全 文 ：第20卷 第4期
Vol.20 No.4
草 地 学 报
ACTA AGRESTIA SINICA
2012年 7月
Jul. 2012
紫花苜蓿MsZIP基因超表达载体的构建及烟草转化
李 燕1,康俊梅1,张铁军1,杨青川1,房 锋2
(1.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,北京100193;2.中国农业科学院植物保护研究所,北京 100193)
摘要:根据已经克隆得到的MsZIP基因(GenBank序列号:HQ911778),合成编码区cDNA,构建植物超表达载体
PBI-MsZIP。将MsZIP基因插入到含有启动子35S和终止子nos的载体PBI121中,酶切鉴定表明,目的基因已经
正确的插入到载体中,超表达载体构建成功。采用CaCl2 冻融法将其转入农杆菌中,然后采用农杆菌介导的方法
转化烟草(Nicotianatobacum),共得到12株抗性烟草苗,选取其中长势良好的3株进行分析。结果表明:转基因烟
草的PCR,RT-PCR和Southern-blot检测均得到了与目的条带大小一致的片段,说明已经成功获得了能够表达
MsZIP基因的转基因烟草;进一步对转基因烟草进行组织化学染色分析,该基因在根、茎、叶中都可以表达。本试
验为MsZIP基因功能的研究提供了理论依据和试验材料。
关键词:紫花苜蓿;MsZIP基因;超表达载体构建;烟草转化
中图分类号:Q943.2 文献标识码:A 文章编号:1007-0435(2012)04-0735-06
ConstructionandTransformationofSuper-ExpressingPlasmidof
MsZIPGenefromMedicagosativaL.
LIYan1,KANGJun-mei1,ZHANGTie-jun1,YANGQing-chuan1,FANGFeng2
(1.InstituteofAnimalScience,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Beijing100193,China;
2.InstituteofPlantProtection,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Beijing100193,China)
Abstract:AccordingtotheMsZIPgenesequence(GenBanknumber:HQ911778),cDNAfragmentwas
clonedandtheplantexpressionvectorPBI-MsZIPwasconstructed.Theplasmidwastransferredinto
AgrobacteriumLBA4404byCaCl2freeze-thawmethodthentransferredtotobaccobyAgrobacteriummedi-
atedtransformationsystem.Twelvekanamycinresistantplantswereobtained.Threevigorouskanamycin
resistantplantsweresampledtodetecttargetfragment.PCRandSouthern-blotidentificationprovedthat
therecombinantplasmidhadbeentransferredintotobacco.MsZIPgenewassuccessfulyover-expressed
intransgenictobacco.ThehistochemistrytestingofregenerationtobaccosshowedMsZIPgeneexpressing
intheroot,stemandleafoftestedtobacco.Thisresearchprovidedtheoreticalbasicandexperimentalma-
terialforthefunctionstudyofMsZIPgene.
Keywords:MedicagosativaL.;MsZIPgene;Over-expressedvector;Tobaccotransformation
bZIP类转录因子,是真核生物中分布最广、最保
守的一类转录因子[1]。所有的bZIP转录因子都具有
2个保守的结构域。第1个区域称为亮氨酸拉链结
构域,典型的特征是每7个氨基酸的第7位含有一个
亮氨酸,其他疏水残基位于第3和第4位。亮氨酸拉
链形成一个两亲性的α螺旋,该结构为bZIP蛋白与
DNA结合之前的二聚体化作用所需[2]。DNA结合
所需的第2个区域是大约20个氨基酸的碱性结构
域,它紧靠亮氨酸拉链结构域的N末端,能与专一的
DNA序列相互作用。bZIP转录因子参与十分广泛
的生物学反应。玉米(Zeamays)liguleless2(lg2)编码
的bZIP蛋白LIGULELESS2作用在玉米叶中叶舌和
叶耳发育的狭窄区域,在营养生长至生殖生长的过渡
阶段发挥作用[3]。Bailey等从拟南芥(Arabidopsis
thaliona)中分离出逆境诱导的4种bZIP蛋白,分别
称做ABFI,ABF2/AREBI,ABF3和ABF4/AREB2;在
干旱、高盐或外源ABA的诱导下均能激活bZIP转录
因子,并使之结合在ABRE(ABA-responsiveelement,
收稿日期:2012-01-16;修回日期:2012-03-28
基金项目:“十二五”国家科技支撑计划课题(2011BAD17B01-01-3);中央级公益性科研院所专项资金项目(2011cj-14)资助
作者简介:李燕(1984-),女,蒙古族,内蒙古乌兰察布人,博士,研究方向为牧草遗传育种,E-mail:caasliyan@yahoo.com.cn;*通信作者
Authorforcorrespondence,E-mail:qchyang66@yahoo.com.cn
草 地 学 报 第20卷
ABA应答元件)上,以此激活下游耐盐和耐旱等诸
多抗性相关基因的表达[4]。Kim等[5]过量表达bZ-
IP类转录因子的一个亚家族成员ABF2,能增加植
株对 ABA的敏感性及对干旱的耐受能力,且转基
因植株提高了ABA调控基因的表达水平。在水稻
(Oryzasativa)中表达bZIP基因可以显著提高水
稻的抗逆性,影响水稻的品质[6-7]。Rodriguez-Uribe
等[8]在刀豆(Phaseolusacutifolius)中克隆了一个
根特异性表达的bZIP类基因,该基因受到缺水胁
迫的影响。综上所述,bZIP类转录因子在植物抗胁
迫中发挥着重要作用。
紫花苜蓿(MedicagosativaL.)是优良的豆科
牧草,目前全世界种植面积达3000多万hm2,我国
属世界上栽培利用苜蓿较多的国家之一。全国共有
14个省区种植苜蓿,主产区以华北、西北为主[9]。
这些地区以盐碱地为主,土壤盐渍化成为制约苜蓿
产量的主要因素之一,因此目前苜蓿产业的重要内
容之一,就是如何培育适应盐碱性环境的苜蓿,即提
高苜蓿的耐盐碱性。紫花苜蓿中苜1号中编码bZ-
IP转录因子的基因MsZIP 为本实验室克隆,为了
研究该基因的功能,本试验克隆了 MsZIP 基因的
编码区,构建了植物超表达载体,并转化烟草(Nic-
otianatabacum)。这将为研究该基因的功能,进而
了解该基因在植物中的表达机制提供了试验依据。
同时,研究从紫花苜蓿中分离出来的抗逆相关的
MsZIP基因,还可以为培育苜蓿抗逆新品种奠定理
论和试验基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
紫花苜蓿中苜1号种子、烟草野生型品种Nc89
种子、根癌农杆菌LBA4404、植物表达载体PBI121
由本实验室保存。大肠杆菌DH5感受态细胞和克
隆载体pEASY-T购自北京全式金生物技术有限公
司。RNA提取试剂Trizol、质粒小提试剂盒和PCR
产物纯化试剂盒购自北京博迈德生物技术公司。其
他所需的酶和生化试剂均购自北京博雅宏兴生物技
术公司。
1.2 DNA和RNA提取
紫花苜蓿和转基因烟草的总 RNA 提取采用
Trizol法,转基因烟草的基因组DNA采用本实验
室改进的CTAB法提取[10]。
1.3 克隆载体pEASY-MsZIP的构建
根据已经获得的 MsZIP 基因序列,设计一段
含有酶切位点的引物 MF:5′-TCTAGAATGGG-
GACTAAGGAG-3′;MR:5′-GGATCCTTCAAG-
GTTAGCAAC-3′。酶切位点用下划线表示,分别
为XbaⅠ和BamHⅠ。以紫花苜蓿中苜1号总
RNA为模板,合成cDNA,以cDNA为模板,MF和
MR为引物,合成全长cDNA基因(不含有终止子)。
PCR产物在1%琼脂糖凝胶上电泳分析之后,切胶
回收,连接到pEASY-T克隆载体上,转化大肠杆菌
感受态DH5α,挑取阳性单菌落,菌体PCR检测之
后,将含有目的条带的阳性克隆送到北京博迈德生
物技术有限公司测序。
1.4 超表达载体PBI-MsZIP的构建
用限制性内切酶XbaⅠ和BamHⅠ同时酶切克
隆载体pEASY-T和空载体PBI121,琼脂糖凝胶检
测后各自回收目的片段。用 T4DNA 连接酶在
16℃连接6h。连接产物转化到大肠杆菌感受态
DH5α中,挑取阳性单菌落,菌体PCR检测后,将含
有目的片段的单菌落摇菌,提取质粒PBI-MsZIP,
用限制性内切酶XbaⅠ和BamHⅠ酶切鉴定。
1.5 转基因烟草的获得
采用CaCl2 冻融法将构建好的超表达载体转入
农杆菌LBA4404中,用于烟草的转化。采用叶盘法
转化烟草[11],选取培养基中生长良好的无菌烟草叶
片,打孔器打成直径7mm 的叶圆片,在 OD600为
0.5的农杆菌转化菌液中浸泡10min,取出后摆放
在共培养基中,28℃黑暗培养48h。之后转入筛选
培养基中,25℃培养直至叶盘周围分化愈伤组织,并
长出芽。待芽长至1cm时,将芽切下,转入生根培
养基中继续培养,直至长成完整的烟草苗。待根长
至5cm,地上部分长至10cm左右时,移栽到营养
土中在温室中继续培养。
1.6 转基因烟草的PCR检测
提取转基因烟草的基因组DNA作为PCR反
应的模板,质粒PBI-MsZIP和未转基因烟草DNA
分别作为阳性和阴性对照,以基因全长引物 MF和
MR进行PCR扩增。PCR检测结果在1%琼脂糖
凝胶上观察。
1.7 转基因烟草的RT-PCR检测
提取抗性苗的总RNA,反转录成cDNA后,以
MF和 MR作为引物,质粒PBI-MsZIP和未转基因
637
第4期 李燕等:紫花苜蓿MsZIP基因超表达载体的构建及烟草转化
烟草的cDNA分别作为阳性和阴性对照,进行PCR
扩增。扩增产物在1%琼脂糖凝胶上电泳分析。
1.8 转基因烟草的Southern-blot检测
对PCR初步鉴定为阳性的转基因烟草植株进行
Sourther-blot检测。提取转基因烟草的基因组DNA,
以地高辛标记的220bp的MsZIP基因的中间片段
为探针,进行Southern检测。质粒pEASY-MsZIP和
未转基因烟草DNA分别作为阳性和阴性对照。
1.9 转基因烟草的组织化学检测
切取植物组织放入塑料管中,加入染液至完全
浸没样品,抽真空2min后,于37℃温育8h。弃去
染液,用0.1MTris-HCl清洗后,在含有1%戊二
醛的0.1MTris-HCl中15℃下固定2h,依次用0.
1MTris-HCl、50%乙醇和70%乙醇清洗,之后在
无水乙醇中除去叶绿素。在显微镜下观察染色情
况,叶和根直接在体式显微镜下观察,茎做横切片后
在显微镜下观察。
2 结果与分析
2.1 MsZIP基因的编码区cDNA序列的克隆
以紫花苜蓿中苜1号cDNA 为模板,MF和
MR为引物进行PCR扩增,1%琼脂糖电泳显示得
到大约1000bp的片段(图1)。将该片段连接到克
隆载体pEASY-T并转化大肠杆菌,菌体PCR之后
测序。序列比对结果显示没有碱基突变和移码突
变,说明成功克隆得到了该基因的编码区,可以用作
构建植物表达载体。
图1 MsZIP基因编码区的克隆
Fig.1 CloningofMsZIPcodingregion
注:M:Marker;A:基因编码区
Note:M:Marker;A:codingregion
2.2 超表达载体的构建
提取质粒pEASY-MsZIP和PBI121,用限制性
内切酶XbaⅠ和BamHⅠ双酶切,回收目的片段后,
用T4DNA 连接酶连接,连接产物转化大肠杆菌
DH5α感受态。挑取单菌落,菌体PCR检测后,挑
取阳性单菌落,提取质粒PBI-MsZIP,用XbaⅠ和
BamHⅠ双酶切。1%琼脂糖凝胶电泳得到一条约
1000bp的条带(图2),与预期大小相符,表明植物
超表达载体PBI-MsZIP构建成功。
图2 超表达载体酶切鉴定
Fig.2 Identificationofoverexpressedvectors
注:M:Marker;P:双酶切后的质粒PBI-MsZIP
Note:M:Marker;P:plasmiddigestedbyXbaⅠandBamHⅠ
2.3 烟草再生植株的转化
经过农杆菌转化的烟草,在诱芽培养基上生长
2周后,在叶盘周围即可见到再生芽,当再生芽长到
1cm左右时,将再生芽切下,转入生根培养基中培
养,再生植株成苗后,根长10cm,地上部分10cm
左右时,即可转入营养土中,在温室中继续培养
(图3)。
2.4 转基因烟草的PCR检测
经过抗生素的筛选,获得了12株抗性苗,选取
其中的3株进行PCR检测。提取抗性苗的基因组
DNA作为模板,质粒PBI-MsZIP和未转基因烟草
的基因组DNA分别作为阳性和阴性对照模板,以
MF和 MR为引物,进行PCR扩增。1%琼脂糖凝
胶电泳结果显示,这3株抗性烟草苗均可以扩增得
到约1000bp的片段,大小与编码区一致,说明该基
因不含有内含子,这与之前的研究结果一致(图4)。
说明MsZIP基因成功整合到烟草的基因组中,初
步确定这几株抗性苗为成功转化的转基因烟草。
737
草 地 学 报 第20卷
图3 抗性植株
Fig.3Resistantplantlets
图4 再生植株PCR检测
Fig.4 PCRtestingofregenerationplants
注:CK+:阳性对照;CK-:阴性对照;M:Marker;1~3:再生植株PCR鉴定
Note:CK+:positivecontrol;CK-:negativecontrol;
M:DNAMarker;1~3:regenerationplants
2.5 转基因烟草的反转录RT-PCR检测
将筛选出的3株转基因烟草苗提取总RNA,反
转录得到cDNA,质粒PBI-MsZIP和未转基因烟草
的cDNA分别作为阳性和阴性对照模板,以 MF和
MR为引物,进行PCR扩增。PCR产物在1%琼脂
糖凝胶上电泳分析。结果显示这3株抗性烟草苗均
可以扩增得到约1000bp的片段,与目的片段大小
一致(图5)。表明MsZIP 基因在转基因烟草中的
RNA水平也可以正常表达。
图5 再生植株RT-PCR检测
Fig.5 RT-PCRtestingofregenerationplants
注:CK+:阳性对照;CK-:阴性对照;M:Marker;
1~3:再生植株RT-PCR鉴定
Note:CK+:positivecontrol;CK-:negativecontrol;
M:DNAMarker;1~3:regenerationplants
2.6 转基因烟草的PCR检测
转基因植株的Southern-blot检测结果如图6
所示。阳性对照以及1~3号出现杂交信号,阴性对
照没有杂交信号。说明目的基因成功转化到转基因
烟草的基因组中。
2.7 转基因烟草的组织化学检测
采用GUS组织化学检测的方法,观察MsZIP
图6 Southern-blot检测
Fig.6 Southern-blottesting
1~3:再生植株Southern检测;CK+:阳性对照;CK-:阴性对照
1~3:Southerntestingofregenerationplants;CK+:Positivecontrol;CK-:Negativecontrol
基因的组织表达情况。分别取转基因烟草的根、茎、
叶进行检测,转化PBI121质粒的烟草作为阳性对
照,未转基因的烟草作为阴性对照。结果表明,在
根、茎、叶中该基因都可以表达(图7)。
837
第4期 李燕等:紫花苜蓿MsZIP基因超表达载体的构建及烟草转化
图7 转基因烟草组织化学检测
Fig.7 Histochemistrytestingofregenerationplants
注:从左到右依次为:R:根;S:茎;L:叶;从上到下依次为:CK+:阳性对照;CK-:阴性对照;A:转MsZIP基因烟草
Note:Lefttoright:R:root;S:stem;L:leaf;Toptobottom:CK+:positivecontrol;CK-:negativecontrol;A:regenerationplants
3 讨论
试验证明,外源基因转入植物中,可以改变植物的
性状,特别是将bZIP类转录因子转入植物中,可以提
高植物的抗逆性。将辣椒(Capsicumsp.)的一个转录
因子CAbZIP1基因转入拟南芥中,可以提高拟南芥的
抗病性[12]。将大豆(Glycinemax)的bZIP类转录因子
基因GmbZIP44,GmbZIP62和GmbZIP78在拟南芥中
超表达,可以显著提高拟南芥的耐盐性[13]。DREB2C
基因与ABF2类型的bZIP转录因子相结合,在拟南芥
中可以响应ABA的诱导,从而参与逆境调控[14]。采用
农杆菌介导的方法将柽柳(Tamarixchinensis)中一个
新的bZIP基因在烟草中超表达,可以显著提高烟草的
耐盐性[15]。在水稻中超表达转录因子基因OsbZIP72,
可以提高水稻的抗旱能力[16]。bZIP类转录因子已经
在多种植物中分离出来并进行了研究,但是在紫花苜
蓿中克隆MsZIP基因并对其进行功能分析尚属首例。
目前国内土壤盐碱化程度逐渐加剧,土壤盐渍化
成为农业生产面临的重要生物逆境之一,是限制农业
生产的主要因素。因此培育耐盐的作物品种是盐碱地
改良的有效途径。苜蓿作为重要的豆科牧草,在畜牧
业中占有重要的地位,将分子转基因技术应用到苜蓿
育种工作中,配合传统育种技术,对苜蓿现有品种的相
关性状进行改良,已经成为苜蓿育种工作的重要内容。
近年来,苜蓿耐盐相关基因也已经大量的克隆,并逐步
用于苜蓿品种选育中[17]。Winicov等[18]从敏盐紫花苜
蓿(HG2)中筛选出耐盐细胞系(HG2-N1),由该细胞系
培养获得的愈伤组织和植株都具有较强的耐盐性。白
永琴等[19]从紫花苜蓿中克隆得到LEA基因家族的基
因MsLEA3-1在烟草中表达可以显著提高烟草的耐盐
性。Winicov等[20]将Alfinl基因导入苜蓿中,增强了
盐诱导的MsPRP2基因的表达,在植株的生长过程中
其耐盐性得到了提高,并且生长速度加快。Muunik
等[21]从紫花苜蓿中分离出了MAPK 路径第一个关键
酶基因SIMK,序列分析结果表明,它与拟南芥中的
MAPK 基因具有极大的相似性,盐胁迫下其体内的表
达水平上调。刘小琳等[22]将编码中苜1号液泡膜
Na+/H+逆向转运蛋白的基因MsNHX1成功转化紫
花苜蓿中苜1号,以期获得耐盐性更好的苜蓿。
本试验将紫花苜蓿中分离的MsZIP 基因构建
PBI-MsZIP植物超表达载体,由于在目的基因上游加
上了一个35S强启动子,因此它可以调控该基因在转
937
草 地 学 报 第20卷
基因植物中高效的表达。在植物转基因工作中,常采
用模式植物烟草作为载体来研究基因的表达情况,它
的高转化率为研究提供了保障。2010年,靳苗苗等[23]
将紫花苜蓿柠檬酸合成酶基因MsCS成功的转化烟
草,以此来分析该基因在植物抗铝毒害中的作用。
2011年,乌艳红等[24]成功的克隆了紫花苜蓿GDP解离
酶抑制蛋白基因的cDNA并将其转化烟草,为研究该
基因在植物耐盐耐铝毒害中的作用奠定基础。本试验
通过农杆菌介导的方法转化烟草,成功获得了12株抗
性苗,对其中的3株进行了PCR,RT-PCR,Southern-
blot和GUS组织化学检测,结果证实MsZIP基因已经
成功的整合到烟草基因组中并进行表达。成功获得了
超表达的转基因烟草植株,为后期研究该基因在耐盐
中的作用提供了材料,也为今后将该基因在其他作物
和牧草中表达,并开展抗逆基因工程奠定了基础。
参考文献
[1] 杨颖,高世庆,唐益苗,等.植物bZIP转录因子的研究进展[J].
麦类作物学报,2009,29(4):730-737
[2] LambP,McKnightSL.Diversityandspecificityintranscrip-
tionalregulation:thebenefitsofheterotypicdimerization[J].
TrendsinBiochemistryScience,1991,16(1):417-428
[3] WalshJ,FreedingM.Theliguleless2geneofmaizefunction
duringthetransitionfromthevegetativetothereproductive
shootapex[J].ThePlantJournal,1999,19(4):489-495
[4] BaileyD,OhareP.TransmembranebZIPtranscriptionfactors
inERstresssignalingandtheunfoldedproteinresponse[J].
AntioxidRedoxSignal,2007,9(12):2305-2322
[5] KimS,KangJY,ChoDI,etal.ABF2,anABRE-binding
bZIPfactor,isanessentialcomponentofglucosesignalingand
itsoverexpressionaffectsmultiplestresstolerance[J].The
PlantJournal,2004,40(1):175-187
[6] NijhawanA,JainM,TyagiAK,etal.Genomicsurveyand
geneexpressionanalysisofthebasicleucinezippertranscrip-
tionfactorfamilyinrice[J].PlantPhysiology,2008,146(2):
333-350
[7] ZouM,GuanY,RenH,etal.AbZIPtranscriptionfactor,
OsABI5,isinvolvedinricefertilityandstresstolerance[J].
PlantMolecularBiology,2008,66(6):675-683
[8] Rodriguez-UribeL,O’Connel M A.Aroot-specificbZIP
transcriptionfactorisresponsivetowaterdeficitstressin
teparybean(Phaseolusacutifolius)[J].JournalofExperi-
mentBotany,2006,57(6):1391-1398
[9] 苏加楷.中国牧草新品种选育的回顾和展望[J].草原与草坪,
2001(4):3-9
[10]李燕.紫花苜蓿 MsZFN锌指蛋白基因启动子MsZPP的克隆
与序列分析[D].呼和浩特:内蒙古农业大学,2009:17
[11]HorschRB,FryJ,HoffmannN,etal.Leafdisctransforma-
tion[M]//GelvinSB,SchilperoortRA,eds.Plantmolecular
biologymanual.Kluwer,Dordrecht,1988:1-9
[12]LeeSC,ChoiHW,HwangIS,etal.Functionalrolesofthe
pepperpathogen-inducedbZIPtranscriptionfactor,CAbZIP1,
inenhancedresistancetopathogeninfectionandenvironmental
stresses[J].Planta,2006,224(5):1209-1225
[13]LiaoY,ZouHF,WeiW,etal.SoybeanGmbZIP44,GmbZ-
IP62andGmbZIP78genesfunctionasnegativeregulatorof
ABAsignalingandconfersaltandfreezingtoleranceintrans-
genicArabidopsis[J].Planta,2008,228(1):225-240
[14]LeeSJ,KangJY,ParkHJ,etal.DREB2Cinteractswith
ABF2,abZIPproteinregulatingabscisicacid-responsivegene
expression,anditsoverexpressionaffectsabscisicacidsensi-
tivity[J].PlantPhysiology,2010,153(2):716-727
[15]WangYC,GaoCQ,LiangYN,etal.AnovelbZIPgene
fromTamarixhispidamediatesphysiologicalresponsestosalt
stressintobaccoplants[J].JournalofPlantPhysiology,2010,
167(1):222-230
[16]LuGJ,GaoCX,ZhengXN,etal.IdentificationofOsbZ-
IP72asapositiveregulatorofABAresponseanddroughttol-
eranceinrice[J].Planta,2009,229(2):605-615
[17]杨青川,孙彦,康俊梅.紫花苜蓿耐盐相关基因克隆研究进展
[J].草地学报,2005,13(3):254-256
[18]WinnicovI,BastolaDR.Salttoleranceincropplants:New
approachesthroughtissuecultureandgeneregulation[J].Ac-
taPhysiologiaePlantarum,1997,19(4):435-449
[19]BaiYQ,YangQC,KangJM,etal.Isolationandfunctional
characterizationofaMedicagosativaL.gene,MsLEA3-1[J].
MolecularBiolologyReports,2012,39(6):2883-2892
[20]WinicovI,BastolaDR.Transgenicoverexspressionofthe
transcriptionfactorAlfinlenhancesexpressionoftheendoge-
nousMsPRP2geneinalfalfaandimprovessalinitytoleranceof
theplants[J].PlantPhysiology,1999,120(2):473-480
[21]MunnikT,Ligterink W,MeskieneI.Distinctosmosensing
proteinkinasepathwaysareinvolvedinsignalingmoderate
andseverehyperosmoticstress[J].PlantJournal,1999,20
(4):381-388
[22]刘小琳,康俊梅,孙彦,等.MsNHX1基因转化紫花苜蓿及转
基因植株的鉴定[J].草地学报,2008,16(2):116-120
[23]靳苗苗,杨青川,金洪,等.紫花苜蓿柠檬酸合成酶基因的克隆
及对烟草的转化[J].草地学报,2010,18(4):550-555
[24]乌艳红,米福贵,李志明,等.紫花苜蓿GDP解离抑制蛋白基
因cDNA的克隆、分析及烟草转化[J].草地学报,2011,19
(1):157-163
(责任编辑 刘云霞)
047