全 文 ：第２０卷 第１期
Ｖｏｌ．２０ Ｎｏ．１
草 地 学 报
ＡＣＴＡ ＡＧＲＥＳＴＩＡ ＳＩＮＩＣＡ
２０１２年 １月
Ｊａｎ． ２０１２
红茂草生物碱正交提取工艺模式优化
及清除自由基作用的研究
赵 强１，王廷璞２＊，余四九１
（１．甘肃农业大学动物医学院，甘肃 兰州 ７３００７０；２．天水师范学院生命科学与化学学院，甘肃 天水 ７４１００１）
摘要：为研究红茂草（Ｄｉｃｒａｎｏｓｔｉｇｍａ ｌｅｐｔｏｄｕｍ（Ｍａｘｉｍ．）Ｆｅｄｄｅ）生物碱的正交提取工艺条件及其清除自由基作用。
采用单因素水平测定，从１０种相关因素中筛选出乙醇体积分数、超声波作用时间、液料比、回流时间、浸提液ｐＨ
值、浸泡时间共６种主要影响因素，按照Ｌ２５（５６）正交表进行正交试验，用ＳＰＳＳ １７．０软件进行统计分析，优选出最
佳正交提取工艺模式；将正交提取浓缩液进行 ＨＰＬＣ检测，并测定其对羟自由基（·ＯＨ）和氧自由基（Ｏ２－·）的清除
作用。结果表明：红茂草生物碱最佳提取工艺条件为乙醇体积分数６５％、超声波作用时间２０ｍｉｎ、液料比１５∶１、回
流时间２．５ｈ、浸提液ｐＨ＝８、浸泡时间４ｈ；在最佳提取工艺条件下红茂草提取液中生物碱的含量为９．２７９４％；红
茂草生物碱在２５．０和１．８ｍｇ·ｍＬ－１时，对·ＯＨ 和Ｏ２－·清除效果显著，其清除率为５８．７０％和４９．２６％，ＩＣ５０为
２３．５０和１．７５ｍｇ·ｍＬ－１。该工艺方法简便、可靠、提取率高，提取液清除自由基作用显著。
关键词：红茂草；异紫堇碱；正交设计；自由基
中图分类号：Ｑ９４６．８８ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００７－０４３５（２０１２）０１－０１７１－０８
Ｏｐｔｉｍａｌ Ｅｘｔｒａｃｔ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｏｆ Ａｌｋａｌｏｉｄｓ ｆｒｏｍＤｉｃｒａｎｏｓｔｉｇｍａ ｌｅｐｔｏｄｕｍ （Ｍａｘｉｍ．）
Ｆｅｄｄｅ ｂｙ Ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ Ｄｅｓｉｇｎ Ｍｏｄｅ ａｎｄ Ｉｔｓ Ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃａｌｓ
ＺＨＡＯ Ｑｉａｎｇ１，ＷＡＮＧ Ｔｉｎｇ－ｐｕ２＊，ＹＵ Ｓｉ－ｊｉｕ１
（１．Ｃｏｌｅｇｅ ｏｆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｇａｎｓｕ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｌａｎｚｈｏｕ，Ｇａｎｓｕ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ ７３００７０，Ｃｈｉｎａ；
２．Ｃｏｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｔｉａｎｓｈｕｉ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｔｉａｎｓｈｕｉ，Ｇａｎｓｕ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ ７４１００１，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ ａｌｋａｌｏｉｄ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｆｒｏｍ Ｄｉｃｒａｎｏｓｔｉｇｍａ Ｌｅｐｔｏｄｕｍ Ｆｅｄｄｅ ａｎｄ ｉｔｓ
ｆｒｅｅ ｒａｄｉｃａｌ ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇ ｅｆｆｅｃｔ ｗｅｒｅ ｓｔｕｄｉｅｄ．Ｓｉｘ ｍａｉｎ ｉｍｐａｃｔ ｆａｃｔｏｒｓ（ｖｏｌｕｍｅ ｆｒａｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ａｌｃｏｈｏｌ，ｔｉｍｅ ｏｆ
ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ，ｓｏｌｉｄ／ｌｉｑｕｉｄ ｒａｔｉｏ，ｔｈｅ ｐＨ ｏｆ ｌｅａｃｈ ｌｉｑｕｏｒ ａｎｄ ｍａｃｅｒａｔｉｎｇ ｔｉｍｅ）ｗｅｒｅ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｆｒｏｍ １０ｒｅｌｅｖａｎｔ
ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｂｙ ｓｉｎｇｌｅ ｆａｃｔｏｒ ｔｅｓｔ ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ Ｌ２５（５６）ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｔａｂｌｅ．Ｄａｔａ ｗｅｒｅ ａｓｓｅｓｓｅｄ ｗｉｔｈ ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ
ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＳＰＳＳ １７．０．Ｏｐｔｉｍｕｍ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓ ｗａｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ．Ｔｈｅ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ
ｅｘｔｒａｃｔ ｗａｓ ｍｅａｓｕｒｅｄ ｂｙ ＨＰＬＣ ａｎｄ ｉｔｓ ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇ ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ ｈｙｄｒｏｘｙｌ ｒａｄｉｃａｌｓ（·ＯＨ）ａｎｄ ｏｘｙｇｅｎ ｆｒｅｅ
ｒａｄｉｃａｌｓ（Ｏ２－·）ｗｅｒｅ ａｌｓｏ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ．Ｔｈｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉ－
ｔｉｏｎｓ ｗｅｒｅ ｔｈａｔ ｖｏｌｕｍｅ ｆｒａｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ａｌｃｏｈｏｌ ｗａｓ ６５％，ｔｉｍｅ ｏｆ ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ ｗａｓ ２０ｍｉｎ，ｓｏｌｉｄ／ｌｉｑｕｉｄ ｒａｔｉｏ ｗａｓ
１５∶１，ｒｅｆｌｕｘｉｎｇ ｔｉｍｅ ｗａｓ ２．５ｈ，ｔｈｅ ｐＨ ｏｆ ｌｅａｃｈ ｌｉｑｕｏｒ ｗａｓ ８ａｎｄ ｍａｃｅｒａｔｉｎｇ ｔｉｍｅ ｗａｓ ４ｈ．Ａｌｋａｌｏｉｄ ｃｏｎ－
ｔｅｎｔ ｗａｓ ９．２７９４％ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ．Ｔｈｅ ５８．７０％ａｎｄ ４９．２６％ｆｒｅｅ ｒａｄｉｃａｌｓ（ｂｏｔｈ·ＯＨ ａｎｄ
Ｏ２－·）ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｓｃａｖｅｎｇｅｄ（ＩＣ５０ｗｅｒｅ ２３．５０ａｎｄ １．７５ｍｇ·ｍＬ－１）ｗｈｅｎ ａｌｋａｌｏｉｄ ｃｏｎｔｅｎｔ ｗｅｒｅ ２５．０ａｎｄ １．８
ｍｇ·ｍＬ－１，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅｓｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ａｌｓｏ ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓ ｗａｓ ｓｉｍ－
ｐｌｅ，ｈｉｇｈ ｄｅｐｅｎｄａｂｉｌｉｔｙ，ｈｉｇｈ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｒａｔｅ ａｎｄ ｈｉｇｈ ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇ ｒａｔｅ ｏｆ ｆｒｅｅ ｒａｄｉｃａｌ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｄｉｃｒａｎｏｓｔｉｇｍａ ｌｅｐｔｏｄｕｍ（Ｍａｘｉｍ．）Ｆｅｄｄｅ；Ｉｓｏｃｏｒｙｄｉｎｅ；Ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｄｅｓｉｇｎ；Ｆｒｅｅ ｒａｄｉｃａｌ
红茂草（Ｄｉｃｒａｎｏｓｔｉｇｍａ ｌｅｐｔｏｄｕｍ （Ｍａｘｉｍ．）
Ｆｅｄｄｅ）属罂粟科（Ｐａｐａｖｅｒａｃｅａｅ）秃疮花属二年生或
多年生草本植物，又名秃疮花、秃子花、勒马回［１］。
生长于海拔６００～１３００ｍ 的草坡、丘陵、路边、田
埂、屋顶等处。在甘肃省天水、陇南地区秦岭山脉、
渭 水流域分布广泛。该草味苦、涩，性凉，可全草入
收稿日期：２０１１－０９－０６；修回日期：２０１１－１１－０１
基金项目：甘肃省中医药管理局基金项目（ＧＺＫ－２０１０－２０）资助
作者介绍：赵强（１９８２－），男，甘肃天水人，博士研究生，研究方向为动物胚胎工程与中兽医医药工程，Ｅ－ｍａｉｌ：ｚｈａｏｑ２０００＠１６３．ｃｏｍ；＊通信
作者Ａｕｔｈｏｒ ｆｏｒ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅ，Ｅ－ｍａｉｌ：ｗａｎｇｔｐ００２＠１６３．ｃｏｍ
草 地 学 报 第２０卷
药，有抗炎、抑菌、消肿止痛、清热解毒等功效［２］。
研究表明，红茂草之所以有广泛的生物学活性，
主要是因为其含有多种异喹啉类生物碱［２～４］。在临
床试验中发现红茂草生物碱对结核病和窦道溃疡有
效率达９０％以上，有抗溶血、提高心肌细胞功能、保
护受损肝细胞、提高机体免疫力等药理作用，且安全
无毒副作用［４～６］。
本试验以红茂草中的主要生物碱异紫堇碱为指
标，通过正交试验设计，优选建立了红茂草生物碱最
佳提取工艺模式，并考察了该生物碱清除自由基作
用，为红茂草资源的深层次开发和利用提供一定的
理论依据。
１ 材料与方法
１．１ 试验材料
１．１．１ 主要仪器 Ａｇｉｌｅｎｔ １１００高效液相色谱仪
（Ａｇｉｌｅｎｔ公司）、ＲＥ５２－９９旋转蒸发仪（上海亚荣生
化仪器厂）、ＵＶ－７５１ＧＤ紫外－可见光分光光度计
（上海分析仪器厂）、ＫＱ－５００Ｄ数控超声波清洗器
（昆山市超声仪器有限公司）、ＡＢ１０４－Ｓ电子分析天
平（瑞士梅特勤公司）、索氏提取器。
１．１．２ 药物及试剂 红茂草采自甘肃省小陇山林
区，由天水师范学院王廷璞研究员鉴定。经自然风
干、粉碎，过８０目筛。异紫堇碱标准品（美国Ｓｉｇｍａ
化学公司）、乙腈（上海陆忠工贸有限公司、色谱纯）、
磷酸二氢钠、９５％乙醇、双氧水、邻苯三酚、水杨酸、
（ＮＨ４）２Ｆｅ（ＳＯ４）２·６Ｈ２Ｏ、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ缓冲液，其余
试剂均为国产或进口分析纯。
１．２ 试验方法
１．２．１ 红茂草生物碱提取工艺 称取红茂草粉末
１０．０ｇ，选取乙醇体积分数、液料比、浸泡时间、回流
作用时间、超声波作用功率、超声波作用温度、超声
波作用时间、浸提液ｐＨ 值、浸提次数、浸提液作用
温度共１０个单因素水平进行测定。首先固定液料
比１４ｍＬ·ｇ－１、浸泡时间１８ｈ、回流作用时间２．５
ｈ、超声波作用功率３００Ｗ、超声波作用温度４５℃、
超声波作用时间２５ｍｉｎ、浸提液ｐＨ＝５、浸提次数１
次，减压浓缩时浸提液作用温度４０℃，考察乙醇体
积分数为６０％，６５％，７０％，７５％，８０％，８５％，９０％
时对提取效果的影响。然后将优选的最佳乙醇体积
分数做为固定数值，依次选取考察液料比为１２∶１，
１３∶１，１４∶１，１５∶１，１６∶１，浸泡时间为０，６，１２，
１８，２４，３０ｈ，回流作用时间为１．５，２．０，２．５，３．０，
３．５ｈ，超声波作用功率为２００，２５０，３００，３５０，４００
Ｗ，超声波作用温度２５℃，３５℃，４５℃，５５℃，６５℃，
超声波作用时间为１５，２０，２５，３０，３５ｍｉｎ，浸提液
ｐＨ值为２，３，４，５，６，７，８，浸提次数为１，２，３，４次，
减压浓缩时浸提液作用温度为２０℃，３０℃，４０℃，
５０℃，６０℃时对提取效果的影响。将每次优选后的
最佳条件固定，再逐次筛选其余最佳条件，直至结
束。
１．２．２ 生物碱溶液的制备 在装有提取物的锥形
瓶中加入少许活性炭脱色，静置过夜，抽滤，将滤液
按编号装入容量瓶，并定容至５０ｍＬ，静置。
１．２．３ 样品含量的测定
１．２．３．１ 异紫堇碱标准曲线的绘制 准确配制
０．５ｍｇ·ｍＬ－１异紫堇碱标准品溶液１００ｍＬ，依次
量取１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０，１１ｍＬ，分别置于１００
ｍＬ容量瓶中，加无离子水稀释至１００ｍＬ，摇匀，使
之为５，１０，１５，２０，２５，３０，３５，４０，４５，５０，５５μｇ·ｍＬ
－１
的梯度溶液，以三重蒸馏水为空白，选取ＯＤ２１０值进
行测定［７，８］。以浓度Ｃ（μｇ·ｍＬ
－１）为横坐标，吸光
值Ａ为纵坐标，绘制标准曲线。
１．２．３．２ 样品含量的测定 将２５个５０ｍＬ容量
瓶中的提取液稀释后测定其吸光值，对照标准曲线，
得出提取液中生物碱的浓度，最后计算出红茂草样
品中生物碱提取得率［８］。
红茂 草 样 品 中 生 物 碱 提 取 得 率 （％）＝
提取液总体积（ｍＬ）×生物碱浓度（ｍｇ·ｍＬ－１）×１００
１０００×样品质量（ｇ）
１．２．４ ＨＰＬＣ测定红茂草提取液中生物碱含量
１．２．４．１ 色谱条件 色谱柱：Ｃ１８色谱柱 （１５０ｍｍ
×４．６ ｍｍ，５ μｍ）；流 动 相：Ｖ０．０３ｍｏｌ·Ｌ－１乙腈 ∶
Ｖ磷酸二氢钠＝２６∶７４；流速：１．０ｍＬ·ｍｉｎ－１；检测波
长：２１０ｎｍ；柱温：３０（±１）℃；进样量：２０μＬ
［９，１０］。
１．２．４．２ ＨＰＬＣ测定时使用的标准溶液配制 准
确配制０．１ｍｇ·ｍＬ－１的异紫堇碱标准溶液，将其
稀释成０．００２，０．００５，０．０１０，０．０１５，０．０２０，０．０２５
ｍｇ·ｍＬ－１等不同浓度的溶液，进行 ＨＰＬＣ检测。
１．２．５ 红茂草生物碱对自由基的清除作用
１．２．５．１ 还原能力测定 采用普鲁士兰法，取２
ｍＬ浓度为０．２５，０．５０，０．７５，１．００，１．２５，１．５０，
１．７５，２．００，２．２５，２．５０，２．７５，３．００ｍｇ·ｍＬ－１的红
茂草正交提取液，加入０．５ｍＬ ０．２ｍｏｌ·Ｌ－１磷酸
缓冲液和１％铁氰化钾，调ｐＨ＝６，混匀，在５０℃水
浴加热２０ｍｉｎ，加入２．５ｍＬ １０％三氯乙酸，混匀，
２７１
第１期 赵强等：红茂草生物碱正交提取工艺模式优化及清除自由基作用的研究
高速离心１０ｍｉｎ，取１ｍＬ上清液，加入１ｍＬ三重
蒸馏水和０．２ｍＬ ０．１％三氯化铁，混匀后于７００ｎｍ
处测定其吸光值［１１］。
１．２．５．２ 对·ＯＨ 清除率测定 通过Ｆｅｎｔｏｎ反
应，生成能氧化水杨酸的·ＯＨ，并产生在５１０ｎｍ
下有特征吸收的２，３－二羟基苯甲酸，用测定水杨酸
捕获·ＯＨ 所得到的产物来计算·ＯＨ 的清除
率［１２～１４］。取８支２５ｍＬ具塞试管，依次加入２ｍＬ
９ｍｍｏｌ·Ｌ－１ （ＮＨ４）２Ｆｅ（ＳＯ４）２ ·６Ｈ２Ｏ 溶 液，
２ｍＬ ９ｍｍｏｌ·Ｌ－１水杨酸－乙醇溶液，２ｍＬ浓度分
别为１５，２０，２５，３０，３５，４０，４５，５０ｍｇ·ｍＬ－１的红茂
草正交提取液和２ｍＬ ９ｍｍｏｌ·Ｌ－１ Ｈ２Ｏ２，摇匀置
于３７℃水浴中反应３０ｍｉｎ，在５１０ｎｍ处测定其吸
光值Ａ提取液。并按相同方法，测定不加提取液的吸
光值Ａ０，不加Ｈ２Ｏ２ 的吸光值Ａ样底。试验中均以三
重蒸馏水为空白，同时配置不同浓度的异紫堇碱标
准品溶液作为对照。
·ＯＨ清除率（％）＝Ａ０－
（Ａ提取液－Ａ样底）
Ａ０ ×１００％
其中：Ａ０ 是表示空白对照液的吸光值；Ａ提取液是
表示加入提取液后的吸光值；Ａ样底 是不加 Ｈ２Ｏ２ 的
吸光值。
１．２．５．３ 对Ｏ２－·清除率测定 邻苯三酚可以在弱
碱性（Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ缓冲液ｐＨ＝８．２）条件下发生自氧
化分解反应，生成 Ｏ２－·和在３２５ｎｍ处有特征吸收
峰的有色中间产物，Ｏ２－·清除剂可使邻苯三酚自氧
化过程受阻，故通过测定３２５ｎｍ处吸光值来计算
清除剂对Ｏ２－·的清除作用［１５～１７］。在所取试管中加
入４．５ｍＬ ５０ｍｍｏｌ·Ｌ －１ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ缓冲溶液，在
２５℃水浴中反应２０ｍｉｎ，分别加入１ｍＬ浓度为
０．６，０．８，１．０，１．２，１．４，１．６，１．８，２．０ｍｇ·ｍＬ－１的
红茂草正交提取液，再趁热分别加入０．４ｍＬ邻苯
三酚，摇匀置于２５℃下水浴４ ｍｉｎ，加入 １ ｍＬ
１０ｍｏｌ·Ｌ－１的 ＨＣｌ后终止反应，在３２５ｎｍ处测定
吸光值Ａ提取液，并按相同方法测定不加提取液的吸
光度Ａ０。试验中均以三重蒸馏水为空白，同时配置
不同浓度的异紫堇碱标准品溶液作为对照。
Ｏ２－·清除率（％）＝
Ａ０－Ａ提取液
Ａ０ ×１００％
２ 结果与分析
２．１ 绘制异紫堇碱标准曲线
根据异紫堇碱标准品系列浓度梯度在ＯＤ２１０的
吸光值，得回归方程：ｙ＝０．０１１０ｘ＋０．０６５２，Ｒ２＝
０．９９８９（ｎ＝１１），其标准曲线如图１所示，在５～５５
μｇ·ｍＬ
－１范围内呈良好的线性关系。
图１ 异紫堇碱标准曲线
Ｆｉｇ．１ Ｓｔａｎｄａｒｄ ｃｕｒｖｅ ｏｆ ｉｓｏｃｏｒｙｄｉｎｅ
２．２ 红茂草生物碱单因素提取试验
２．２．１ 乙醇体积分数对提取效果的影响 随着浸
提液乙醇体积分数的变化，在６５％时生物碱含量最
大；随着乙醇体积分数的增大，生物碱含量依次呈明
显下降趋势，此时乙醇体积分数对提取效果的影响
变得不显著；故选取适宜生物碱提取的乙醇体积分
数为６５％（图２）。
图２ 乙醇体积分数对提取效果的影响
Ｆｉｇ．２ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｅｔｈａｎｏｌ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｎ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｒｅｓｕｌｔｓ
２．２．２ 液料比对提取效果的影响 随着液料比的
增加，生物碱的含量也随之增大；当液料比为１５∶１
时生物碱含量达到最大值；故选取适宜生物碱提取
的液料比为１５∶１（图３）。
２．２．３ 浸泡时间对提取效果的影响 使用６５％乙
醇浸泡时间在６～１０ｈ时，生物碱含量达到最大峰
值；当浸泡时间超过１２ｈ后，随着浸泡时间的延长，
生物碱含量迅速降低。故选取适宜生物碱提取的浸
泡时间为８ｈ（图４）。
３７１
草 地 学 报 第２０卷
２．２．４ 回流作用时间对提取效果的影响 使用索
氏提取器回流作用时间为２．５ｈ时，生物碱含量呈
明显单一峰值，故选取适宜生物碱提取的回流作用
时间为２．５ｈ（图５）。
图５ 回流作用时间对提取效果的影响
Ｆｉｇ．５ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｒｅｆｌｕｘ ｔｉｍｅ ｏｎ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｒｅｓｕｌｔｓ
２．２．５ 超声波作用功率对提取效果的影响 当超
声波作用功率为３００Ｗ时，生物碱含量呈明显单一
峰值，故选取适宜生物碱提取的超声波作用功率为
３００Ｗ（图６）。
图６ 超声波作用功率对提取效果的影响
Ｆｉｇ．６ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ ｐｏｗｅｒ ｏｎ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｒｅｓｕｌｔｓ
２．２．６ 超声波作用温度对提取效果的影响 超声
波作用温度在２５～５５℃时，生物碱含量随温度的升
高而增加，并达到最大峰值；当温度超过５５℃后，生
物碱含量随温度升高而减小。故选取适宜生物碱提
取的超声波作用温度为５５℃（图７）。
图７ 超声波作用温度对提取效果的影响
Ｆｉｇ．７ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｏｎ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｒｅｓｕｌｔｓ
２．２．７ 超声波作用时间对提取效果的影响 超声
波作用时间在１５～３０ｍｉｎ时，生物碱含量随时间的
增加而增大，并达到最大峰值；当时间超过３０ｍｉｎ
后，生物碱含量随时间增加而减小。故选取适宜生
物碱提取的超声波作用时间为３０ｍｉｎ（图８）。
２．２．８ 浸提液ｐＨ值对提取效果的影响 当６５％
乙醇浸提液ｐＨ值在２～６时，生物碱含量随ｐＨ值
的增加而增大，并达到最大峰值；当ｐＨ值超过６以
后，生物碱含量随ｐＨ 值增加而减小。故选取适宜
生物碱提取的浸提液ｐＨ＝６（图９）。
２．２．９ 浸提次数对提取效果的影响 浸提次数为
１次时，生物碱含量最大，然后呈明显下降趋势；随
着浸提次数的增加，生物碱含量基本趋近于零。表
４７１
第１期 赵强等：红茂草生物碱正交提取工艺模式优化及清除自由基作用的研究
明生物碱浸提次数为１次时效果最佳（图１０）。
２．２．１０ 减压浓缩时浸提液作用温度对提取效果的
影响 当减压浓缩时浸提液作用温度为２０～５０℃
时，生物碱含量随温度的升高而增加，并达到最大峰
值，当温度超过５０℃后，生物碱含量随温度升高呈
明显减小趋势，故选取适宜生物碱提取的减压浓缩
时浸提液作用温度为５０℃（图１１）。
图１１ 浸提液作用温度对提取效果的影响
Ｆｉｇ．１１ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｏｎ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｒｅｓｕｌｔｓ
２．３ 红茂草生物碱正交提取试验
根据单因素试验结果进行极差分析，最终优选
出乙醇体积分数、超声波作用时间、液料比、回流时
间、浸提液ｐＨ值和浸泡时间，做为影响红茂草中生
物碱提取效果的主要考察因素，按照Ｌ２５（５６）正交表
进行正交试验，用标准曲线计算出提取液中生物碱
含量，用ＳＰＳＳ １７．０软件对其结果进行统计学比较
分析，得出最佳正交提取工艺模式。其正交试验结
果如表１～３所示。
对该正交试验结果直观分析表明，影响红茂草
中生物碱含量的主次因素和水平分别为Ｃ＞Ｅ＞Ｄ
＞Ａ＞Ｂ＞Ｆ，优 选 出 的 最 佳 提 取 工 艺 为
Ａ４Ｂ１Ｃ３Ｄ３Ｅ５Ｆ１，即乙醇体积分数６５％、超声波作用
时间２０ｍｉｎ、液料比１５∶１、回流时间２．５ｈ、浸提液
ｐＨ＝８、浸泡时间４ｈ。采用ＳＰＳＳ １７．０统计软件所
获数据显著性分析表明，正交试验因素对红茂草生
物碱含量的影响，仅Ｃ因素达显著水平（Ｐ＜０．０５），
其余Ｆ值均小于１，说明这些因素对提取率有影响，
但其试验水平的设定仍有调节空间。
２．４ 红茂草提取液中生物碱含量测定
ＨＰＬＣ检测波长选定在２１０ｎｍ，采用优化后的
正交提取工艺模式，提取红茂草中生物碱，将提取液
减压浓缩至无醇味，过滤静置。将异紫堇碱标准品
与提取的红茂草生物碱分别进行 ＨＰＬＣ检测，其色
谱图如图１２和１３所示。由图可知，将异紫堇碱标
准品系列的色谱峰面积Ｙ 对进样浓度进行线性回
归分析，得回归方程为ｙ＝１０４６９９ｘ＋１６９．５７，Ｒ２＝
０．９９８７，线性范围为２．０～１００．０μｇ·ｍＬ
－１；异紫堇
碱标准品保留时间ｔＲ 的范围为５．４１０～５．５９３ｍｉｎ。
通过正交设计提取的红茂草生物碱样品在５．５８４
ｍｉｎ时出峰，峰形对称，与标样接近，经计算其中异
紫堇碱含量为９．２７９４％ 。
５７１
草 地 学 报 第２０卷
表１ 红茂草生物碱正交提取试验因素水平表
Ｔａｂｌｅ １ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｆａｃｔｏｒｓ ｏｆ ａｌｋａｌｏｉｄ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｆｒｏｍ Ｄ．ｌｅｐｔｏｄｕｍ
水平
Ｌｅｖｅｌ
因素Ｆａｃｔｏｒｓ
Ａ乙醇体积分数
Ｅｔｈａｎｏｌ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ／％
Ｂ超声时间
Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ ｔｉｍｅ／ｍｉｎ
Ｃ液料比
Ｌｉｑｕｉｄ ｔｏ ｓｏｌｉｄ ｒａｔｉｏ／ｍＬ·ｇ－１
Ｄ回流时间
Ｒｅｆｌｕｘ ｔｉｍｅ／ｈ
Ｅ浸提液ｐＨ值
ｐＨ ｏｆ ｅｘｔｒａｃｔｓ
Ｆ浸泡时间
Ｍａｃｅｒａｔｉｎｇ ｔｉｍｅ／ｈ
１ ５０ ２０ １３∶１ １．５ ４ ４
２ ５５ ２５ １４∶１ ２．０ ５ ６
３ ６０ ３０ １５∶１ ２．５ ６ ８
４ ６５ ３５ １６∶１ ３．０ ７ １０
５ ７０ ４０ １７∶１ ３．５ ８ １２
表２ 红茂草生物碱正交提取试验结果分析表
Ｔａｂｌｅ ２ Ｒｅｓｕｌｔ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａｌｋａｌｏｉｄ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｆｒｏｍ Ｄ．ｌｅｐｔｏｄｕｍ
编号Ｎｏ． Ａ Ｂ Ｃ Ｄ Ｅ Ｆ 含量Ｃｏｎｔｅｎｔ／％
１ １ １ １ １ １ １ １．１６１０
２ １ ２ ２ ２ ２ ２ ０．８４５５
３ １ ３ ３ ３ ３ ３ １．１８８６
４ １ ４ ４ ４ ４ ４ １．００６６
５ １ ５ ５ ５ ５ ５ ０．８７１９
６ ２ １ ２ ３ ４ ５ １．１６５２
７ ２ ２ ３ ４ ５ １ １．２２６４
８ ２ ３ ４ ５ １ ２ １．００６７
９ ２ ４ ５ １ ２ ３ ０．４９２３
１０ ２ ５ １ ２ ３ ４ １．１１６５
１１ ３ １ ３ ５ ２ ４ ０．９９６９
１２ ３ ２ ４ １ ３ ５ ０．９５１７
１３ ３ ３ ５ ２ ４ １ ０．８６９０
１４ ３ ４ １ ３ ５ ２ １．１６０５
１５ ３ ５ ２ ４ １ ３ １．０２３６
１６ ４ １ ４ ２ ５ ３ １．２１８５
１７ ４ ２ ５ ３ １ ４ １．０２４３
１８ ４ ３ １ ４ ２ ５ １．１３７８
１９ ４ ４ ２ ５ ３ １ １．００５４
２０ ４ ５ ３ １ ４ ２ １．１５７１
２１ ５ １ ５ ４ ３ ２ ０．８５６２
２２ ５ ２ １ ５ ４ ３ １．００４２
２３ ５ ３ ２ １ ５ ４ ０．９１４７
２４ ５ ４ ３ ２ １ ５ １．０６０４
２５ ５ ５ ４ ３ ２ １ １．０３０４
Ｋ１ １．０１４７ １．０７９５ １．１１６０ ０．９３５３ １．０２５５ １．０５８４
Ｋ２ １．００１４ １．０１０４ ０．９９０９ １．０２１９ ０．９００５ １．００５２
Ｋ３ １．０００３ １．０２３３ １．１２５９ １．１１３８ １．０２３７ ０．９８５４
Ｋ４ １．１０８６ ０．９４５０ １．０４２７ １．０５０１ １．０４０４ １．０１１８
Ｋ５ ０．９７３２ １．０３９９ ０．８２２７ ０．９７７０ １．０７８４ １．０３７４
Ｒ ０．１３５４ ０．１３４５ ０．３０３２ ０．１７８５ ０．１７７９ ０．０７３０
表３ 红茂草生物碱正交提取试验方差分析表
Ｔａｂｌｅ ３ Ｔｈｅ ｖａｒｉａｎｃｅ ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｔａｂｌｅ ｏｆ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ａｌｋａｌｏｉｄ ｆｒｏｍ Ｄ．ｌｅｐｔｏｄｕｍ
误差来源
Ｅｒｒｏｒ ｓｏｕｒｃｅ
ｄｆ ＳＳ Ｓ２ Ｆ
差异显著性水平
Ｌｅｖｅｌ ｏｆ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ
Ａ ４ ５．４０２０ １．３５００ ０．５２９０
Ｂ ４ ４．８３２０ １．２０８０ ０．４７３７
Ｃ ４ ３０．３５０ ７．５８７０ ２．９７５３＊ Ｐ＜０．０５
Ｄ ４ ９．３６３０ ２．３４１０ ０．９１８０
Ｅ ４ ９．６７１０ ２．４１８０ ０．９４７５
Ｆ ４ １．６３２０ ０．４１８０ ０．１６３８
误差Ｅｒｒｏｒ ２４ ６１．２４９１４ ２．５５２０４７３９９
注：＊ 表示差异显著 （Ｐ＜０．０５）
Ｎｏｔｅ：＊ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ（Ｐ＜０．０５）
６７１
第１期 赵强等：红茂草生物碱正交提取工艺模式优化及清除自由基作用的研究
２．５ 红茂草生物碱对自由基的清除作用
２．５．１ 红茂草生物碱还原能力测定 将含红茂草生
物碱正交提取液，以及异紫堇碱标准品进行还原能力
测定，吸光值越大则还原力越强，其结果如图１４所
示。红茂草生物碱和异紫堇碱标准品都具有一定的
还原能力，当浓度达到１．５ｍｇ·ｍＬ－１时，曲线走势趋
于水平，说明二者还原能力基本稳定。测定待测物的
还原能力，为其清除自由基提供了可能。
图１４ 红茂草生物碱还原能力
Ｆｉｇ．１４ Ｒｅｄｕｃｉｎｇ ｃａｐａｃｉｔｙ ｏｆ ａｌｋａｌｏｉｄｓ ｆｒｏｍ Ｄ．ｌｅｐｔｏｄｕｍ
２．５．２ 对·ＯＨ的清除效果 将红茂草生物碱对
·ＯＨ自由基进行清除效果试验，以异紫堇碱标准
品为对照，结果如图１５所示。在２０～２５ｍｇ·ｍＬ－１
浓度范围内，红茂草生物碱对·ＯＨ清除率从１５．９％
增加到５８．７％，增幅达４１．８％；在２５．０ｍｇ·ｍＬ－１以
后，随着生物碱浓度的升高，对·ＯＨ的清除率逐渐
降低，其清除·ＯＨ的半数清除浓度（ＩＣ５０）为２３．５
ｍｇ·ｍＬ－１。
图１５ 红茂草生物碱对·ＯＨ的清除作用
Ｆｉｇ．１５ Ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇ·ＯＨ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ
ｏｆ ａｌｋａｌｏｉｄｓ ｆｒｏｍ Ｄ．ｌｅｐｔｏｄｕｍ
２．５．３ 对 Ｏ２－·的清除效果 将红茂草生物碱对
７７１
草 地 学 报 第２０卷
Ｏ２－·自由基进行清除效果试验，以异紫堇碱标准品
做为对照，其结果如图１６所示。由图可知，在０～
０．８ｍｇ·ｍＬ－１浓度范围内，红茂草生物碱对 Ｏ２－·
的清除作用基本保持不变，清除率小于１０．０％；在
０．８～１．８ｍｇ·ｍＬ－１时，对Ｏ２－·的清除率随着生物
碱浓度的升高而显著增大，其清除率可达４９．２６％；
当浓度大于１．８ｍｇ·ｍＬ－１时，其清除率呈下降趋
势；其清除Ｏ２－·的ＩＣ５０为１．７５ｍｇ·ｍＬ－１。
图１６ 红茂草生物碱对Ｏ２－·的清除作用
Ｆｉｇ．１６ Ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇ Ｏ２－·ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ
ｏｆ ａｌｋａｌｏｉｄｓ ｆｒｏｍ Ｄ．ｌｅｐｔｏｄｕｍ
３ 讨论与结论
使用正交试验设计，可以减少试验次数，达到较
全面地反映各因素水平的效果［１８］。当乙醇体积分
数为６５％时，可以降低红茂草中的油脂、糖类等物
质的析出，减小生物碱本身的溶解性。改变浸提液
的ｐＨ，可使红茂草中部分生物碱转化成其相应的
生物碱盐，增大其溶解度。浸泡时间过长不但将生
物碱溶出，也会将糖类和油脂等溶出，使提取效果下
降；长时间浸泡会使生物碱提取周期增大，不利于工
艺模式的建立。超声波的振动作用能够使整个生物
体及生物细胞壁破裂，加快细胞内物质的溶解，提高
扩散速度和提取效率。通过对一系列影响因素的考
察，确定了红茂草中生物碱最佳正交提取工艺模式
为Ａ４Ｂ１Ｃ３Ｄ３Ｅ５Ｆ１，即乙醇体积分数６５％、超声波作
用时间２０ｍｉｎ、液料比１５∶１、回流时间２．５ｈ、浸提
液ｐＨ＝８、浸泡时间４ｈ。采用ＳＰＳＳ １７．０统计软
件对正交结果进行分析，发现液料比对提取率的影
响最显著。
研究表明清除体内过剩的自由基，可以避免因
自由基过量引起的酶失活、蛋白质变性、ＤＮＡ 断
裂、多糖降解、细胞解体、损伤生物膜结构、以及机体
病变和死亡 ［１４，１５］。通过本试验发现，红茂草生物碱对
·ＯＨ和Ｏ２－·自由基有明显的清除作用，其清除率为
５８．７０％和４９．２６％，ＩＣ５０为２３．５０和１．７５ｍｇ·ｍＬ－１，
且对Ｏ２－·的清除作用比对·ＯＨ显著，表明红茂草
生物碱具有一定的抗氧化性。
红茂草在甘肃省广泛分布于秦岭山区、渭河流
域，有清热、消肿、解毒等功效。本试验通过对红茂
草生物碱正交提取工艺模式和抗氧化活性的研究，
从而拓展了该植物资源新的用途，为其进一步利用
提供了可能。
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（责任编辑 吕进英）
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