全 文 ：文章编号: 1007-0435( 2006) 01-0009-06
分群分析法获得与多花黑麦草抗叶班病
基因连锁的 EST-CAPS标记
丁成龙1, 2 , 沈益新1* , 顾共如2 ,三浦优一3
( 1. 南京农业大学动物科技学院, 南京 210095; 2. 江苏省农业科学院畜牧研究所, 南京 210014;
3. 日本畜产种子协会饲料作物研究所, 枥木 329-2742)
摘　要: 利用多花黑麦草叶斑病抗性和敏感个体杂交构建 F1 分离群体, 采用分群分析法( bulked segr egant ana ly sis,
BSA ) ,通过多花黑麦草表达序列标签( expr essed sequence t ag, EST )的 PCR 扩增和扩增产物的限制性内切酶酶切多态
性( cleaved amplified polymo rphic sequence, CAPS)筛选, 获得一个同多花黑麦草草抗叶斑病紧密连锁的 EST-CAPS 标
记 p56。对照多花黑麦草细胞质雄性不育( CMS)群体构建的遗传连锁图, 该EST -CAPS 标记位于多花黑麦草的第5 遗传
连锁群( LG5)。对 cDNA 文库中对应于标记位点 p56 的 EST 序列片段分析和基因库搜索结果表明,该 EST 所编码的氨
基酸序列同大麦天冬酰胺合成酶基因 H vA S1 和 H v AS 2 的部分氨基酸序列片段同源性很高, 推测位点 p56 所处的基因
为编码多花黑麦草天冬酰胺合成酶基因。该分子标记可用于多花黑麦草分子标记辅助育种。
关键词: 多花黑麦草; 叶班病; 分子标记; 表达序列标签( EST ) ; 酶切扩增片段多态性序列( CAPS)
中图分类号: S 812; Q943　　　　文献标识码: A
Identif ication of an EST-CAPS Marker Linking to the Resistance Gene
of Italian Ryegrass Gray-Leaf-Spot Disease by Bulked Segregant Analysis
DING Cheng-long
1, 2 , SHEN Yi-x in
1* , GU Hong-r u
2 , Yuichi M iura
3
( 1. C ol lege of Animal Science an d T echnology , Nanjing Agriculture U nivers ity , Nanjing, Jiangsu Province 210095, Ch ina;
2. Ins titute of Animal Science, Jian gsu Academ y of A gricul tu ral S cience, Nanjing , Jiangsu Province 210014, Ch ina;
3. Ins titute of Forage Crop , Japan Grass lan d Farming and Forage Seed Associat ion, T och igi 329-2742, Japan )
Abstract: An F1 separat ion population was formed by crossing the gray-leaf-spot resistant individual of Italian
ryeg rass w ith the susceptible one. Expressed sequence tag ( EST ) o f Italian ry eg rass w ere amplified f rom the
gDNA of tw o parents and F1 populat ion and dig ested w ith endonucleases to detect the polymo rphisms by the
method of bulked segregant analysis( BSA ) . An expressed sequence tag ( EST ) -cleaved amplif ied polymorphic
sequence( CAPS) marker, p56, w hich linked to g ray leaf disease resistance gene of Italian r yegrass w as ident i-
fied. Compared to the reference genetic linkage maps of Ital ian r yegrass const ructed f rom cy toplasmic male
sterility, the marker p56 w as mapped on the fif th linkage group( LG5) . T he deduced amino acid sequence of
p56 EST fr om cDNA library w as highly ident ical to that o f g ene H vA S1 and H vA S2 which coded aspar ag ine
synthetase fr om barley . T he resul ts revealed that the EST putat ively coded asparag ine synthetase f rom Italian
ryeg rass. T he molecular marker could be used for marker assistance select ion in Ital ian r yegrass breeding .
Key words : Italian ryegr ass; Gray leaf spot ; Mo lecular marker ; Expressed sequence tag ( EST ) ; Cleaved ampli-
fied polymor phic sequence( CAPS)
　　多花黑麦草( L ol ium multif lourum Lam. )为禾本
科黑麦草属中最有利用价值的种之一,适应性广、产草
量高、品质好,在我国江苏、浙江、江西、湖北、湖南、四
川、安徽等省均有大面积种植。随着栽培面积的扩大,
收稿日期: 2005-03-04; 修回日期: 2005-06-29
基金项目: 中日合作项目“饲料作物基因组解析”,日本竞马协会提供资助。
作者简介: 丁成龙( 1969-) , 男,副研究员,现为南京农业大学在读博士生,从事牧草育种及栽培利用研究工作, 发表研究论文 20余篇, E-mail:
dingcl@ jaas . ac. cn; * 通讯作者 Author for correspondce, E-mail: yxsh en@ njau. edu. cn
第 14卷　第 1期
　Vo l. 14　 No . 1
草　地　学　报
ACT A AGRESTIA SIN ICA
　　　2006年　 3 月
　March　 2006
多花黑麦草病害的发生以及由病害所带来的危害也愈
来愈严重。其中叶斑病( Py ricularia gr isea)是一种广
泛发生的病害,早在 1971年美国就有黑麦草叶斑病发
生的报道 [ 1, 2] , 其发病症状非常类似于水稻的稻瘟病,
不仅严重影响产草量,而且发病严重时还可使整个草
地毁灭[ 1]。随着畜牧业的发展, 对多花黑麦草高产、优
质、抗病新品种的需求越来越迫切,多花黑麦草抗病育
种已越来越受到重视 [ 3] , 但常规抗病品种的选育受环
境影响较大, 不够准确,而采用分子标记辅助选择育种
可以克服以上缺点,选择效率大大提高。
随着分子技术的发展, 已开发出多种分子标记方
法, 如 RFLP、RAPD、AFLP、SSR、SCAR、CAPS 等,
其中酶切扩增片段多态性序列( CAPS)技术又称为
PCR-RFLP,具有较多优点,如引物与限制酶组合非常
多;在真核生物中, CAPS 标记呈共显性,可区分纯合
基因型和杂合基因型; 所需 DNA 量极少,结果稳定可
靠,重复性好以及可实现自动化操作等, 因此 CAPS
标记技术越来越得到广泛的应用。目前 CAPS 技术已
被成功地用于马铃薯 Beta 基因 [ 4]、小麦抗条锈病 Yr5
基因[ 5]以及甜菜抗线虫基因 [ 6]等的分子标记。但分子
技术在牧草中的应用研究尤其是在牧草育种中的应用
研究甚少[ 7, 8] , 本研究旨开开发多花黑麦草抗叶斑病基
因的EST -CAPS 标记,为多花黑麦草抗叶斑病分子标
记辅助抗病育种和抗病基因的克隆提供方便。
1　材料与方法
1. 1　病菌分离、培养及 F1分离群体的构建
从日本山口县农业试验场田间采集多花黑麦草叶
斑病病株叶片经分离培养, 先在 PDA 培养基中培养,
取其菌丝移植于燕麦培养基关置于 25℃、遮光, 14 d
后,以无菌水冲去培养基表面的菌丝, 保持 25℃,白炽
灯照射形成孢子, 孢子用于接种试验。
试验所用的多花黑麦草品种为抗叶斑病品种
Sachiaoba 和感病品种 M inam iaoba (日本山口县农业
试验场提供)。每个品种各选5株进行品种间成对套袋
正反交,分别采收 F1代种子。因多花黑麦草为自交不
亲和、异花授粉植物,个体遗传组成处于高度杂合状
态, 可以直接利用 F1 代群体进行抗病基因的遗传
标记[ 9]。
1. 2　F1分离群体接种鉴定
对正反交的 10个 F1群体进行各 20 株接种预备
试验, 调查 F1 群体抗、感病分离情况, 选取 F1群体
抗、感病分离情况较理想的杂交组合作为分离群体进
行分析,选好群体后对所有个体进行叶斑病致病菌接
种鉴定。
鉴定过程: 种子发芽后移植于温室盆钵 (长 15
cm ,宽 5. 5 cm ,深 15 cm )中,每钵移植 5株,待幼苗长
至 14 d时将病菌孢子调制成含孢子约 2×105 个/ m l
的悬浊液用喷雾器喷雾, 每钵喷撒悬浊液 1 m l, 接种
后用塑料布将植株覆盖结露处理, 置于 25℃的暗房中
24 h。然后将盆钵移至 25℃下每昼夜光照 16 h、黑暗 8
h 的培养箱中,定时浇水。接种 7 d后评定发病情况,
发病情况评定为 0～3级: 0级为叶片及叶鞘均无病
斑; 1 级为叶片上有褐色斑点型病斑, 但病斑伸长停
止; 2级为一张叶片上有 1-2个灰色病斑; 3级为一张
叶片上有病斑 3个以上,病斑之间相连,叶片枯死。其
中 0级、1级为抗病型, 2级、3级为感病型。
1. 3　DNA提取及 EST-CAPS分析
DNA 的抽提参照CT AB法 [ 10]。根据多花黑麦草
cDNA 文库中 cDN A 序列设计 STS 引物 396 对(由日
本畜产种子协会饲料作物研究所提供) , ST S 引物对两
亲本基因组 DNA 进行PCR扩增, 扩增条件: 94℃变性
5 min, 接着进入循环, 分别为 94℃变性 1 min, 60 或
65℃复性 1 min, 72℃延长 2 min, 共 40个循环, 最后
72℃延长 4 min并保持在4℃。扩增产物经 15%琼脂糖
凝胶电泳和 EB染色检查扩增结果,选择在双亲中只扩
增出单一且相同大小条带的 PCR 扩增产物进行限制性
内切酶酶切, 限制性内切酶分别为 BamH Ⅰ、BalⅠ、
BglⅡ、DraⅠ、H aeⅢ、HhaⅠ、M spⅠ、RsaⅠ、S alⅠ和
EcorⅤ共10种。酶切产物经2. 0%琼脂糖凝胶电泳, EB
染色和紫外灯下检测多态性。以分群分析法( BSA) [ 9]应
用于 F1分离群体中进行引物筛选,首先分别取 10个高
抗和 10个感病个体利用上述 ST S 引物分别进行 PCR
扩增、酶切和多态性检测,出现比较一致的分离结果后
再加大抗病、感病分析群体进一步分析。
另一细胞质雄性不育群体( CM S 群体, 日本草地
试验场提供)作为参照群体,用于 EST -CAPS 标记在
基因组中的分布研究。
1. 4　EST的克隆、测序及序列分析
利用 T OPO T A 克隆工具将由 STS 引物扩增的
PCR产物直接克隆进 pCR4-T OPO质粒载体中,转化
克隆工具中的大肠杆菌 Mach1TM-T 1R 菌株, 接着于
克隆工具中的 S. O. C.介质中, 置于 37℃培养箱中培
养1 h,然后涂布于含有 X-Gal和氨苄青霉素的培养基
中培养 8 h,挑取白色单克隆再于 LB培养基中培养过
夜,随后进行质粒 DNA 提取, 质粒 DNA 的抽提参照
刘贤华等人[ 11]的方法进行。质粒 DNA 扩增后, 扩增产
物经 Microcon过滤除去盐和过剩 dNTP,再以经荧光
10 草　地　学　报 第 14卷
标记过的正向引物 M13M 4及双脱氧核苷酸扩增进行
单向扩增测序,测序于 Li-cor 测序仪中进行。所得序
列利用软件 Sequencer 进行编辑以及通过数据库
NCBI ( ht tp: / / www . ncbi. nlm. nih. g ov/ BLAST/ )中
tblastx 程序进行相似性搜索和分析。
2　结果与分析
2. 1　抗、感病鉴定和分离群体选择
5株抗病和 5 株感病个体成对杂交的 10 个正反
交 F1 群体中, 经致病菌接种, 鉴定结果表明 A4
( Sachiaoba, 抗病)为母本, B5( M inam iaoba, 感病)为
父本的 F1群体抗、感病个体分离比例为 1∶1(表 1) ,
而其它杂交组合的 F1群体在较苛刻的发病条件和致
病菌处理下表现为抗病个体数极少或几乎没有完全抗
病的个体,最终选择 A4/ B4杂交群体用作抗叶斑病基
因的分子标记研究。从 F1发病情况的分离结果判定
该病由单基因所控制。
表 1　A4/ B5 F1 群体抗感病性分离情况
T able 1　Separ ation condition o f F1 population A4 cro ss B5
评点
Score
评价
Rem ark
个体数
Number of individuals
合计
Total
0 抗病 Disease resis tant 69
1 抗病 Disease resis tant 11 80
2 感病 Disease s ens itive 14
3 感病 Disease s ens itive 68 82
2. 2　STS引物筛选和 EST-CAPS标记
396对ST S 引物分别应用于 A4、B5基因组DNA
的PCR扩增,其中274对引物扩增出单一且大小相等的
条带, 74对扩增出多带, 48对表现为单个亲本有扩增带,
而另一亲本不能扩增。本研究中单个亲本出带的引物在
群体中表现扩增不稳定,而多带类型不易分析,该两类引
物均舍弃弃,而只利用274对引物进行ET S扩增及酶切
多态性检测。多态性检测步骤采用 STS 引物( p318)对
父、母本及F1基因组PCR扩增,以及扩增产物经限制性
内切酶( RsaⅠ)酶切后再经图谱分析(图 1)。
图 1　引物 p318扩增亲本及 F1 基因组 DNA 的 PCR 扩增图谱(上)和扩增产物经 Rsa Ⅰ酶切后电泳图谱(下)
Fig. 1　The PCR amplified results o f the gDNA o f two parents and F1 indiv iduals w ith primer p318( up) ,
and the electr ophor esis results of the PCR product s dig ested w it h endonuclease Rsa Ⅰ( down)
M :标准 DNA; Pr:抗病亲本; Ps:感病亲本; 1-6: F1个体
M: ladder DNA; Pr: res istan t paren t; Ps: s uscept ible parent ; 1-6: in dividuals of F1
　　利用分群分析法进行 EST 扩增和限制性内切酶
酶 切 多态 性 研究 发 现, 由引 物 p56 (正 向 5′-
TT CATCAACGAGGCAAT GAG, 反向 5′-GGAAA-
TT CAACCGAT CTCT GA ) PCR 扩增和 H ha Ⅰ酶切
后的带型分离结果同 F1 群体的抗、感病接种鉴定结
果高度一致, 亲本和 F1部分个体基因组 PCR扩增图
谱见图 2, PCR 扩增产物经 H ha Ⅰ酶切后图谱见图
3, 经连锁值计算,标记 p56同多花黑麦草抗叶斑病基
因紧密连锁, 连锁距离为 4. 35 cM。通过 CMS 群体所
构建的遗传连锁图的对比研究结果表明, 标记 p56 位
于多花黑麦草遗传连锁图的第 5连锁群 ( LG5) (图
4)。
11第 1期 丁成龙等:分群分析法获得与多花黑麦草抗叶班病基因连锁的E ST -CAPS标记
2. 3　p56位点DNA 序列分析
由引物 p56扩增抗病亲本基因组 DNA 并克隆和
测序(图 5) , 测序结果表明, 对应于抗、感病等位基因
序列长度存在差异, 其中对应于抗病的等位基因碱基
序列长度比感病长 104个碱基。另外在 953bp 的位置
存在限制性内切酶 H ha Ⅰ酶切位点, 这同在 F1群体
分析时观察到的 DNA 片段大小相一致。
图 2　引物 p56 扩增亲本及 F1 基因组 DNA的 PCR扩增图谱
Fig . 2　Amplified patterns of the gDNA o f tw o par ent s and F1 individuals w it h pr imer p56
M :标准 DNA; Pr:抗病亲本; Ps:感病亲本; 1-6: F1个体
M: ladder DNA; Pr: res istan t paren t; Ps: s uscept ible parent ; 1-6: in dividuals of F1
图 3　引物 p56 扩增亲本及 F1基因组 DNA 的 PCR 扩增产物经 Hha Ⅰ酶切后的图谱
F ig . 3　The elect ropho resis r esult of gDNA of t wo par ents and F1 indiv iduals amplified
fr om pr imer p56 and digested with endonuclease H ha Ⅰ
M:标准 DNA; Pr:抗病亲本; Ps:感病亲本; 1-8:抗病 F1个体; 9-16:感病F1个体
M: ladder DNA; Pr: res istant paren t; Ps: s uscept ible parent ; 1-8: r esis tant individuals of F1; 9-16: Suscept ible individ uals of F1
　　cDNA 文库中对应用于引物 p56的 EST 序列分
析和基因库( NCBI)搜索结果表明, 该 EST 所推导的
氨基酸序列同大麦编码天冬酰胺合成酶基因 H v AS 1
(基因库中编号 AF307145)和 H vas2( AY193714)的
氨基酸序列部分片段高度一致,其中 p56 EST 的氨基
酸序列同基因 H vA S1的氨基酸序列在连续的 213个
氨基酸中有 195 个完全相同, 相同率 91%; 而同
H vA S2基因相应的氨基酸序列对比,连续 165个氨基
酸序列的完全相同数达150个,相同率 90% (图 5)。根
据这一结果推测 p56 EST 可能为编码多花黑麦草天
冬酰胺合成酶基因。
3　讨论与结论
3. 1　多花黑麦草叶斑病病原同于水稻稻瘟病病原, 尽
管水稻稻瘟病已有较为深入的研究, 而从分子水平研
究多花黑麦草的抗病性未见报道。本研究开发出同多
花黑麦草抗叶斑病紧密连锁的共显性 EST -CAPS 标
记,并且定位于多花黑麦草的第 5连锁群, 将对多花黑
麦草抗叶斑病研究提供方便。结果表明由 p56 cDNA
序列推导的氨基酸序列同大麦天冬酰胺合成酶基因
H vA S1和 H vA S2的氨基酸序列部分片段高度同源,
而 H vA S1 和 H v AS 2 分别位于大麦的第 5 染色体
( 5H )的长臂和第3染色体的短臂( 3H ) [ 12]。Jones等 [ 13]
报道了多花黑麦草的第 5连锁群( LG5)同麦类的 5L、
水稻的第 9染色体以及第 2 染色体的部分具同线关
系。Chen等 [ 14]进行水稻和大麦的抗稻瘟病( Py ricular-
ia grisea Sacc. ; Py ricular ia oryz ae Cav . ; Magna-
porthe gr isea) QT L 位点的比较分析,大麦第五染色体
上的 QTL 位点同水稻的第 3、第 9 染色体上的抗病
QT L 位点相关联。所有这些研究结果将有助于黑麦草
叶斑病和水稻稻瘟病的相关性研究。
12 草　地　学　报 第 14卷
图 4　标记 p56 标于多花黑麦草第 5 遗传连锁群
Fig . 4　Marker p56 w as mapped on the fifth linkage
g ruop( LG5) of I talian ry egr ass
3. 2　和多花黑麦草叶斑病同属于灰梨孢菌浸染的水
稻抗稻瘟病的研究较为深入, 也培育出不少抗稻瘟病
品种,但由于病原菌的生理小种高度易变性,很多抗病
品种只在生产上应用几年甚至一、二年后即变成感病
品种。因此必须培育广谱和具有持久抗性的抗病品种,
育种方法上也相应的要求采取一些新的策略以达到抗
病基因的累积。T abien等[ 15]报道采用分子技术进行抗
病主效基因和 Q TL 的累积获得对真菌具有广谱和持
久抗性的材料, Hittalmani等[ 16]通过品种间的杂交和
利用分子标记辅助选择进行主效抗性基因的累积获得
具广谱抗性的抗稻瘟病品种。因此选育抗叶斑病多花
黑麦草抗叶斑病的抗原较少, 本研究中多花黑麦草品
种 Sachiaoba 为日本新近选育出的对叶斑病具中等抗
性的品种, 而对叶斑病具有较强抗性的品种较少[ 17]。
另外本研究中,由于缺乏致病菌的其它生理小种,因此
无法验证该抗病标记( p56)以及与该标记紧密连锁的
抗病基因同多花黑麦草叶斑病持久抗性的关系。
图 5　p56 EST 和大麦天冬酰胺合成酶 H vA S1、H v AS 2 在氨基酸水平上相似性比较
F ig . 5　Compar ison betw een the amino acid sequence of p56 EST and that of t he gene H vas1, H vA S 2 of bar ley
参考文献
[ 1]　Bain D C, Patel B N, Patel M V. Blas t of ryegr as s in Miss iss ippi
[ J] . Plant Dis. Rep. , 1972, 56: 210
[ 2]　Carver R B, Rush M C, Lindberg G D. An epiph ytot ic of rye-
grass blas t in Louis iana[ J] . Plant Dis. Rep. , 1972, 56: 157-159
[ 3]　Bonos S A, Kuris tin e C, Clark e B B, et al . Breeding p erennial
ryegras s for resis tance to gray leaf spot[ J ] . Crop Sci. , 2004, 44:
575-580
[ 4 ] 　Zh ang Y P, Stomm el J R. Development of SCAR and CAPS
markers link ed to the B eta gene in tomato[ J ] . C rop S ci. , 2001,
41: 1602-1608
[ 5]　Chen X M , Soria M A, Yan G P, e t al . Developmen t of s equence
tagg ed s ite and cleaved am plif ied polymorphic sequen ce marker s
for w heat st rip e rus t res istan ce gene Yr 5[ J ] . Crop S ci. , 2003,
43: 2058-2064
[ 6]　Weiland J J , Yu M H. A cleaved am plif ied polymorph ic s equence
( CAPS) marker ass ociated with root-knot nematode r esis tance in
su garbeet [ J ] . Crop Sci. , 203, 43: 1814-1818
[ 7]　程林梅,曹秋芳, 高洪文,等. 菊巨再生体系建立及转 AFL2基因
的研究[ J] . 草地学报, 2004, 12( 3) : 199-203
[ 8]　杨青川,韩建国. RAPD技术在苜蓿耐盐遗传育种中的应用 [ J] .
草地学报, 2003, 11( 1) : 27-32
[ 9]　Michelmore R W, Paran I, Kess eli R V. Inent if ication of mark-
ers link ed to diseas e-resis tance genes by bu lled segregant analy-
sis : A rap id method to detect markers in speci fic genomic region s
by u sing s egregat ing popu lat ions [ J ] . Proc. Nat l. Acad. S ci.
USA, 1991, 88: 9828-9832
(下转第 23页)
13第 1期 丁成龙等:分群分析法获得与多花黑麦草抗叶班病基因连锁的E ST -CAPS标记
P 5CSF129A 基因已经在冰草转化植株体内表达,其耐
盐性得到了提高。但高盐胁迫对植物生长发育的影响是
非常复杂的。盐生植物之所以能在长期干旱和盐渍的环
境中正常生长,是多种抗盐机制综合作用的结果。脯氨
酸的合成可能增强了冰草对盐胁迫的响应(提高转基因
冰草植株中脯氨酸的合成量) , 但也可能与冰草植株内
在的耐盐机制协同作用, 使转基因植株总体耐盐能力增
强。今后对转基因冰草生理代谢、细胞结构和根的形态
发生进一步深入研究,将有助于揭示脯氨酸积累在植物
中的作用及其与冰草植株耐盐的关系。
参考文献
[ 1]　陈世璜,占不拉,宋锦峰.几种冰草特性的初步研究[ J] . 内蒙古草
业, 1994, 3( 4) : 29-31
[ 2]　Hong Z, Lakkineni K, Zhang Z, Verma D P S . Removal of feed-
back inhib ition of 1 pyr roline-5-carboxylate synthetas e ( P 5CS )
result s in in creas ed proline accumu lat ion and protect ion of plants
f rom osmot ic st ress [ J] . Plant Phys iol, 2000, 122: 1129-1136
[ 3]　霍秀文. 冰草组织培养再生体系建立及耐旱转基因研究 [ D] . 呼
和浩特:内蒙古农业大学, 2004
[ 4]　Matsushita N, Match T . Characteriz at ion of Na exclus ion mecha-
nisms of s alt-toleran ce reed plants in com paris on with s al t-s ens i-
t ive rice plants [ J ] . Phys iol Plant , 1991, 83: 170-174
[ 5]　王守生. 茶树游离脯氨酸含量及水分胁迫对其影响[ J ] . 茶叶,
1995, 21( 1) : 22-25
[ 6]　刘友良,毛才良,王良驹. 植物耐盐性研究进展[ J] .植物生理学通
讯, 1987, ( 4) : 1-7
[ 7]　赵可夫.作物抗性生理[ M ] . 北京:农业出版社, 1990. 249-313
[ 8] 　刘春华,苏加楷,黄文惠. 禾本科牧草五个耐盐生理指标的研究
[ J] .草业科学, 1993, ( 1) : 45-54
[ 9]　Gill K S . Phys iological aspects of salt t oler ance in barley an d w h-
eat grow n in pots in coastal salin e con dit ion s [ J ] . In dian J of Agri
Sci, 1987, ( 6) : 409-415
[ 10] 于　卓,孙　祥,戴君峰. 草地早熟禾品种间幼苗耐盐性差异的研
究[ J] . 草地学报, 1997, 5( 2) : 128-132
[ 11] 王　萍,周　天. 在 NaCl胁迫下羊草幼苗生理反应及外源钙的
缓解效应[ J] . 草地学报, 1998, 6( 1) : 20-25
[ 12] 王　萍,殷立娟,李建东. 中性盐和碱性盐对羊草幼苗胁迫的研究
[ J] .草地学报, 1994, 3( 2) : 37-43
[ 13] Hansan A D, Nelsen C E, and Everson E H. Evaluat ion of f ree
proline accumu lation as an index of drought resistance usin g tw o
cont ract ing barley cult ivars [ J ] . Cr op S ci, 1997, 37: 720-726
[ 14] Singh , T N, Aspinall D, Bley L G. Prol ine accum ulation and va-
rietal adaptabilit y to drou ght in b arley: A potent ial metabol ic
measu re of drough t resistance [ J ] . New Biol, 1972, 236: 188-190
[ 15] 毛才良,刘友良. 盐胁迫大麦体内 Na+ 、K+ 分配与叶片耐盐量
[ J] . 南京农业大学学报, 1990, 13( 3) : 32-36
[ 16] 翁森红,聂素梅,徐恒刚. 禾本科牧草 K+ / Na+与其耐盐性的关系
[ J] . 四川草原, 1998, ( 2) : 22-23
[ 17] Bohner t H J, Nels on D E , Jensen R G. Adaptat ions to envi-ron-
men tal st ress es [ J ] . Plant Cel l, 1995, 7: 1099-1111
[ 18] Glen n E P, Brow n J J. Salt t oler ance an d crop potent ial of halo-
phytes [ J ] . Crit ical Review s in Plant S cien ces, 1999, 18( 2) : 227-
255
[ 19] Guo Y(郭　岩) , Zh ang L (张　莉) , Xiao G(肖　岗) . Expres-
sion of betaine aldeh ydedehydrogenas e gene and salin ity tolerance
in rice t ransgenic plants [ J] . Science in Chin a( Series C ) (中国科
学) ( C辑) , 1997, 40( 5) : 496-501 ( in Chin ese)
[ 20] 董云洲,王雪艳. 转肌醇甲基转移酶基因烟草的耐盐性及其遗传
分析[ J] .农业生物技术学报, 2000, 8( 1) : 53-55
(责任编辑　毛培胜)
(上接第 13页)
[ 10] Murray M G, Th ompson W F. Rapid isolat ion of h igh m olecular
w eight plant DNA [ J] . Nucleic Acids Resear ch, 1980, 8: 4321-
4325
[ 11] 刘贤华,白晓军,胡川闽,等. 一种改良的质粒 DNA 的快速提取
方法[ J] . 第三军医大学学报, 1999, 21( 7) : 531-532
[ 12 ] M Á ll er M G, T aylor C, Rasmu ssen S K, et al . M olecular
clon ing and characterizat ion of tw o genes encoding aspar agine
synthetas e in barley ( H ord eum vulgar e L. ) [ J ] . Biochim . Bio-
phys. Acta, 2003, 1628: 123-132
[ 13] Jones E S, Mah oney N L, Hayw ard M D, et al . An enhanced
molecular marker based genet ic map of perennial ryegrass (L ol ium
p erenne ) reveals comparative relat iop ships w ith oth er Poaceae
gen om e[ J] . Genome, 2002, 45: 282-295
[ 14] Chen H, Wang S, Xing Y, Xu C, et al. Comparat ive analyses of
gen om ic locat ions an d race specif icit ies of loci for quant itat ive re-
sistance to Py ricularia g risea in rice and b arley[ J] . Proc Nat l A-
cad S ci USA, 2003, 100: 2544-2549
[ 15] T abien R E, L i Z, Paters on A H , et al . Mapping QTLs for f ield
res istance to the rice b las t pathogen and evaluat ing their in dividu-
al an d combined ut ilit y in im proved variet ies [ J ] . T heor Appl
Genet , 2002, 105: 313-324
[ 16] Hit talman i S , Parco A, Mew T V, e t al . Fine mapping and DNA
marker -as sisted pyr amiding of th e three major genes for blast re-
sistance in rice[ J ] . T heor Appl Genet , 2000, 100: 1121-1128
[ 17] Wil liams D W , Bu rrus P B, Vin celli P. S ever ity of leaf s pot in
perennial ryegrass as inf luenced by mow ing heigh t and nit rogen
level[ J ] . Crop Sci. , 2001, 41: 1207-1211
(责任编辑　毛培胜)
23第 1期 徐春波等:转基因冰草植株耐盐性研究