全 文 ：文章编号: 1007-0435( 2002) 03-0184-06
基因工程在草坪草育种上的应用
郭振飞, 卢少云
(华南农业大学生命科学学院草坪草研究室, 广州 510642)
摘要: 综述草坪草的遗传转化和基因工程在草坪草育种上的应用。
关键词: 草坪草; 基因工程; 育种
中图分类号: S688. 4 文献标识码: A
Application of Genetic Engineering in Turfgrass Breeding
GUO Zhen-fei, LU Shao-yun
( Laboratory for Turfgrass S cience, College of Life S cience, South China Agricul tu ral U nivers ity, Guangzh ou 510642, Ch ina)
Abstract: The t ransformat ion o f turfgrass and applicat ions of g enet ic engineering in turfgrass breeding
w er e review ed in the paper.
Key words : Turfgrass; Genet ic eng ineering ; Br eeding
现代生物技术在二十世纪末近 20多年取得了
飞速的发展, 已广泛应用于包括草坪草在内的农作
物的品种改良 [ 1]。利用基因工程技术,把外源基因导
入植物细胞或组织是现代作物遗传育种的重要途
径。将功能基因有目的、有针对性地导入特定品种的
愈伤组织或原生质体, 获得改良的转基因植物, 提高
草坪草的抗逆性, 成为该领域的研究前沿。本文结合
作者的研究工作,简要介绍草坪草基因工程的研究进展。
1 草坪草的遗传转化系统
1. 1 DNA转移技术
1. 1. 1 将 DNA 直接转移导入原生质体 植物细
胞具有细胞壁结构,成为外源 DNA 直接导入细胞
的障碍。去除细胞壁的原生质体本身具有摄取外来
物质的特性, 渗透处理(如聚乙二醇)或电击(电渗
透)处理可诱导原生质体摄入外源 DNA。1980年
后,由于采用了胚性细胞悬浮系或胚性愈伤组织来
制备原生质体,各种草坪草原生质体培养及再生植
株相继成功 [ 1] , 使得 DNA 直接转移导入原生质体
的转化技术能成功应用于草坪草的遗传转化。
利用原生质体转化系统, 已相继在高羊茅( Fes-
tuca arundincea) [ 2～4]、紫羊茅( Festuca rubr a) [ 5]、匍
匐翦股颖 ( A grost is stolonif era )、多年生黑麦草
(L olium p erenne )和一年生黑麦草 ( L olium multi-
f lor um )等成功获得了转基因植物[ 7]。Ha 等采用电
渗透法,将质粒 pZO1052转化高羊茅的原生质体,
用 200mg / L 潮霉素筛选抗性转化子, 得到 3～9×
10
- 6的转化频率。经 Southern 杂交分析, 证明潮霉
素抗性基因 hph 已整合到转基因植物的基因组
中[ 2]。Wang 等采用 PEG 诱导的 DNA 直接转化多
年生和一年生黑麦草原生质体,获得了可育的转基
因植物[ 7]。Kuai等[ 8]注意到高羊茅悬浮细胞的生理
状况会影响到转基因的表达。
原生质体转化具有易于选择转化体、避免产生嵌合
体、受体植物不受种类限制等优点。但由于建立原生质
体的再生植物系统较困难,转化效率亦低,从原生质
体再生的无性系体细胞变异较大, 限制了它的应用。
收稿日期: 2002-01-25;修回日期: 2002-04-25
基金项目:广东省自然科学基金( 010281)和“十五”国家 863项目资助课题
作者简介:郭振飞( 1964-) ,男,湖北省钟祥市人。研究员,博士生导师, 1996年获国务院政府特殊津贴。多年从事植物代谢、逆境生理与生
物化学的研究,近年开展植物分子生物学及草坪草生物技术研究。电话: ( 020) 85282469, Email: zh fg uo@ yahoo. com
第 10卷 第 3期
Vo l. 10 No. 3
草 地 学 报
ACT A AGRESTIA SIN ICA
2002 年 9月
Sept. 2002
1. 1. 2 硅碳纤维旋涡介导的转化 Kaeppler 等建
立了硅碳纤维旋涡介导的植物细胞遗传化[ 9, 10]。将
质粒DNA 和长10～80m,半径 0. 6m 的硅碳纤维
混入悬浮培养细胞,然后进行旋涡处理,硅碳纤维起
显微注射针的作用,使 DNA 导入细胞核。Frame 等
用硅碳纤维法得到了可育的转基因玉米 ( Zea
may s)
[ 11]。Serik 等利用硅碳纤维法将DNA 转入小麦
( T riticum aest ivum)成熟胚细胞, 从这些硅碳纤维
处理胚诱导产生的愈伤组织中检测到 GU S 基因的
瞬时表达[ 12]。
最近, Dalton等成功地建立了硅碳纤维旋涡介
导的转化草坪悬浮细胞技术 [ 13]。将一年生黑麦草、
多年生黑麦草、高羊茅和匍匐翦股颖的悬浮细胞分
别与硅碳纤维加入到同一支小离心管,再加入待转
化的质粒 DNA, 在旋涡混合器上以最大速度旋涡
lmin,即完成了转化过程。用潮霉素筛选转化体,再
生出植株, 得到了转基因植物。GU S基因瞬时表达
分析表明,表达频率达 20%～40% ; Southern blot、
PCR、RT -PCR等分子检测表明,转基因植物已整合
了外源基因并得到表达 [ 13]。虽然目前在植物上采用
硅碳纤维旋涡介导的基因转化的报道还很少,但该
法的实验操作和需要的设备简单,是一种很有吸引力的
方法。
1. 1. 3 基因枪法 基因枪法( part icle gun) , 又称
微粒轰击法( biolistics bombardment , part icle bom-
bar dment , micr opro ject ile bombardment )。将 DNA
分子吸附于微小的钨粒或金粒的表面,在高压的作
用下, 微粒被高速射入受体细胞或组织, 外源 DNA
进入细胞后,整合到基因组 DNA 上,得到表达。基
因枪轰击不象根癌农杆菌那样受宿主限制, 对双子
叶和单子叶植物都适用。由于过去用农杆菌介导的
转化难以在单子叶植物上成功, 基因枪法广泛应用
于禾谷类作物的转化。基因枪法还具有操作简单快
速、易控制和受体广泛的优点, 它不仅可以原生质
体、叶圆片为靶受体, 亦可以悬浮细胞、茎、种子胚、
幼穗、幼胚、愈伤组织和花粉细胞等几乎所有具有潜
在分生能力的组结或细胞作受体。目前,草坪草的遗
传转化多采用基因枪法。
Zhong 等首先将基因枪法应用于草坪草的遗传
转化 [ 14]。将 A ctl 控制的 gusA 基因导入匍匐翦股颖
的愈伤组织, 由于在表达质粒上没有选择标记, 将能
瞬时表达 GUS 活力的愈伤组织进行再生, 最终仅
鉴定出一株转基因植物表达 GU S 活力[ 14]。
Spangenberg 实验室在成功地将 DNA 直接导
入紫羊茅原生质体后 [ 5] , 又用基因枪法, 将CMV35S
控制的基因转化高羊茅和紫羊茅的悬浮细胞, 外源
基因能整合到基因组,并得到表达[ 15]。随后, 又先后
用基因枪法转化多年生黑麦草和一年生黑麦草, 获
得了转基因植物, 建立了转化方法[ 16, 17] ,但原生质
体制备、悬浮细胞的诱导及维持难度较大, 为此,
Cho 等建立了十分有效的紫羊茅和高羊茅愈伤组织
诱导和再生方法,并用基因枪法将 pht、bar 和 gusA
基因进行共转化( co-transformat ion) , 获得了较高
的共表达( co-expr ession )频率[ 18]。用基因枪法将
bar 基因转化匍匐翦股颖的愈伤组织, 获得了抗除
草剂的转基因植物[ 19, 20]。最近, 草地早熟禾( Poa
p ratensis)的基因枪转化亦获成功 [ 21, 22]。
1. 1. 4 农杆菌介导的 DNA 转移技术 农杆菌介
导的 DNA 转移技术已十分有效地应用于双子叶植
物的遗传转化,可以植物组织、器官, 甚至是整株植
物为受体。只需将植物组织与农杆菌在培养条件下
共同培养一段时间即可得到较高的转化频率。该方
法具有操作简单,设备便宜,转化频率和工作效率高
等优点,转化插入的片段多为单拷贝,很少有甲基化
和基因沉默现象,遗传稳定性好。不足之处是难以用
于单子叶植物的转化。但近年来取得了较大进展, 已
成功获得了转基因玉米、水稻( Ory z a sativ a)和小麦
等禾谷类单子叶植物 [ 23～25]。Liang 等首次利用农杆
菌感染日本结缕草( Zoy sia j aponica)的愈伤组织,
获得了转基因植物[ 26]。
1. 2 转基因植物的筛选
一个好的遗传转化体系,还包括在 DNA 转移
后能有效地从受体细胞中筛选出已整合了外源基因
并且表达的少数转化体。一般是建立一个选择系统,
导入一个抗生素或除草剂抗性的基因, 由组成性启
动子(如 CaMV35S、U bil 或 Act l 等)控制, 以抗生
素或除草剂抑制非转化和野生型细胞的生长, 而转
化细胞能在选择培养基上生长。
双子叶植物多采用大肠杆菌的新霉素磷酸转移酶
基因( nptII, neomycin phosphot ransfer ase II g ene)
作选择标记,其表型是转化后的植物组织具有卡那
霉素抗性。禾本科植物培养细胞对卡那霉素具有天
然抗性,所以在转化体筛选中,需选用其它选择标记
185第 3期 郭振飞等:草坪草基因工程研究进展
基因, 如大肠杆菌的潮霉素磷酸转移酶基因 hph
( hyg romycin phosphot ransferase )、bar ( bialaphos
resistance)基因。潮霉素抗性筛选已成功用于草坪
草的转化[ 2, 15～17, 26～28]。Dalton 等注意到筛选时的选
择压对高羊茅的转化频率和转基因拷贝数均有影
响,潮霉素不连续性筛选容易获得较高的再生频率,
但漏网的非转化体较多,而且转基因拷贝数较高;低
浓度潮霉素连续性筛选效果更好, 筛选出的转化子
中没有假阳性,转基因拷贝数亦低[ 29]。
抗生素抗性基因的存在对作物改良并不产生直
接的益处,因此, 转化策略在不断改进,已从转基因
植物中有选择地排除这些选择标记。共转化( co-
transfo rmat ion)已应用于玉米、水稻、大麦和烟草
( N icotiana tabacum )等农作物的转化。一方面, 可以
加速转化,不用将目的基因和选择标记构建在同一
个表达载体上;另一方面亦提供了一种排除选择标
记基因的简单方式, 只要选择标记与目的基因在物
理上是分离的,可以通过有性杂交后代产生的分离
而将选择标记排除。
Bar 基因编码 pho sphinothricin acetyltansfer -
ase ( PAT ) , 对除草剂 g lufosinate 和 bialapho s具有
抗性, 使它们失活。利用除草剂抗性基因作选择标
记,具有独特的优越性,可以使转基因植物具有抗除
草剂性状。利用 bar 基因作选择标记,已广泛应用于
高羊茅[ 3]和葡匐翦股颖的转基因研究 [ 30～31]。
在含除草剂的培养基上筛选转化体需要很长时
间,通常需 2～3个月, 而且最后仍会存在一些漏网
的非转化细胞。Kramer 等发现了一种分辩转化体
的方法 [ 32]。由于转化细胞的旺盛生长,引起培养基
pH 降低,引起加在培养基中的指示剂酚红 ( chlor -
phenol red)颜色的改变,从红至橙, 又到黄色。这种
方法使得转化体在biolaphos选择下生长 2～4周就
可以区别出来。
1. 3 报告基因
基因的转移是否成功及其能否在植物细胞中表
达,可以通过检测报告基因的瞬时表达来评估, 这可
在基因转化 1～2d后即可进行,而不需要等到 DNA
整合到宿主基因组上后, 不仅节省时间、人力,而且
有助于检验转化方法和表达质粒构建是否合适。以
gusA 基因(编码 - 葡糖苷酸酶)在植物中应用最
广泛,已在匍匐翦股颖 [ 14]、一年生黑麦草 [ 13、17]、多年
生黑麦草 [ 13、16]、高羊茅[ 8、13]的基因转化的瞬时表达
检测。
1. 4 外源基因表达的调控
选用合适的启动子对转基因的表达是非常重要
的。Zhong 等用 CaMV35S 启动子控制 bar 基因的
质粒,获得了抗除草剂的转基因匍匐翦股颖 [ 30]。用
CaMV35S 启动子控制 gusA 基因,转基因植物表达
了 GU S活性[ 19]。在双子叶植物中, CaMV35S 启动
子已被证明对于基因的表达十分有效, 但它在单子
叶植物中的表达比双子叶植物低 100倍。
后来发现来自水稻 Act inl基因和来自玉米 U-
bil基因的单子叶植物启动子对基因表达十分有用。
例如,水稻 Act l启动子的表达效率比 CaMV35S 高
几十倍。目前大多数的转基因单子叶植物都是采用
这 2个启动子。Spangenberg 实验室在研究草坪草
转化时, 先是采用 CaMV35S 控制 gusA 基因的表
达, 以后改为 Ubil控制 gusA [ 5, 17]。用 Actl 控制的
gusA 基因,以基因枪法转化匍匐翦股颖的愈伤组
织,所产生的转基因植物能高效表达 GU S活力[ 14]。
用 Actl 控制选择标记 hp h, 以 Ubil控制目的基因
BADH, 得到转基因草地早熟禾[ 21]。作者分别用
Act l控制选择标记 hph、U bil 控制目的基因, 获得
了多个转抗病基因的匍匐翦股颖(待发表)。
2 草坪草抗逆性的基因工程
2. 1 抗除草剂
几个实验室已先后得到了转 bar 基因的匍匐翦
股颖 [ 30～31, 33]。Lee 等检测了转基因植物对除草剂
Herbiace (有效成分 pho sphinothricin, PPT ) 的抗
性,发现一些株系对除草剂的抗性很强,而且所有在
温室抗除草剂的株系移至大田后,均能在除草剂喷
施后存活。转基因植物的种子能在除草剂存在下萌
发[ 31]。Zhong 等也发现 bar 基因的匍匐翦股颖能抵
抗除草剂的伤害, 喷施 12%的 Ignite (有效成分
PPT ) ,对照植物全部死亡, 38个转基因株系中有 37
个株系不受除草剂的任何伤害 [ 30]。
Zhong 等还发现 [ 30] ,引起草坪草褐斑病( brow n
patch)的 Rhiz octonia solani 对除草剂 bialaphos 极
敏感, 降低真菌生长 50%所需 bialaphos 浓度为
5. 54mg/ L , 所需 PPT 浓度为 292. 18mg/ L ; 引起币
186 草 地 学 报 第 10卷
斑病 ( dollar spot ) 的 Sclerot inia homeocarpa 对
bialapho s和 PPT 均敏感, 降低真菌生长 50%所需
bialapho s 和 PPT 浓度分别为 33. 04 和 270. 06
mg / L ;降低引起腐霉病的Pythium aphanidermatun
生长所需bialaphos浓度为 1467. 18mg / L。转 bar 基
因的匍匐翦股颖在施用除草剂 bialapho s后, 具有明
显的抗病效果,抑制了 3种病的发生。对褐斑病和币
斑病的防治效果尤佳[ 20、30]。这是一项很有意义的研
究,利用转基因植物抵抗除草剂的伤害,施用除草剂
一方面杀死了杂草, 又可以防治存活的转基因植物
的病害。
2. 2 抗病性
病害严重影响草坪美观和功能,尤其是高尔夫
球场果岭区和运动场草坪,因而在草坪养护上需大
量施用杀菌剂,以控制病害的发生。杀菌剂等农药的
大量使用,无疑会造成环境污染,危害人类的身体健
康。因而草坪草抗病基因工程深受重视。
植物感病后, 发生系列防卫反应,诱导抗病机制
的运转以避免进一步病害的发生。几丁质酶是一类
重要的病原相关蛋白( PR- pro teins) ,参与了植物
抗病的保护反应[ 34]。Green 等将几丁质酶基因导入
匍匐翦股颖愈伤组织, 获得了转基因植物。在人工控
制的环境条件下,从 11株转基因植物中, 筛选出 2
个株系对 Rhiz octonia solani 的抗性明显高于其亲
本, 接种 Rhiz octonia solani 后, 发病程度降低了
20%～80% [ 35]。
Rutgers大学草坪草生物技术研究小组在建立
了匍匐翦股颖愈伤组织诱导再生植物及高效的遗传
转化系统后, 将几个具有抗病潜势的基因导入匍匐
翦股颖品种 Crenshaw 的愈伤组织, 以获得抗病的
匍匐翦股颖品系[ 36]。这些基因包括 BO、PAP、GO。
BO ( bacterio- opsin)是从细菌分离的质子泵蛋白,
通过表达BO蛋白的转基因烟草诱导了自身的细胞
防卫反应, 提高了抗病性 [ 37]。PAP 是来源于 poke-
w eed( Phy tolacca americana)的抗病毒蛋白,对植物
亦有毒害。改造后的PAP(删除C-末端编码序列)对
植物无毒,而且还有抗真菌活性, 抗病机理与 BO相
近,也能诱导植物的防卫反应[ 38]。GO 即葡萄糖氧化
酶,催化葡萄糖氧化产生葡萄糖酸和 H2O 2, H2O 2自
身就对许多病原菌有毒,还能作为信号物质,激活植
物防卫反应, 诱导系统抗性 [ 39]。转 GO 基因的马铃
薯( S olanum tuber osum )提高了抗病性 [ 40]。上述基因
在 Ubil控制下, 与 Act l控制的 hph 共转化匍匐翦
股颖愈伤组只, 所得到的转基因植物经田间试验观
察, 已发现一些品系提高了抗病性[ 36]。作者曾对这
些转基因植物进行分子检测, 结果表明外源基因已
整合至核基因组, 并且得到表达( Guo 等,未发表资
料)。
作者还将 Ubil控制的 PR5K 基因 [ 41]导入匍匐
翦股颖愈伤组织,再生植物经 Southern和 Northern
检测后, 将表达了 PR5K 基因的转基因植物种于田
间,观测接种引起dollar spot 病的 Sclerotinia home-
ocarpa,结果表明, 4个转 PR5K 基因的匍匐翦股颖
品系显著延缓了病害的发生( Guo 等,待发表)。
2. 3 抗非生物胁迫
草坪草经常受到包括干旱、盐胁迫、高温、低温
等非生物的胁迫的不良影响, 培育抗旱、抗寒和耐盐
碱的草坪草种有重要意义。但由于植物对非生物胁
迫的耐性是受多基因控制的数量性状, 比抗病性更
复杂,目前用基因工程技术改良草坪草抗非生物胁
迫的研究还很有限。
干旱、温度胁迫和盐胁迫均会导致植物细胞发
生渗透胁迫[ 42]。甜菜碱是一种非常重量要的渗透调
节物质, 它是由前体物质胆碱在胆碱单氧化酶
( CMO)和甜菜碱醛脱氢酶( BADH)催化下产生[ 42]。
过量表达 CMO 或 BADH 的转基因植物提高了抗
旱性和耐盐性[ 43～44]。作者之一参加了将抗旱和抗盐
的 BADH 基因(编码甜菜碱醛脱氢酶)转化草地早
熟禾的研究[ 21]。在建立了草地早熟禾诱导愈伤组织
和高效再生系统后, 将 Ubil 控制的 BA DH 基因与
A ct l控制的基因用基因枪法转化草地早熟禾愈伤
组织,以潮霉素筛选后,得到的转基因植物提高了抗
旱性和抗盐性[ 21]。目前,我们实验室已经建立了狗
牙 根 ( Cynodon dacty lon )、马 尼 拉 草 ( Zoy sia
matrella)和草地早熟禾的愈伤组织诱导和再生系
统, 正在进行 CMO、BADH 和其它抗旱、抗病基因
转化草坪草的研究。
3 存在问题与展望
总的来说, 与其它农作物品种的基因工程改良
研究相比,草坪草基因工程研究显得较为滞后,国内
187第 3期 郭振飞等:草坪草基因工程研究进展
外从事草坪草基因工程研究的实验室还不多。但基
因工程技术比传统的育种技术具有一些独特的优越
性,如基因来源广泛,不仅可以利用植物基因,也可
以利用动物、微生物等来源的基因;针对性强,可以
将特定的目的基因直接转化需改良的特定品种;所
需育种周期短、省时省力。将抗旱抗盐基因转化特定
品种,获得改良的转基因植物,提高草坪草的抗旱性
和耐盐性,用于干旱地区或盐碱地的绿化, 也可以减
少草坪灌溉用水, 或用含盐分高的非饮用水灌溉,节
省水资源。将抗寒基因转化草坪草,培育出抗寒的草
坪草,延长草坪草绿期或改善在低温下的存活。培育
抗除草剂的转基因草坪草, 采用除草剂灭杀杂草,减
少手工拔草所费劳动力成本。培育抗病的转基因草
坪草,以减少各种农药的应用,减低施用农药造成的
环境污染。基因工程为我们展现了美好的未来, 这些
也是国际上草坪草育种研究的前沿。
最近,草坪草育种技术研究已列入“十五”国家
863计划,这对我国草坪草科技工作既是一个机遇,
也是挑战。我国有些单位已相继启动了草坪草基因
工程研究。草坪草基因工程研究存在下列问题, 有待
克服或解决:
3. 1 建立草坪草高效的再生系统,这是进行草坪草
基因工程的前提。草坪草愈伤组织的的诱导和再生
与基因型有关。同种草坪草,不同品种间诱导愈伤组
织和再生植物的培养基成分可能差异很大, 而且有
些品种似乎很难获得再生植物。
3. 2 草坪草遗传转化方法尚需进一步研究。目前,
主要是采用 PEG 诱导的原生质体直接转化或基因
枪轰击法,这两种方法均有不足之处。最近,农杆菌
介导的转化方法应用于结缕草和匍匐翦股颖已获成
功,但仍有待于在更多草坪草种上开展研究。
3. 3 我国可供利用的拥有知识产权的基因还不多,
需要与分子生物学科技工作者协作攻关。
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