全 文 ：第21卷 第5期
Vol.21 No.5
草 地 学 报
ACTA AGRESTIA SINICA
2013年 9月
Sep. 2013
doi:10.11733/j.issn.1007-0435.2013.05.026
黄连产小檗碱内生真菌的分离鉴定
厉秀秀,方玉鹏,赖 毕,梁 洁,李勤凡*
(西北农林科技大学动物医学院,陕西 杨凌 712100)
摘要:为探索黄连中是否存在产小檗碱的内生真菌,采用组织块法对黄连(CoptischinensisFranch.)中的内生真菌
进行分离,以金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)和大肠埃希菌(Escherichiacoli)为指示菌,用琼脂块法对分
离的内生真菌进行抑菌活性试验,经摇瓶发酵培养后,用薄层层析法(TLC)和高效液相色谱法(HPLC)检测其代谢
产物中的小檗碱,并对其产量进行分析,采用形态学和分子生物学相结合的方法对产小檗碱内生真菌进行鉴定。
结果表明:共分离获得12株内生真菌,其中菌株 HL-BC对金黄色葡萄球菌具有较强的抑菌活性,TLC和 HPLC
检测结果显示,内生真菌 HL-BC的发酵液中含有小檗碱,含量为0.664mg·L-1,根据形态学特征和5.8SrDNA-
ITS序列分析,将其确定为拟茎点霉属(Phomopsis)。这表明黄连中存在能产生小檗碱的内生真菌,为发酵生产小
檗碱及黄连的综合开发奠定了理论基础。
关键词:内生真菌;黄连;小檗碱
中图分类号:Q949.32 文献标识码:A 文章编号:1007-0435(2013)05-1005-07
IsolationandIdentificationofBerberine-ProducingEndophytic
FungusfromCoptischinensisFranch.
LIXiu-xiu,FANGYu-peng,LAIBi,LIANGJie,LIQin-fan*
(ColegeofVeterinaryMedicineNorthwestA&FUniversity,Yangling,ShaanxiProvince712100,China)
Abstract:Endophyticfungiwerefirstisolatedfromsurface-sterilizedplanttissuesofCoptischinensisusing
agar-blockmethod.AntibacterialactivitiesofisolatedendophyticfungiagainstStaphylococcusaureusand
Escherichiacoliwereevaluated.Aftershakeflaskfermentation,thinlayerchromatography(TLC)and
highperformanceliquidchromatography(HPLC)wereemployedtodeterminewhetherthemetabolicsub-
stancescontainedberberineornot.Berberine-producingendophyticfungiwerescreenedandidentifiedby
morphologyandmolecularbiologymethods.Theseresultsshowedthatatotalof12endophyticfungiwere
isolatedfromthetissueofC.chinensis,ofwhichHL-BCstrainexpressedantibacterialactivityagainst
Staphylococcusaureus.TLCandHPLCresultsindicatedthattherewasberberineinthemetabolicsub-
stancesofHL-BCstrain,andtheproductionwas0.664mg·L-1.Accordingtothemorphologicalcharac-
teristicand5.8SrDNA-ITSsequenceanalysis,theHL-BCstrainwasclassifiedasPhomopsis.Therefore,
therewasberberine-producingendophyticfungusexistinginC.chinensis.Thisstudylaidagoodfounda-
tionforthefermentationproductionofberberine,alsoprovidedreferenceandtheorybasisfortheintegrat-
eddevelopmentofC.chinensis.
Keywords:Endophyticfungi;CoptischinensisFranch.;Berberine
黄连(CoptischinensisFranch.),始载于《神农
本草经》,为重要的传统中药,多年生草本植物,属毛
茛科黄连属。黄连是一种广谱抗菌药,很多细菌对
其敏感,如肺炎双球菌(Diplococcuslanceolatus)、
白喉杆菌(Corynebacteriumdiphtheriae)、金黄色
葡萄球菌(Staphylococcusaureus)等G+菌,大肠埃
希菌 (Escherichiacoli)、伤 寒 杆 菌 (Salmonella
typhi)、霍乱弧菌(Vibriocholerae)等G-菌,以及白
色念珠菌(Moniliaalbican)、红色毛癣菌(Tricho-
-phytonrubrum)等真菌[1-2]。近年来发现黄连对肿
收稿日期:2013-03-21;修回日期:2013-05-15
基金项目:陕西省科技攻关项目(2008k02-06-2)资助
作者简介:厉秀秀(1986-),女,山东日照人,硕士研究生,主要从事动物中毒性疾病的研究,E-mail:xiuxiuas123@163.com;*通信作者
Authorforcorrespondence,E-mail:liqinfan@yahoo.com.cn
草 地 学 报 第21卷
瘤、心脑血管系统、血糖及肝脏等多方面具有良好的
药理作用[2-3]。目前,国内外关于黄连的研究主要集
中在植物化学成分和药理药效方面[4],确定其主要
抗菌成分为异喹啉类生物碱-小檗碱(berberine),又
名黄连素,分子式为C20H18NO4[3]。小檗碱通常从
小檗属(BerbersL.)和黄连属植物中提取,黄连为
主要来源。目前,野生黄连资源日趋匮乏,人工种植
周期长、组织培养技术尚不够成熟,人工合成工艺成
本太高,因此,寻找新的可获取小檗碱的途径具有重
要的现实意义。
植物内生真菌(endophytefungi)是指在某一时
期生活在植物各种组织和器官的细胞间或细胞内,
但对宿主植物组织不引起明显病害症状的、并与宿
主植物建立和谐关系的一类真菌[5]。内生真菌具有
多种生物学功能,产生多种生物活性物质,有的内生
真菌具有合成和宿主植物相同或相似活性成分的能
力[6-7]。1993年Stierle等[8]从短叶红豆杉(Taxus
brevifolia)的树皮中分离到一株产新型抗癌物质紫
杉醇(paclitaxel)的内生真菌-安德氏紫杉霉,从而使
抗癌药物的生产领域出现了令人兴奋的结果,同时
这一发现也为微生物发酵法生产活性成分,解决药
用植物药源危机提供了一种新的思路。
目前尚未见有关黄连内生真菌的分离鉴定的报
道,本试验对黄连内生真菌进行分离,利用抑菌试验
筛选具有抑菌作用的菌株,并对其代谢产物进行检
测,旨在筛选出能产生小檗碱的内生真菌,为发酵生
产小檗碱及黄连的综合开发奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
供试材料黄连于2012年2月采于陕西省安康
市镇坪县,经西北农林科技大学生命科学学院植物
学实验室鉴定后洗去泥土,烘干至恒重粉碎后置阴
凉干燥处备用。
供试细菌包括金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌,
均由西北农林科技大学动物医学院微生物实验室提
供。
主要仪器包括:高效液相色谱仪(美国 Waters
公司);Waters-2489型紫外检测器(美国 Waters公
司);PTC-150RCR扩增仪;ER-200RPS604稳压稳
流电泳仪(南京科宝仪器研究所);DYY-III型电泳
槽(北京六一仪器厂);盐酸小檗碱标准品(由西北农
林科技大学动物医学院药理实验室提供,纯度>
99%);DNA聚合酶等分子生物学试剂(TaKaRa公
司);通用引物ITS1和ITS4(南京金斯瑞生物科技
有限公司);乙腈为色谱纯;其余有机试剂均为分析
纯。
1.2 黄连内生真菌的分离、纯化与保存
将采集的黄连表面洗净,晾干水分后进行如下
表面消毒:清水冲洗,75%乙醇漂洗20~30s,无菌
水冲洗4次,8%次氯酸钠溶液浸泡5min,无菌水
冲洗5次,75%乙醇漂洗20~30s,无菌水冲洗4
次;用无菌滤纸片吸干植物组织上的水分,切成5
mm×5mm×1mm大小的组织块接种于PDA培
养基上,20℃恒温培养10~15d。把同样经消毒处
理过的黄连根不作切割直接接种于PDA固体培养
基平板上,置于相同条件下培养做对照试验。待组
织块边缘有菌丝长出,挑取菌丝前端接于新的PDA
培养基上继续培养,经过2~3次纯化,得到纯化菌
株,保存于4℃冰箱。
1.3 产小檗碱内生真菌的筛选
1.3.1 试验菌种的活化扩繁及菌悬液的配制 黄
连内生真菌的纯化及扩繁:将纯化的内生真菌从冰
箱中取出,在无菌操作台上用接种钩挑取适量的真
菌接种到PDA平板中央,置25℃的培养箱中恒温
培养5~7d后备用。
金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌的活化及菌悬液
的配制:用接种环各挑取适量的金黄色葡萄球菌和
大肠埃希菌接种于灭菌的牛肉膏蛋白胨培养基斜面
上,37℃暗培养箱恒温培养24h。用接种环挑取适
量已活化的细菌,分别放入含有20mL无菌水的无
菌试管中,稍加振摇,即得金黄色葡萄球菌和大肠埃
希菌各20mL的菌悬液[9]。
1.3.2 抑菌试验 采用琼脂块法[10]:将每个牛肉
膏蛋白胨培养基平板上加入0.5mL已配制的金黄
色葡萄球菌和大肠埃希菌的菌悬液,用三角玻璃棒
均匀涂布。在每个牛肉膏蛋白胨培养基上用0.6
cm打孔器取出细菌菌饼,然后用直径为0.6cm的
打孔器取扩繁的黄连内生真菌菌饼,将其放入各处
理中,每种样品设3个重复。放入37℃的培养箱,
倒置,恒温培养24h,以十字交叉法测量菌落直径。
以薄层色谱法和高效液相色谱法检测有抑菌作用菌
株的代谢产物中的小檗碱。
1.3.3 抑菌活性产物的检测 将1.3.2中有抑菌
作用的内生真菌在PDA斜面上活化1~2次,将菌
种接入已灭菌的马铃薯葡萄糖液体培养基中,20℃,
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第5期 厉秀秀等:黄连产小檗碱内生真菌的分离鉴定
120r·min-1摇床培养14d后取出过滤,挥干,甲醇
溶解制成供试品溶液,用薄层色谱法和高效液相色
谱法检测其中的小檗碱。
1.3.3.1 薄层色谱法检测 取菌种发酵液100
mL,用旋转蒸发仪浓缩挥干,用甲醇溶解制成供试
品溶液。取盐酸小檗碱标准品适量溶于甲醇,制成
标准品溶液。吸取上述供试品溶液、标准品溶液适
量,分别点样于同一薄层板上,正丁醇-冰醋酸-水
(7∶1∶2)为展开剂,上行展开,晾干,置紫外灯下检
测(波长为254nm),比较供试品斑点颜色位置与对
照品主斑点的颜色位置,初步筛选产生小檗碱的内
生真菌[11]。
1.3.3.2 高效液相色谱法检测 色谱条件与系统
适用性试验:C18柱(4.6mm×150mm,10μm),以十
八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;以乙腈-0.05%磷酸溶
液(25∶75)为流动相;柱温30℃;流速0.6mL·min-1;
检测波长为345nm。理论板数盐酸小檗碱峰计算
应不低于5000[12]。
精密称取105℃干燥5h的盐酸小檗碱标准品,
用甲醇配成1,2,3,4,5mg·L-1浓度梯度的标
准品溶液(重复3次)。取菌种发酵液50mL,用旋
转蒸发仪浓缩挥干,用10mL甲醇溶解制成供试品
溶液。离心,取上清,用微孔滤膜(0.45μm)过滤,
取续滤液。分别精密吸取标准品溶液与供试品溶液
各10μL注入液相色谱仪,测定峰面积。以标准品
溶液浓度(mg·L-1)为横坐标(x),以峰面积为纵坐
标(y)求回归方程,计算菌种发酵液中小檗碱浓度。
1.4 产小檗碱内生真菌的鉴定
1.4.1 形态学鉴定 采用点植培养法[13]:用接种
针挑取少量菌丝点植在PDA平板上,于20℃下培
养10~15d,观察菌落大小、颜色、表面纹饰、质地、
高度、菌落边缘形状等;采用插片法,将菌种在20℃
培养皿上进行插片培养,在光学显微镜下观察并记
录菌丝和孢子的形态特征。依据真菌的形态分类学
方法,初步确定产小檗碱菌株的种属地位。
1.4.2 分子生物学鉴定 真菌基因组DNA的提
取采用改良CTAB法提取[14]。5.8SrDNA-ITS片
段的 PCR 扩增[15]采用真菌通用引物ITS1 和
ITS4。PCR采用50μL反应体系:引物各2μL,模
板2μL,ExTaq25μL,加双蒸水至50μL。反应条
件为:94℃预热5min;98℃变性15s;55℃退火30
s;72℃延伸1min;反应30个循环,72℃再延伸5
min。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测,测序
委托测序公司进行。通过NCBI数据库的Blast程
序在线比对分析,以DNAStar软件MegAlign方法
进行聚类分析,以DNAman软件,Neghbor-joining
方法构建系统进化树[16]。最后,根据内生真菌的形
态学分类方法和ITS序列构建的系统发育树,结合
文献报道,对该内生真菌进行种属分类。
2 结果与分析
2.1 黄连内生真菌的分离
黄连样品通过真菌分离培养共得到12株内生
真菌,全部来自于黄连根部。
2.2 产小檗碱内生真菌的筛选
2.2.1 抑菌试验 采用琼脂块法对分离得到的12
株内生菌的抑菌活性进行初步筛选。结果表明,培
养24h后,黄连内生真菌 HL-BC对金黄色葡萄球
菌具有明显的抑菌活性(图1),抑菌圈直径在20~
26mm,平均22.3mm,对大肠埃希菌无明显的抑制
作用。
2.2.2 抑菌活性产物的检测 薄层色谱法检测表
明,紫外灯下,菌株 HL-BC发酵液供试品出现与盐
酸小檗碱标准品颜色和Rf值相同的黄色荧光斑点,
初步确定该株真菌可能产生小檗碱。
高效液相色谱法检测显示,小檗碱标准品在
6.699min出现峰值。内生真菌 HL-BC的发酵液
供试品与标准品在相同的时间处出现相同的吸收峰
(图2)。结合薄层色谱检测结果,可确定内生真菌
HL-BC的发酵液中含有小檗碱。
精密吸取不同浓度的标准品溶液10μL注入液
相色谱仪,测定峰面积。以浓度(mg·L-1)为横坐标
(x),以峰面积为纵坐标(y)计算回归方程。由图3可
知,回归方程为y=12830x+9887.1,R2=0.9907。
以上结果表明溶液浓度在1~5mg·L-1范围内,峰
面积与小檗碱标准品浓度呈良好的线性关系。根据
发酵液提取物的HPLC峰面积值,由所得出的回归方
程计算出供试品中小檗碱的含量为3.320mg·L-1,
因此发酵液中小檗碱的含量为0.664mg·L-1。
2.3 产小檗碱内生真菌的鉴定
2.3.1 形态学鉴定 内生真菌 HL-BC在28℃培
养基上平均生长速度为3.2mm·d-1,生长不旺
盛,菌丝较发达。初期菌落为白色,气生菌丝稀疏,
生长较缓慢,3~4d后,菌落开始变厚变粗糙,出现
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草 地 学 报 第21卷
图1 内生真菌HL-BC对金黄色葡萄球菌的抑制作用
Fig.1 AntibacterialactivityofHL-BCagainsttheStaphylococcusaureus
图2 小檗碱标准品和 HL-BC发酵液的 HPLC分析
Fig.2 HPLCanalysisofstandardberberinehydrochlorideandfermentationbrothofHL-BC
注:A:小檗碱标准品;B:HL-BC发酵液
Note:A:standardberberinehydrochloride;B:fermentationbrothofHL-BC
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第5期 厉秀秀等:黄连产小檗碱内生真菌的分离鉴定
图3 盐酸小檗碱标准品的标准曲线
Fig.3 Thecalibrationcurvesofstandardberberinehydrochloride
淡黄色菌丝缕,菌落圆形扁平呈放射状,较致密,边
缘不规则,背面中央呈淡黄色;显微镜观察可以看
到,气生菌丝较致密,菌丝呈树枝状,有横膈膜,产生
孢子,分生孢子梗无色,细长,分枝,有横膈膜,甲型
分生孢子无色,长椭圆形,含2个油球,大小为(2~
4)μm×(1~1.5)μm,乙型分生孢子无色,钩形,不
含油球,大小(10~20)μm×1.0μm(图4),符合拟
茎点霉(Phomopsis)的属级特征[17]。
图4 产小檗碱内生真菌HL-BC的形态特征(标尺长度为20μm)
Fig.4 Morphologicalcharacteristicofberberine-producingendophyticfungusHL-BC(Bar=20μm)
注:A:菌丝形态;B:甲型孢子;C:乙型孢子
Note:A:morphologyofhypha;B:αconidia;C:βconidia
2.3.2 分子生物学鉴定 核苷酸序列测定结果显
示,HL-BC菌株的ITS片段长度为502bp(图5),
该片段包括ITS1,5.8SrDNA和ITS2的序列,以
及18sDNA和28sDNA的部分序列。将测定的碱
基序列与GenBank中的已知序列进行Blast比对分
析,结果显示,HL-BC菌株扩增片段的碱基序列与
Phomopsis(GenBank:HQ832815)的序列相似性为
99%。由HL-BC菌株的rDNAITS序列与其他种
属种的相应序列构建系统进化树(图6),结果显示
HL-BC菌株与Phomopsis是同一个属。结合形态
学分类结果,将内生真菌菌株 HL-BC确定为拟茎
点霉属。
3 讨论
黄连是我国传统的名贵中药,其主要成分小檗
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草 地 学 报 第21卷
图5 黄连内生真菌HL-BC5.8SrDNA-ITS序列扩增片段的凝胶电泳分析
Fig.5 Agaroseelectrophoresisofamplified5.8SrDNA-ITSregionofHL-BC
注:M:DNAMaker2000;1,2:HL-BC的PCR产物;3:阴性对照
Note:M:DNAMaker2000;1,2:PCRproductsofHL-BC;3:Negativecontrol
图6 黄连内生真菌HL-BC的5.8SrDNA-ITS序列系统进化树
Fig.6 Phylogenetictreebasedonthe5.8SrDNAsequencesofendophyticfungusHL-BCstrain
碱是常用抗菌药物,并具有降血压、降血脂、降血糖、
抗心律失常、抗血小板聚集等药理作用[1-3],在临床
上用量很大。但黄连生长周期长、产量低,同时受到
盲目开采,导致大部分野生黄连处于濒危或渐危状
态,人们试图通过其他途径获得黄连的有效成分小
檗碱。但目前小檗碱的化学合成方法尚不成熟,细
胞工程方法生产小檗碱尚未有报道。鉴于许多药用
成分 已 从 其 内 生 真 菌 的 代 谢 产 物 中 分 离 得
到[8,18-21],且植物内生真菌培养具有不受时域限制,
生产成本低等优点,因此,从黄连内生真菌中筛选可
产生小檗碱的内生真菌,进行小檗碱的开发不失为
一条有效途径[22]。已有文献报道从黄檗(Phello-
dendronamurense)植物中分离出产小檗碱的内生
真菌[23-24],但从黄连中分离产小檗碱的内生真菌的
研究尚未见报道。本研究首次从黄连中分离得到1
株产小檗碱的内生真菌HL-BC,证实黄连中存在可
产小檗碱的内生真菌,其产量为0.664mg·L-1,经
形态学特征和5.8SrDNA-ITS序列分析,确定该菌
株为拟茎点霉属,具有新颖性,为发酵生产小檗碱及
黄连的综合开发提供科学依据,同时也为药用植物
内生真菌的研究提供了新资料。
与黄檗产小檗碱内生真菌[25]的产率相比
(1.6474mg·L-1),黄连内生真菌 HL-BC的产率较
低(0.664mg·L-1),这可能与宿主植物和生长环境
的差异等因素有关,因此,有必要对黄连内生真菌菌
株HL-BC进行进一步的研究,如何通过诱变育种、
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第5期 厉秀秀等:黄连产小檗碱内生真菌的分离鉴定
培养条件的优化以及培养基的优化等来提高发酵产
物中小檗碱的产量,是今后需要研究解决的问题。
此外,本研究是定向筛选能产生小檗碱的内生真菌,
此过程容易导致其他重要的有益成分,如表小檗碱、
黄连碱等成分不能被发现,因此,还需进一步研究来
探索黄连内生真菌是否还产生其他有益的活性成
分。
4 结论
本试验从黄连中分离得到12株内生真菌,其中
菌株HL-BC具有抑菌作用,应用薄层色谱法和高
效液相色谱法对其发酵液进行检测,确定菌株 HL-
BC的发酵液中含有小檗碱,含量为0.664mg·L-1,
经形态学特征和5.8SrDNA-ITS序列分析,确定菌
株HL-BC为拟茎点霉属,表明黄连中存在产小檗
碱的内生真菌,为发酵生产小檗碱及黄连的综合开
发奠定了基础,为药用植物内生真菌的研究提供了
参考依据和借鉴。
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(责任编辑 李美娟)
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