全 文 ：第20卷 第3期
Vol.20 No.3
草 地 学 报
ACTA AGRESTIA SINICA
2012年 5月
May. 2012
豌豆ISSR-PCR反应体系的建立和优化
曾 亮1,李敏权1,2*,杨晓明2,赵丽娟2,杨发荣2
(1.甘肃农业大学草业学院,兰州 730070;2.甘肃省农业科学院,兰州 730070)
摘要:以豌豆(PisumsativumL.)DNA为材料,对影响其ISSR-PCR反应体系中的5种主要因素(模板DNA量、引
物浓度、dNTPs浓度、Taq酶量、退火温度)进行优化,最终确定了豌豆ISSR-PCR反应的最佳体系(20μL)为:15ng
模板DNA,0.15mmol·L-1dNTP,0.5μmol·L-1ISSR引物,1UTaqDNA聚合酶,引物842号的最适退火温
度为50℃。该体系的建立为今后利用ISSR技术进行豌豆属种质资源的遗传多样性分析、遗传图谱构建和基因定
位奠定了技术基础。
关键词:豌豆;ISSR;PCR反应体系;优化
中图分类号:Q943 文献标识码:A 文章编号:1007-0435(2012)03-0536-04
EstablishmentandOptimizationofISSRReactionSystemforPea
ZENGLiang1,LIMin-quan1,2*,YANGXiao-ming2,ZHAOLi-juan2,YANGFa-rong2
(1.ColegeofGrasslandScience,GansuAgriculturalUniversity,Lanzhou,GansuProvince730070,China;
2.AcademyofGansuAgricultureScience,Lanzhou,GansuProvince730070,China)
Abstract:TheoptimumISSR-PCRsystemforpeasisestablishedusingISSR-PCRamplificationwithfive
factors(DNAtemplate,primer,dNTPs,TaqDNApolymeraseandannealingtemperature).Theopti-
mumreactionsystem(20μL)contains15ngDNAtemplate,0.15mmol·L-1dNTP,0.5μmol·L-1IS-
SRprimer,1UTaqDNApolymerase.Thesuitableannealingtemperatureofprimer842is50℃.Thisre-
actionsystemwilprovideatechnologicalbaseforgeneticdiversityanalysisofpeagermplasm,geneticmap
constructionandgenelocation.
Keywords:Pisumsativum L.;ISSR;PCRreactionsystem;Optimization
豌豆(Pisumsativum L.)是豆科蚕豆族豌豆属
一年或越年生草本植物,是粮菜饲兼用作物,具有耐
寒、耐旱、耐瘠等特点,因其适应性很强,在全世界的
地理分布很广[1]。中国是世界第2大豌豆主产国,
广阔的地理分布范围和多样化的生境造就了丰富的
豌豆种质资源,形成了豌豆的遗传多样性[2]。以往
对于豌豆属种质资源遗传多样性的研究,主要是通
过形态性状和细胞学特征、SSR、AFLP、RAPD技术
等进行分析,侧重于豌豆属植物ISSR分子标记的
研究鲜见报道[3-6]。
ISSR(inter-simplesequencerepeats)是一种建
立在PCR反应基础上的 DNA 分子标记技术,由
Zietkiewicz等人于1994年创建[7]。其基本原理是
利用基因组中存在的众多的SSR本身设计引物,在
SSR的3′或5′加上1~4个碱基锚定,对两侧具有
反向排列的SSR序列间的基因组片断进行扩增,扩
增产物在琼脂糖凝胶电泳中分离,从中鉴定多态性。
ISSR标记产物多态性远比RFLP、SSR和RAPD更
加丰富,可以提供更多关于基因组的信息,并且由于
其引物较长、退火温度较高以及SSR在真核生物基
因组中的广泛存在,使其多态性和稳定性明显优于
RAPD等其他标记技术,试验重复性好,现被广泛应
用于植物的品种鉴定、基因定位、遗传作图、进化和
系统发育等方面的研究[8-9]。
因此,本试验旨在通过研究ISSR-PCR反应中
各项参数变化对试验结果的影响,对ISSR-PCR反
应体系进行优化,建立适用于豌豆的ISSR反应体
系,为进一步利用该技术研究豌豆种群遗传多样性
奠定基础。
收稿日期:2012-02-28;修回日期:2012-04-05
基金项目:现代农业食用豆产业技术体系专项(CARS-09);国家自然科学基金(31160304)资助
作者简介:曾亮 (1983-),男,甘肃兰州人,博士研究生,研究方向为植物病理,E-mail:steve-1314@163.com;*通信作者 Authorforcorre-
spondence,E-mail:lmq@gsau.edu.cn
第3期 曾亮等:豌豆ISSR-PCR反应体系的建立和优化
1 材料与方法
1.1 供试材料
供试豌豆材料为陇豌1号,2011年3月种植于
甘肃省农业科学院秦王川试验基地。
1.2 试验仪器与试剂
主要仪器:紫外可见分光光度计(LambdaBio
10型,美国PE公司);PCR扩增仪(BioRad-MyCy-
cler,美国);紫外凝胶成像系统(UVPGDS-8000,美
国);电泳仪(JY300,北京君意机电技术公司)。
主要试剂:ISSR引物序列由哥伦比亚大学(U-
niversityofColumbia)提供,由上海生工生物技术
公司合成,经过引物初步筛选试验,确定 UBC842
为本试验固定引物,其序列为:5′-GAGAGAGAG-
AGAGAGAYG-3′,TaqDNA聚合酶、dNTP、DNA
Maker均购自天根生化科技(北京)有限公司,其他
试剂为国产分析纯。
1.3 基因组DNA提取及定量
基因组DNA提取采用改进CTAB法[10]。将
所得的DNA提取液稀释50倍于紫外可见分光光
度计上测定波长260和280nm处的吸光度。根据
OD260/OD280值判断DNA纯度,OD260值计算DNA
浓度,计算公式:DNA浓度(μg·μL-1)=OD260×
50×稀释倍数[11]。最后稀释调整DNA浓度至10
ng·μL-1,放入-20℃冰箱中保存备用。
1.4 ISSR扩增反应体系及程序
扩增反应在0.2mL离心管中进行,20μL反应
体系中各反应物含量为:15ng模板 DNA,0.2
mmol·L-1dNTP,0.5μmol·L-1ISSR引物,1U
TaqDNA聚合酶,2μL10×PCRBuffer。
ISSR-PCR扩增程序为:94℃充分变性3min,
然后进行以下34个循环:94℃变性30s,50℃退火
30s,72℃延伸45s,最后于72℃延伸10min,4℃终
止反应保存。
1.5 PCR检测结果
取8μLPCR扩增产物与2μL6倍加样缓冲液
(TaKaRa)混匀,点入含0.5μg·mL-1溴化乙锭
(EB)的2%琼脂糖凝胶中,在5V·cm-1电场强度
下电泳1~2h,电极缓冲液为1×TAE,用DL2000
作为标准相对分子量对照。紫外光下 UV凝胶成
像系统观察并照相。
1.6 ISSR反应条件优化
确定最佳反应条件时,对反应体系各个因素设
置不同梯度水平(表1)。当试验中对某一因素进行
梯度设置时,其余因素均保持不变。在最佳反应体
系的基础上对退火温度进行梯度试验,筛选出最适
退火温度。
表1 ISSR反应系统优化设计
Table1 DesignofoptimalISSRreactionsystem
影响因素
Influencingfactors
反应参数Parameterinreaction
1 2 3 4 5 6
DNTP/mmol·L-1 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35
Taq酶Taqpolymerase/U 0.25 0.5 0.75 1.0 1.25 1.5
引物Primer/μmol·L-1 0.25 0.5 0.75 1.0 1.25 1.5
DNA/ng 10 20 30 50 80 120
退火温度 Annealingtemperature/℃ 46 48 50 52 54 56
2 结果与分析
2.1 DNA检测
紫外分光光度计分别测定DNA提取液的OD260
和OD280的值(表2),并计算得OD260/OD280=1.73,接
近于1.8,说明所提取DNA质量较好,纯度较高。
2.2 模板DNA用量对ISSR-PCR的影响
适宜的模板量是保证特异性扩增的前提。由
表2 基因组DNA紫外分析
Table2 DNAultravioletanalysis
提取材料
Materials
OD260 OD280 OD260/OD280
DNA浓度/μg·μL-1
DNAconcentration
陇豌1
LongWanNo.1
0.092 0.053 1.73 230
图1可知,模板用量为10和20ng时,均能产生清
晰ISSR条带,而20ng时带更清晰,在30~120ng
时,只有极少数不清晰条带或无扩增产物。因此建
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草 地 学 报 第20卷
议在豌豆ISSR研究中,20μL反应体系模板用量取
10~20ng为宜。
图1 DNA量对ISSR的影响
Fig.1 EffectofDNAconcentrationonISSRamplification
1:10ng;2:20ng;3:30ng;4:50ng;5:80ng;6:120ng;M:Marker
2.3 TaqDNA聚合酶用量对ISSR-PCR的影响
在ISSR-PCR反应体系中TaqDNA聚合酶的
种类以及用量直接影响扩增反应成功与否。由图2
可知,TaqDNA聚合酶用量在0.75~1.0U之间
时均产生清晰稳定的扩增条带。当Taq酶量小于
0.75U时,无扩增产物或只有少量产物。当Taq酶
量大于1.25U时,谱带有弥散现象,且会产生非特
异性扩增现象。综合试验效果和费用,在20μL反
应体系中,TaqDNA聚合酶的用量选择0.75~1.0
U为宜。
图2 Taq酶量对ISSR的影响
Fig.2 EffectofTaqDNApolymeraseconcentration
onISSRamplification
1:0.25U;2:0.5U;3:0.75U;4:1.0U;5:1.25U;
6:1.5U;M:Marker
2.4 dNTP用量对ISSR的影响
dNTP是ISSR-PCR扩增的原料,其浓度过高
会导致PCR错配,从而出现非特异性扩增,浓度过
低又会影响扩增效果,甚至会因为dNTP过早消耗
使产物单链化。由图3可知,dNTP浓度在0.15~
0.2mmol·L-1之间时产生清晰稳定的扩增条带,
且浓度在0.15mmol·L-1时条带分辨率更高。
dNTP浓度低于0.15mmol·L-1时,扩增产物少且
出现条带模糊现象;而高于0.2mmol·L-1时,出现
明显条带缺失现象或无扩增产物。因此豌豆ISSR-
PCR反应中最佳dNTP浓度为0.15mmol·L-1。
图3 dNTP用量对ISSR的影响
Fig.3 EffectofdNTPconcentrationonISSRamplification
1:0.1mmol·L-1;2:0.15mmol·L-1;3:0.2mmol·L-1;
4:0.25mmol·L-1;5:0.3mmol·L-1;
6:0.35mmol·L-1;M:Marker
2.5 引物浓度对ISSR的影响
如图4所示:引物浓度在0.5~0.75μmol·L-1
时,条带最清晰稳定,引物浓度为0.25μmol·L-1
时,只有一条主带;大于0.75μmol·L-1时,扩增产物
减少,扩增效率低且带不清晰,当引物浓度在1.5
μmol·L-1时,产生非特异性条带。故豌豆ISSR-PCR
最佳引物浓度在0.5~0.75μmol·L-1之间为宜。
图4 引物浓度对ISSR的影响
Fig.4 EffectofprimerconcentrationonISSRamplification
1:0.25μmol·L-1;2:0.5μmol·L-1;3:0.75μmol·L-1;
4:1.00μmol·L-1;5:1.25μmol·L-1;6:1.5μmol·L-1;M:Marker
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第3期 曾亮等:豌豆ISSR-PCR反应体系的建立和优化
2.6 退火温度对ISSR的影响
图5结果显示:退火温度为50℃时,条带清晰
稳定,低于50℃时,条带出现缺失现象,高于50℃
时,多态性偏低且条带亮度比较暗。故842号引物
最适宜的退火温度确定为50℃。
图5 退火温度对扩增结果的影响
Fig.5 Effectofannealingtemperatureon
amplificationpattern
1:46℃;2:48℃;3:50℃;4:52℃;5:54℃;5:56℃;M:Marker
3 讨论
基于PCR反应的ISSR分子标记技术,受反应
条件和扩增程序变化以及物种不同的影响[12]。本
试验结果表明,采用不同的浓度组合对豌豆的PCR
扩增结果差异很大。因此,为确保ISSR分析结果
的可靠性和重复性,反应条件一旦确定,就应该保持
不变,以保证ISSR分析结果的可靠性。
模板DNA是ISSR-PCR反应体系的一个重要
的影响因素,其纯度必须要高。模板DNA量也影
响着ISSR-PCR扩增效果,模板DNA量过低,分子
碰撞的几率低,扩增产物不稳定或无扩增产物;模板
量过多,特异扩增效率降低,非特异性产物增加[13]。
同时,为保证PCR反应的特异性,引物与模板的比
例也要控制在一定范围内。引物浓度过低时,扩增
产物少,条带弱;引物浓度过高时,会引起模板与引
物的错配,PCR反应特异性下降,还会增大引物二
聚体形成的几率。
dNTP是PCR反应中的基本原料,如果浓度太
高,TaqDNA聚合酶会以比正常速率高很多的速率
使之错配而影响保真性;如果浓度太低,又会导致
PCR扩增不完全,效率减低[14]。同时,Mg2+ 也是
PCR反应中的重要成分,它能影响扩增产物特异
性、扩增片段产率和引物二聚体的形成等,浓度过高
可降低扩增的特异性,过低则影响扩增产量,甚至使
扩增失败。游离的 Mg2+ 可与dNTP的磷酸基结
合,因此,只有当 Mg2+浓度与dNTP浓度在一定范
围内才能得到高质量的PCR扩增结果。本试验中
所用dNTP为混合试剂,其中以最适比例加入了
Mg2+,因此并未单独对其进行因素分析。
试验结果表明,退火温度对扩增结果的好坏有
明显影响。退火温度过低扩增特异性差,背景深;退
火温度过高则引物与模板结合差,PCR产物丰度
低。对于不同的ISSR引物需要各自确定其最适退
火温度,以获得稳定可靠的标记结果。
4 结论
ISSR分子标记技术基于PCR反应,其扩增结
果受模板DNA量、引物浓度、dNTPs浓度、Taq酶
用量和退火温度与扩增程序等诸多因素的影响。本
研究对影响ISSR-PCR反应的主要因素进行优化筛
选分析。结果显示,豌豆ISSR扩增时引物UBC842
的最适退火温度为50℃,经优化后的理想扩增反应
体系为:15ng模板DNA,0.15mmol·L-1dNTP,
0.5μmol·L-1ISSR引物,1UTaqDNA聚合酶,
2μL10×PCRBuffer。
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(责任编辑 刘云霞)
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