全 文 ：文章编号: 1007-0435( 2001) 02-0083-04
耐盐苜蓿与敏盐苜蓿 RAPD多态性研究
杨青川1 , 孙 杰2, 韩国栋2
( 1.中国农业科学院畜牧研究所,北京 100094; 2. 内蒙古农业大学生态环境学院, 呼和浩特 010018)
摘要: 以耐盐苜蓿和敏盐苜蓿为材料, 通过RAPD 反应,对 8 组的 160 条引物进行筛选。结果表明, 经过 5 轮筛选,
OPA 组 6 条引物、OPD 组 9 条引物、OPE 组 6 条引物、OPF 组 7 条引物、OPH 组 5 条引物、OPC 组 9 条引物、OPG
组 2条引物、OPN 组 7 条引物共 51 条都可作为多态性引物,其中以 OPA-17、OPD-5、OPD-7 等 3 条引物的 DNA
多态性最稳定。在“中苜一号”DNA 组上, OPA-17可在 2200 bp 处产生一条多态性谱带,并在 380 bp 出现谱带缺失
现象。OPD-5 可在 3500 bp 处形成一条清晰度极高的谱带, OPD-7 则在 650 bp 处无谱带产生。这 3 条引物所检测
出的耐盐苜蓿与敏盐苜蓿具有稳定的 DNA 多态性,该多态性与其耐盐性状有关。
关键词: 苜蓿; RAPD ; DNA 多态性; 耐盐性状
中图分类号: S541; Q943 文献标识码: A
Studies on RAPD Polymorphic in Salt-Tolerant Alfalfa
and Salt-Sensitive Alfalfa
YANG Qing-chuan
1 , SUN Jie
2, HAN Guo-dong
2
( 1. Inst itute o f Anim al Science, CAAS, Beijing 100094, China;
2. Eco log ical Env ironment Co lleg e, Inner M ongo lia Agr icult ur e Univ ersit y, Huhhot 010018, China )
Abstract: T he salt-tolerant alfalfa and the salt-sensitiv e alfalfa are used as material o f ex t ract ing DNA,
thr ough RAPD react ion, w e can select the pr imer of polymorphic DNA from 160 lines in eight gr oups
pr imer s. Af ter f ive turns, 51 lines being of polymorphic DNA have been found. Among them OPA-17 OPD-
5 and OPD-7 are thr ee lines o f the most stable polymor phic DNA. On the DNA of Medicago sat iva L.
“Zhongmu NO. 1”, OPA-17 is able to produce a band of polymor phic DNA in 2200 bp DNA size and lose a
band in the 380 bp; OPD-5 can lead a clear band in the 3500 bp; OPD-7 has lack of the band in 650 bp DNA
po int . The polymorphic DNA having stable is inspected by the three lines of primer. T hey maybe relact
w ith the salt-tolerance in M edicago sativ a L. “Zhongmu NO. 1”.
Key words : Alfalfa; Primer; RAPD; DNA po lymo rphic; Salt-to ler ace
DNA 分子水平多态性检测技术是进行基因组
研究的基础 [ 1]。RAPD在众多检测技术中,以其快
速、简便、检测效率高等特点, 被广泛地用于基因定
位和遗传作图等领域。RAPD 可以在一次反应中,
利用不同引物检测出基因组的多个位点。因此, 可以
快速找出两组 DNA 样品间的多态性差异,进而得
到与此差异区域相连锁的 DNA 标记。为分子育种
提供一条快速寻找、定位目标基因的途径[ 3]。
耐盐苜蓿“中苜一号”( Medicago sativa L.
“Zhongmu NO. 1”)是我国育成的优良品种之一。由
于具有耐盐碱、产草量高、营养价值高等优良性
状[ 4] ,具有广阔的推广前景和应用价值。应用 RAPD
收稿日期: 2000-11-10; 修回日期: 2001-01-14
基金项目:国家自然科学基金项目( 39870560)资助
作者简介:杨青川( 1966-) ,男,副研,主要从事牧草常规育种与生物技术育种研究,主持国家自然科学基金、“九五”科技攻关课题、农科院重大
推广等项目
第 9卷 第 2期
Vol. 9 No. 2
草 地 学 报
ACTA AGREST IA SIN ICA
2001 年 6月
June 2001
技术研究该品种的遗传物质, 对其耐盐性状进行分
子标记。利用分子标记辅助育种,一则为苜蓿耐盐育
种提供理论指导, 另一则将大大缩短育种进程; 进而
培育更耐盐的苜蓿新品种。
本文以“中苜一号”耐盐苜蓿, 大西洋敏盐苜蓿
( Salt-sensitive alfalfa of Da Xi Yang )及渭南敏盐
苜蓿( Salt-sensit ive alfalfa of Wei Nan)为材料, 对
OPA、OPC、OPD、OPE、OPF、OPH、OPN、OPG
10 bp随机引物 160条进行 DNA 多态性此物的筛
选,为“中苜一号”耐盐基因的定位进行基础性研究。
1 材料与方法
1. 1 供试材料
1. 1. 1 耐盐苜蓿 中苜一号由中国农科院畜牧所
提供。
1. 1. 2 敏盐苜蓿 1999- 2000年对 69份苜蓿进
行敏盐筛选, 结果选出大西洋和渭南两个敏盐苜蓿
品种。而后, 在盆栽条件下,对其进行两代敏盐性选
择,最终得到的种质材料。
1. 1. 3 试验中所用引物由鼎国公司提供为
OPEROR公司的产品。
1. 2 实验方法
1. 2. 1 提取 DNA 本实验采用 CT AB ( Cetyl
t rimethy l ammonium brom ide十六烷基三甲基溴化
铵)法[ 5]。从供试材料的叶片提取 DNA。取叶片 3 g,
放入液氮致冷、研磨, 加入 65℃的 2×CTA B( 2%
CTAB 2 mol / L Tr is、HCl、0. 5 mol/ L EDTA、
5 mol / L NaCl)提取液 900 L, 在 65℃水浴 15 至
20 min,冷却后加入 500 L 氯仿; 异戊醇 ( 24∶1)
6 000～8 000转/分下离心 10 m in, 取上清液,加入
1/ 10体积的 3 mol / L 醋酸钠和等体积的异丙醇,摇
匀至出现絮状沉淀后, 在 12 000 转/分下离心 5
min, 倒掉上清液, 用 75%酒精清洗, 室温干燥 1 h
后溶于 TE ( 2 mo l/ L T ris、HCl、0. 5 mol/ L EDTA)
缓冲液保存备用。
1. 2. 2 建立 DNA 池 在 3 个供试品种株群中,随
机各选 20 个单株, 取新鲜、健康叶片, 采用上述
CTAB 法进行单株DNA 提取,然后将等量 DNA 样
品进行混合[ 6] ,建立“中苜一号”耐盐苜蓿 DNA 池、
大西洋敏盐苜蓿及渭南敏盐苜蓿 DNA 池。为
RAPD 反应提供试验材料。
1. 2. 3 RAPD反应体系 RAPD反应热循环程序为
94℃/ 3′→→94℃/ 15″→→36℃/ 30″→→72℃/ 1′→→72℃/ 10′
45个循环
反应体系是经过优化反应后组合的。总反应体积为
25 L, 其中MgCl浓度为 2. 7 mmol/ L , dNT P 浓度
为 150 mol/ L , 引物浓度为 0. 192 mo l/ L , T aq
DNA 聚合酶用量为 2 / 25 L, 扩增缓冲液浓度
(以 KCL 浓度计) 是50 mmo l/ L , 模板DNA 用量为
120 ng
[ 7]。
1. 2. 4 RAPD 扩增反应 利用优化后的 RAPD 反
应体系对 8组的 160条引物进行扩增, 扩增结果用
1. 2%～1. 3%琼脂糖进行电泳分离[ 8] , 每条引物都
按“中苜一号”、大西洋苜蓿和渭南苜蓿次序点样, 紫
外灯下观察结果。从中选出DNA 多态性引物,再做
进一步的筛选。本实验共筛选 5 轮, 筛出具稳定
DNA 多态性的引物。
2 结果与分析
2. 1 8组 160条引物经 5轮筛选后, OPA-4、OPA-
7、OPA -8、OPA -10、OPA-12、OPA-17、OPD-2、
OPD-5、OPD-7、OPD-8、OPD-9、OPD-12、OPD-15、
OPD-16、OPD-18、OPE-1、OPE-6、OPE-9、OPE-12、
OPE-16、OPE-19、OPF-3、OPF-4、OPF-7、OPF-10、
OPF-13、OPF-18、OPF-20、OPH-9、OPH-12、OPH-
15、OPH-17、OPH-20、OPC-2、OPC-3、OPC-4、OPC-
7、OPC-8、OPC-10、OPC-11、OPC-13、OPC-14、
OPG-9、OPC-12、OPN -2、OPN -4、OPN-10、OPN-
13、OPN-17、OPN-19、OPN-20等 51条引物具多态
性, 其中以 OPA-17、OPD-5、OPD-7 3 条引物检测
出的 DNA 多态性稳定性最好。并在 5轮筛选中, 在
中苜一号特定位点上, 均表现出稳定的 DNA 多态
性(见观察记录与图片)。
2. 2 从 4次重复筛选所构建的模式图中,已经反应
出 3条引物在 3 组 DNA 中的结合位点, 分布区域
主要在 250～3500 bp之间,且在特定位点所表现出
DNA 多态性的稳定程度很好。这在第 5轮筛选照片
中得以充分体现。
2. 3 在第 11 泳道上, DNA 分子量约为 2200 bp
处,有一条特异性谱带,而在两个对照品种的相应部
位并无此带产生,与此同时,笔者在另外两个对照品
84 草 地 学 报 第 9卷
图 1 OPA-17、OPD-5、OPD-7三条引物 RAPD 反应模式图
F ig . 1 RAPD reaction modle map in OPA-17、OPD-5、OPD-7 thr ee lines o f pr imer s
图 2 RAPD 反应图片
Fig . 2 Photo gr aph o f RAPD reaction
10、20 道——Mark 10、20 lanes——Mark
11、14、17 道——中苜一号池 DNA 11、14、17 lanes—— DNA
poo l o f Zhong mu No . 1 A lfalfa
12、15、18 道——大西洋敏盐苜蓿池 DNA 12、15、18 lanes——
DNA poo l o f sa lt -sensit ive alfalfa of Da Xi Yang
13、16、19 道——渭南敏盐苜蓿池 DNA 13、16、19 lanes——
DNA poo l o f sa lt -sensit ive alfalfa of Wei Nan
11、12、13 道——引物为 OPA-17 11、12、13 lanes—— T he
primer is OPA-17
14、15、16 道——引物为 OPD-5 14、15、16 lanes—— T he
primer is OPD-5
17、18、19 道——引物为 OPD-7 17、18、19 lanes—— T he
primer is OPD-7
种谱带上,于 DNA 分子量为 380 bp 处,各出现一条
带,但相对应的耐盐品种在该区域并无此带。这两位点
有可能与苜蓿的耐盐性状有关, 仍有待进一步试验。在
第14泳道上, DNA 分子量为3500 bp 处, 出现一清晰
85第 2期 杨青川等:耐盐苜蓿与敏盐苜蓿 RAPD多态性研究
谱带, 而在第17泳道,相应于 DNA 分子量为 650 bp
处则出现谱带缺失情况。所做5轮筛选,均出现相同结
果, 说明在该 DNA 区域范围内某基因缺失的可能性
较大,从而导致由该基因控制的相对性状的表现。
3 讨论
DNA 是决定生物性状的遗传物质。由于 DNA
在某一区域的变化,如插入、缺失或碱基对突变等,
导致物种性状的多样性[ 9]。RAPD 技术可以将DNA
的这些变化检测并表现出来。本试验所检测出的
DNA 多态性有可能是“中苜一号”耐盐苜蓿品种与
两个对照品种在耐盐性状方面存在遗传物质的差
异,对此尚有待进一步的试验验证。
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(上接 82页)
合出现在牧后牧草量 1000 kg DM / hm 2、施磷量 36
kg P 2O 5/ hm
2以上的情况下。在不施肥的情况下,牧
草净生产最低。当牧后产草量低到 300 kg DM / hm2
(或草层高 6. 3 cm )以下时, 全年的净生产则降低。
本文结果为人工草地的管理调控和合理利用提供了
基础。
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