考虑功能相似氨基酸之间的保守替
换(A=G=P=S=T、H=R、F=W=Y和 I=L=
M=V),那么 PyE2与它们的序列相似性分别为
96%、92%、91%、93%、90%和 89%。 PyE2与其
它物种的 E2在蛋白质水平上表现较高的相似
性 ,说明 E2基因家族在动植物和微生物中具有
高度的保守性。
7215期　　　　　　　　　　易乐飞 , 等:条斑紫菜泛素结合酶基因的 cDNA序列克隆与分析
图 3　E2的多序列比对
来自条斑紫菜 、日本凋毛藻 、水稻 、拟南芥 、酿酒酵母 、斑马鱼和小鼠的 E2用 ClustalW构建了多序列比对
Fig.3　MultiplealignmentofE2
ThealignmentofE2 wasperformedwiththeClustalW method.ThesourceorganismsforE2 sequenceswereasfollows:P.yezoensis, G.
japonica, O.sativa, A.thaliana, S.cerevisiae, D.rerioandM.musculus
　　ScanProsite和 CDD对 PyE2保守结构域的分
析结果(图 4)显示 PyE2第 4 ～ 136位属于泛素结
合酶家族 ,第 74 ～ 89位为泛素结合酶活性位点并
具有下列保守序列 [ FYWLSP] - H -[ PC] -
[ NHL] -[ LIV] -x(3, 4)-G-x-[ LIVP] -C-
[ LIV] -x(1, 2)-[ LIVR] ,其中活性位点中的半
胱氨酸位于第 85位 ,其功能是与泛素形成高能硫
酯键进而参与将泛素转移到 E3酶或靶蛋白上的
反应。酶活性位点的 15个氨基酸残基和第 85位
的半胱氨酸残基与其他物种的 E2对应序列完全
匹配。
图 4　PyE2的功能结构域
Fig.4　FunitionaldomainspredictionofPyE2
　　三维结构(图 5)显示 , PyE2仅包含一个功能
结构域 ,该结构域由 1个 4链反平行 β片层 、4个
α螺旋和一个短的 310螺旋组成。 β片层和 α2
螺旋构成中心区 , α1螺旋和 α2 /α3螺旋位于两
侧 。活性位点上的半胱氨酸残基处在连接 β 4和
α2的长环上 ,位于蛋白质的浅表凹陷中。与人
(Homosapiens)的 I类 E2[ 19]相比 ,除了 N-端和 C-
末端序列 ,两者有相似的三维结构。
3　讨论
UPS是真核生物重要的翻译后修饰系统。
靶蛋白的多泛素化可引导 26S蛋白酶体降解靶蛋
白 ,这种及时的选择性降解在细胞的许多代谢过
程中起关键作用 ,如参与细胞周期调控 、信号传
导 、应急反应 、受损或错误折叠蛋白的去除以及
DNA修复等 。靶蛋白的单泛素化则以非水解的
方式调节靶蛋白的生物学活性 ,如参与靶蛋白的
稳定性 ,使靶蛋白重折叠及易位 、染色体结构改
变 、基因修复 、复制及表达调节等 [ 20] 。因此研究
条斑紫菜 UPS组成成份和作用途径具有重要的
理论和实践价值 ,特别是对研究条斑紫菜抗逆具
有重要的实践价值。
722 水　产　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　33卷
图 5　PyE2的三维结构以及 PyE2与人 I类 E2的空间结构比对
a和 b分别是 PyE2和人 I类E2的三维结构 , N端、C端和二级结构进行了标记;c是PyE2与人 I类E2空间结构的比较。活性位点
上的半胱氨酸残基以棍棒模式表示
Fig.5　TertiarystructureofPyE2 andstructuralcomparisonbetweenPyE2 andclassIE2 fromH.sapiens
aandbshowribbondiagramofPyE2 andclassIE2 ofhumanrespectively.TheN-terminal, C-terminalandsecondarystructurefeatures
arelabeled;cOverlayoftheCαtracesofPyE2 andclassIE2 ofhuman.Theactive-siteresidue(Cys)isshownasastickmodel
　　研究表明 UPS广泛参与植物对逆境的适应
过程 , E2可充当转录因子与苯丙氨酸解氨酶等防
御反应基因启动子上特定的顺式作用元件结合 ,
实现对植物防御反应的调节。 E2存在着种类和
功能多样性 ,在逆境作用下 E2基因表现出下调
或上调等不同的表达方式 [ 21] 。因此条斑紫菜不
同 E2成员的克隆与功能鉴定有待于进一步研
究 。
泛素只有经过一系列的酶促级联反应后才能
与细胞内的结构或调节蛋白结合 , E2是这个酶促
级联反应的重要组分 。在所有的真核细胞中都发
现了多种 E2,例如人至少有 30种 E2,多样性的
E2对于靶蛋白的特异性选择具有重要作用 。 E2
根据其结构和功能大致可以分为 4类[ 20, 22-24] :I
类 E2,由长 150 AA的保守催化结构域(UBC)组
成 ,在许多短命蛋白和异常蛋白的泛素依赖性降
解中起重要作用;Ⅱ类 E2,含催化结构域和一个
C-末端延伸结构 ,其 C-末端延伸结构具有多种功
能 ,如参与靶蛋白识别 、与 E3酶互作 、参与 N-末
端规则(N-endrule)依赖性蛋白水解途径;II类
E2,含催化结构域和一个 N-末端延伸结构 ,其 N-
末端延伸结构的功能还不清楚;IV类 E2,同时含
有催化结构域 、C-末端延伸结构和 N-末端延伸结
构 。PyE2与其它物种的 E2具有极高的相似性和
相似的三维结构 ,含有 E2的保守催化结构域 、活
性位点及半胱氨酸残基 ,但不含 C-末端延伸结构
和 N-末端延伸结构 。因此 PyE2属于条斑紫菜 I
类 E2。
条斑紫菜不仅经济价值高 ,而且还是海洋生
物学研究的模式植物 [ 25] ,有着重要的理论和实践
研究价值 ,其功能基因克隆也逐渐展开。早在
1994年 Reynolds等 [ 26]就克隆了条斑紫菜硫氧还
蛋白基因。此后 ,国内外学者相继克隆了一批条
斑紫菜的新功能基因 ,例如 , Kakinuma等 [ 27-28]通
过构建消减 cDNA文库分离了一些有性生殖相
关基因 、硝酸盐转运基因和尿素转运基因 , Fukuda
等 [ 29]从条斑紫菜基因组文库中分离得到了翻译
延伸因子 1α基因 , Kitade等 [ 25, 30-31] 和马凌波
等 [ 32]通过构建条斑紫菜叶状体 cDNA文库分别
克隆了液泡型的 H+-ATPase的 C亚基基因 、4种
肌动蛋白基因和抗坏血酸过氧化物酶基因 、Gong
等 [ 33]利用简并 PCR和反向 PCR技术克隆了条斑
紫菜 β-微管蛋白基因 。但是 ,目前在 GenBank上
记录的含完整编码区(completecds)的条斑紫菜
功能基因不过 70条 ,而且其中大多数是核糖体蛋
白基因 ,相对于拟南芥等模式植物而言 ,已克隆功
能基因还相当少 。因此如何快速分离条斑紫菜功
能基因至关重要 。分离功能基因既快速又便捷的
方法之一是对现有生物信息数据进行电子克隆。
Nikaido等 [ 34]和 Asamizu等[ 35]分别报道了 10 154
条和 10 625条条斑紫菜 EST,使电子克隆成为可
能 。例如 ,参与条斑紫菜抗逆的钙调素基因 [ 36]和
Lipocalin基因 [ 37]都是通过电子克隆快速获得的 。
电子克隆技术以数学算法为手段 ,以计算机
和互联网为工具 ,利用现有的生物信息数据库 ,能
快速获得新基因序列并能分析其功能特征 ,为新
基因的实验研究提供了重要指导 ,对进一步研究
基因蛋白家族组成 、结构及其功能都具有重要的
理论和现实意义 ,为功能基因组学与蛋白质组学
研究提供新的线索和基础 。目前在各种生物中都
有电子克隆的成功报道 ,如大肠杆菌(Escherichia
coli)NAD+ /NADP+依赖性琥珀酸半醛脱氢酶基
7235期　　　　　　　　　　易乐飞 , 等:条斑紫菜泛素结合酶基因的 cDNA序列克隆与分析
因 [ 38] 、蚯蚓 (Eiseniafoetida)Efp-0基因[ 39] 、小鼠
Muc5b基因 [ 40] 和人的 α-葡萄糖苷酶基因 [ 41] 等。
与传统基因克隆方法的繁杂 、耗时和低效相比 ,电
子克隆更为快速 、精确且目的性强 。随着更多海
洋生物测序的开展以及各类数据库的不断完善 ,
电子克隆技术必将成为海洋生物新基因克隆的重
要手段之一 。
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7255期　　　　　　　　　　易乐飞 , 等:条斑紫菜泛素结合酶基因的 cDNA序列克隆与分析
cDNAcloningandcharacterizationofanovelubiquitin-conjugating
enzymegenefromPorphyrayezoensisUeda
YILe-fei1 , LIUChu-wu2 , WANGPing1 , ZHOUXiang-hong1
(1.JiangsuKeyLaboratoryofMarineBiotechnology, HuaihaiInstituteofTechnology, Lianyungang　222005, China;
2.FisheriesColege, GuangdongOceanUniversity, Zhanjiang　524088, China)
Abstract:Theubiquitin-proteasomesystem(UPS)playsanimportantroleinpost-translationalprocess,
whichisresponsibleforadiversearrayofbiologicalyimportantcelularprocesses.TheUPSisalso
involvedintheproteinqualitycontrol, whichmaintainsthehealthofthecel.Thus, theUPSprovidesa
clueforunderstandingofthemolecularmechanismsunderlyingvarioustolerancesoforganismtodiversiform
adverseconditionsaswelasstresscombination.Ubiquitin-conjugatingenzyme(E2)isacritical
componentofUPS.Cloningofubiquitin-conjugatingenzymegene(PyE2)ofPorphyrayezoensisUedawil
facilitateustoinvestigatetoleranceofP.yezoensistodiversiformadverseconditionsanddegradationof
enableproteinbyUPS.cDNAsequence(GenBankaccession:FJ232910)ofPyE2 wasisolatedsuccessfuly
throughexperimentofRT-PCRunderdirectionofinsilicocloning.ThiscDNAcontaineda444 ntof
completeopenreadingframe(ORF)codinga16.6 kuprotein(PyE2)of147 aminoacidssequence.PyE2
hadsignificantaminoacidsequenceidentityandsimilaritywithE2sfromotherorganism, whichindicated
E2 washighlyconservedintheevolution.PyE2 containedconservedsequenceandcysteineresidueofactive
siteofE2 family, andtertiarystructureofPyE2 wassimilartohumanclassIE2.PyE2 wasaclassI
memberofE2 familyofP.yezoensisaccordingtobioinformaticsanalysis.
Keywords:PorphyrayezoensisUeda;ubiquitin-conjugatingenzyme(E2);cloning;bioinformatics
726 水　产　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　33卷