全 文 ：第 17 卷
第 5 期

Vol. 17
No. 5
草
地
学
报
ACTA AGRESTIA SINICA



2009 年
9 月

Sep.

2009
2种三叶草杂种 F1 代胚性愈伤组织筛选
栾晓敏1 , 王明玖1* , 何丽君2, 李
耀1 , 李志强1
( 1. 内蒙古农业大学生态环境学院, 呼和浩特
010019; 2. 内蒙古农业大学农学院, 呼和浩特
010019)
摘要: 以高加索三叶草( T r if ol ium ambiguum Bieb. )与白三叶( T r if olium. rep ens L . )杂交后胚离体培养产生的
F1 无菌苗的茎段为外植体, 筛选诱导愈伤组织的最适培养基, 将 F1 茎段产生的愈伤组织经过继代后转移到分化培
养基中,研究不同浓度激素组合对体细胞胚胎产生的影响。结果表明: MS+ 6
BA+ NAA是诱导 F1 茎段愈伤组织
的适宜培养基; MS + 2, 4
D+ 6
BA+ NAA+ KT+ CH 为 F1 茎段愈伤组织的适宜分化培养基; 对分化后的胚性愈
伤进行组织学观察,可见其表面形成许多瘤状突起, 即胚性细胞团, 它们可以继续发育形成体细胞胚,为快速得到
数量较多的杂种 F1 再生苗奠定基础。
关键词:高加索三叶草; 白三叶;离体胚培养; 杂种 F1 ; 胚性愈伤组织
中图分类号: S334. 5



文献标识码: A




文章编号: 1007
0435( 2009) 05
0650
05
Screening of Embryogenic Callus from Hybrid F1 of Caucasian Clover
White Clover
LUAN Xiao
min1 , WANG M ing
jiu1* , HE Li
jun2 , L I
Yao1 , L I Zhi
qiang1
( 1. College of Ecology and En vironmen tal Science, In ner Mongolia Agricultur e University, H uhh ot, Inner M on gol ia Autonomous Region
010019, China; 2.College of Agronomy, Inner Mongolia Agriculture University, H uhhot , Inner Mongolia Autonomous Region 010019, China)
Abstract: T he appropriate culture medium of callus inducement w as scr eened using the advent itio us shoo ts
as explant f rom the stems o f asept ic seedling of F1 crossed betw een the embryos of Caucasian clov er ( T ri

f olium ambiguum Bieb. ) and white clover ( T r if ol ium. rep ens L. ) by in vi tr o culture. T he callus f rom
stems of F 1 af ter successive t ransfer culture w as t ransfer red into differ ent iat ion medium and the effect of
ho rmone combinat ions w ith different concentrat ions on the somat ic embryogenesis w as studied. T he re

sults show that ho rmone combinat ion o f M S+ 6
BA + NAA were the suitable medium for the callus in

ducement f rom stems of F 1 and M S+ 2, 4
D+ 6
BA+ NAA+ KT+ CH was the suitable media for the stem
callus dif ferent iation. H isto logical observat ion w as performed on embryogenic cal lus after differ ent iat ion
and the st rumae st ructure w ere detected on the surface of callus. These st rumae str uctures w ere embryo

genic cell masses w hich could be further developed into the somatic embryo as the foundation of the rapid
acquisit io n of regener at ion plants of hybrid F1 .
Key words: Caucasian clov er; White clo ver; Embryo culture in vi tr o ; H ybr id F 1 ; Embryogenic callus


高加索三叶草( Tr if olium ambig uum Bieb. )属
三叶草属,多年生长寿牧草,具有发达的地下根茎和
极强的克隆生长能力 [ 1] ,原产于寒冷的高加索山地,
土耳其东部和伊朗北部。由于当地比较恶劣的生态
条件,使该草具有很强的抗旱和耐寒等特性 [ 2]。高
加索三叶草在自然条件下固氮能力差, 需要通过专
门的根瘤菌接种剂接种才能进行固氮作用[ 3]。白三
叶( T . r ep ens L. )是世界上最重要、利用最广泛的豆
科牧草之一,其营养价值高,富含蛋白质, 纤维素含
量低,固氮能力强[ 4, 5] , 但抗旱和耐寒性差。在内蒙
古地区种植的过程中, 由于干旱或不能正常越冬等
原因,至今不能大面积推广种植。高加索三叶草和
白三叶分别为六倍体( 2n= 6x= 48)和四倍体( 2n=
4x= 32) ,是亲缘关系相近的2个种。为了培育出具
有 2物种优点的新品种,可以通过杂交,选择理想的
后代。国内对高加索三叶草和白三叶杂交的报道很
少,但国外已有不少报道, 如 Abberton 等 [ 6, 7] 利用
胚珠培养技术对高加索三叶草和白三叶进行杂交,
收稿日期: 2009
03
24;修回日期: 2009
06
11
基金项目:国家自然科学基金( 30660118) ,内蒙古教育基金( NJC07051)
作者简介:栾晓敏( 1982
) ,女,蒙古族,内蒙古赤峰市人,硕士研究生,研究方向为草地生态及草地资源, E
mail: lu an. xiao. min@ 163. com ;
* 通讯作者 Author for correspondence, E
mail: w angm j_0540@ 163. com
第 5期 栾晓敏等: 2种三叶草杂种 F1 代胚性愈伤组织筛选
得到杂种 F 1后再用白三叶做轮回亲本进行回交,成
功后对回交后代的牧草质量进行分析, 并对其进行
了 AFLP 标记; Low ther 等 [ 8]对高加索三叶草和白
三叶进行杂交取得成功后, 对其杂交后代的根瘤菌
的固氮作用做了进一步的研究, 但相关细节未见报
道。在离体培养过程中易出现杂种胚的败育, 形成
杂种 F 1植株的数量有限且十分珍贵,因此通过对少
量杂种F 1 无菌苗进行愈伤组织的诱导来建立 F 1 扩
增体系,并利用适宜的分化培养基使杂种 F1 茎段的
愈伤组织通过体细胞胚胎发生来建立高频再生体
系,为挽救胚败育及杂交苗的扩繁和回交奠定基础。
1
材料与方法
1. 1
供试材料
以盛花期内的高加索三叶草为母本,白三叶为
父本进行杂交胚离体培养获得杂种 F 1 无菌苗[ 9]。
1. 2
试验方法
1. 2. 1
杂种 F1 茎段愈伤组织的诱导
将杂交胚离
体培养产生的 F1 代无菌苗的茎切成1 cm 左右的小
段接种在 4种不同的 MS诱导培养基中,将诱导培
养基的 pH 值调至5. 8,分别命名为 A、B、C和 D(图
1)。其中 A 和 B培养基中分别添加不同浓度的 2,
4
D; C 和 D 培养基中分别添加不同浓度的 NAA。
在以上 4 种培养基中分别添加相同浓度的 6
BA。
将其放在培养室内培养, 条件为每日光照 10~ 12
h, 光照强度为 18000~ 22000
moL
m- 2
s- 1 , 室
内温度保持在 26
左右,每日观察其生长状况, 30 d
后统计其出愈情况。
图 1
杂种 F1 茎段愈伤组织诱导培养基
Fig . 1
Culture medium fo r callus induct ion of F 1 st ems
1. 2. 2
杂种 F 1 愈伤组织的分化培养
选择杂交
F1 茎段产生的淡绿色或浅黄绿色颗粒状的愈伤组
织分别接种到附加不同浓度激素的 10种 MS分化
培养基中,分别命名为 1~ 10号培养基。1号~ 4号
培养基中均加入 2, 4
D、NAA和 KT (激动素) , 在这
4种培养基中, 加入 2, 4
D 和 NAA 的浓度分别相
等, KT 浓度依次增加。5号培养基为 MS+ 2, 4
D
+ 6
BA+ NAA, 6号培养基为 MS+ 2, 4
D+ 6
BA
+ NAA+ CH(水解酪蛋白, 250 mg/ L ) , 2种培养基
中各添加的 2, 4
D、6
BA和 NAA 的浓度对应相同。
7号培养基为 MS+ 2, 4
D + 6
BA + NAA+ KT, 8
号培养基为 MS+ 2, 4
D+ 6
BA+ NAA+ KT + CH
( 250 mg/ L) , 2 种培养基中分别添加的 2, 4
D、6

BA、NAA 和 KT 的浓度也对应相同。9 号培养基
在 7号培养基的基础上提高 NAA 浓度, 10号培养
基在 9号培养基的基础上加入 CH (图 2)。将分化
培养基的 pH 值调至 5. 8, 置于培养室内培养,培养
条件为每日光照 10~ 12 h, 光照强度为 18000~
22000
moL
m- 2
s- 1 , 室内温度保持在 26
左
右,每日观察愈伤组织的分化状况并记录, 20 d 后
统计其分化率。
图 2
杂种 F1 茎段愈伤组织分化培养基
F ig. 2
Cultur e medium for callus differentiation o f F1 stems
1. 2. 3
观察杂种 F 1 体细胞胚胎发生
在分化培养
基中选出长有明显绿色疏松颗粒的愈伤组织在 Su

per Dynam ic
WV
C
P460解剖镜和 Olympus显微
镜下观察并照相。
2
结果与分析
2. 1
杂种 F1 茎段愈伤组织的诱导
不同激素组合的 MS 培养基对杂种 F 1 茎段愈
伤组织诱导有不同影响(图 3)。A、B 培养基中 F1
茎段在接种 7 d 左右两端开始膨大,并产生少量愈
伤组织。A 培养基中愈伤组织出愈率为 60%, B培
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养基的出愈率为80%, 由于 A 培养基中的 2, 4
D浓
度比 B培养基中低,且 B培养基中长出的愈伤组织
颜色黄绿,结构疏松,水润感强(图 4, 图 5)。在此培
养基中继代后, 愈伤组织的生长状态下降,颜色慢慢
变黄,部分开始褐变,说明 2, 4
D不适宜长久诱导愈
伤组织。C、D培养基中的 F 1 茎段 10 d左右两端开
始膨大, 12~ 13 d 开始有少量淡绿色且结构紧密的
愈伤组织产生。D培养基中的 NAA 浓度比 C 培养
基中的 NAA浓度高。D培养基中愈伤组织的出愈
率为 100%,比 C培养基中的出愈率92. 86%高。表
明 D培养基适宜诱导杂种 F 1 茎段的愈伤组织。在
此培养基中继代后,其愈伤组织的表面已有绿色的
小颗粒出现(图 6,图 7)。
2. 2
杂种 F1 茎段愈伤组织的分化
10种分化培养基中杂种 F 1 茎段愈伤组织的分
化率、生长速度和颜色均存在一定差异(图 4,表 1)。
1~ 4号分化培养基中杂种 F1 茎段的愈伤组织颜色
黄绿,质地较硬, 水润感强, 接种 7 d左右其愈伤组
织的表面产生绿色颗粒, 称其为芽点。在这 4种分
化培养基中当 KT 浓度为 1 mg/ L 时, 愈伤组织分
化率为 28% , 低于 1 mg / L 时愈伤组织的分化率
6% ,高于 1 mg/ L 愈伤组织的分化率分别为 2%和
0, 说明适宜浓度的 KT 对杂种 F 1 茎段愈伤组织的
分化具有促进作用。5号和 6号培养基中愈伤组织
的分化率分别为 4%和 8%。这 2 种培养基中附加
的激素浓度和种类相同,差别在于 6 号培养基中加
入了 CH ,在此培养基中长出的愈伤组织颜色黄绿,
5 d左右其愈伤组织的表面可产生芽点(图8)。7号
和 8号培养基以 5号和 6号培养基为基础又分别添
加了 KT ,其愈伤组织的分化率明显升高,加入 CH
的 8号培养基中的愈伤组织颜色翠绿, 水润感强, 5
d左右其愈伤组织表面长出明显的绿色芽点(图 9) ,
分化率为 36%, 说明 CH 能够促进胚萌发。9号和
10号培养基中愈伤组织的分化率都为 0, 可能是由
NAA浓度增加所致。
2. 3
杂种 F1 体细胞胚胎的发生
2. 3. 1
胚性愈伤和非胚性愈伤的判别
胚性愈伤
是指具有成胚潜力的愈伤组织, 它们体积小,细胞质
浓密。非胚性愈伤是指愈伤组织中的细胞大且高度
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第 5期 栾晓敏等: 2种三叶草杂种 F1 代胚性愈伤组织筛选
表 1
不同培养基对 F1 茎段愈伤组织分化的影响
Table 1
Effect of culture medium on the callus
differ entiation of F 1 stems
培养基代号
Code of medium
愈伤组织生长速度
Callus growth speed
愈伤组织颜色
Callus color
1 + 黄绿 Olivine
2 + + + + 黄绿、绿 Olivine or gr een
3 + + 黄绿 Olivine
4 + 黄 Yellow
5 + + 黄绿 Olivine
6 + + 黄绿、淡绿 Olivine or l ight gr een
7 + + + 绿 Gr een
8 + + + + 翠绿 Emerald
9 + 褐 Brown
10 + 褐 Brown


注: + :缓慢; + + :较快; + + + :快; + + + + :很快
Note: + : slow; + + : relat ively fast ; + + + : fast ; + + + + :
very fast
液泡化,不具有胚胎发生潜力的愈伤。本试验中没
有分化的愈伤组织均为非胚性愈伤,颜色黄绿或黄
色,结构松散,生长缓慢。2种愈伤组织在形态上有
明显差异,容易辨别。
2. 3. 2
杂种 F1 体细胞胚胎发生的细胞学观察
在
高倍解剖镜下可观察到杂种 F1 茎段愈伤组织分化
后的体细胞胚胎发生现象。8号分化培养基中培养
5 d左右的愈伤组织表面形成的瘤状突起即为胚性
愈伤组织,形状与周围愈伤组织差别明显, 细胞质
浓,颜色深,易与周围细胞区分(图 10)。这些胚性
细胞团可进一步发育依次形成球形胚、心形胚、鱼雷
形胚和子叶胚, 最后发育成完整植株。如果将胚性
愈伤组织在 Olympus显微镜下观察, 其结果与在解
剖镜下的观察相似(图 11) , 证明高加索三叶草与白
三叶的杂种 F1的体细胞胚胎起源于愈伤组织中的
一些胚性细胞团。
3
讨论
在植物组织培养过程中, 愈伤组织的产生和分
化离不开植物激素的调节和控制, 常用的植物激素
有 2, 4
D、NAA、6
BA 和 KT 等[ 10] 。侯建华等[ 11]指
出 2, 4
D 对羊草 ( L eymus chinensis ) 与灰色赖草
( L eymus ciner eus)杂种 F1 的作用主要是产生一种
胚性愈伤组织,但并非 2, 4
D浓度越高诱导的愈伤
组织胚性就越强。本试验在诱导杂种 F1 茎段愈伤
组织的过程中分别使用了 2, 4
D和 NAA。在使用
2, 4
D 的过程中, 随着其浓度增加产生的愈伤组织
质量却下降, 与侯建华等得出的结论相一致。使用
NAA 诱导 F 1 茎段愈伤组织的出愈时间比使用 2,
4
D诱导愈伤组织的时间晚 1- 2 d,但其愈伤组织
的质地和生长状况均好于使用 2, 4
D诱导出的愈伤
组织, 原因可能是本试验材料对 2, 4
D 较敏感,
NAA 则更加适合诱导杂种 F1 茎段愈伤组织。
兰研等[ 12] 试验表明,增殖培养基中添加 CH 有
利于新疆大叶苜蓿愈伤组织的生长, 周传恩等 [ 13]证
明了 CH 常用于胚培养以增加原胚的分化,促进胚
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的生长。本试验当分化培养基中添加 CH 时, 愈伤
组织的分化率要高于未添加 CH 的分化培养基, 说
明 CH 对杂交胚的萌发具有影响。
许多资料表明[ 14~ 16] ,一种生长素和一种分裂素
组合使用可使豆科牧草的愈伤组织分化, 一般常用
的分裂素为 6
BA或 KT。本试验在杂种 F1 茎段愈
伤组织的分化阶段, 既用到了 6
BA 又用到了 KT。
KT 单独与 2, 4
D和NAA 混合使用时,当其浓度适
宜时愈伤组织的分化率较高, 可见愈伤组织的分化
过程离不开 KT, 与杨建伟等[ 17]提到的细胞分裂素
在苗的分化中起决定作用的结论相一致。单独使用
6
BA 与 2, 4
D和 NAA 组成分化培养基时,其愈伤
组织的分化率低于单独使用 KT 与 2, 4
D和 NAA
组合的培养基。最终在分化培养基中将以上 4种激
素组合使用,愈伤组织的分化率较高,这一现象可能
是由杂种 F 1本身存在内源激素造成。
4
结论
以杂种 F1 无菌苗的茎段为外植体, 筛选出 MS
+ NAA( 0. 8 mg / L ) + 6
BA( 2 mg/ L )是诱导茎段
愈伤组织的适宜培养基, 在此培养基中愈伤组织的
出愈率可达 100%。继代后, 将愈伤组织转接入 2,
4
D、6
BA、NAA、KT 和 CH 组合的分化培养基中,
愈伤组织可达最大分化率。将分化后的愈伤组织对
其进行组织学观察, 可见胚性愈伤组织,这些胚性愈
伤组织可进一步发育形成原胚, 以体细胞胚胎发生
的方式形成数量较多的再生植株。
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(责任编辑
刘敏轩
李
扬)
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