全 文 ：第 18 卷
第 1 期

Vol. 18
No. 1
草
地
学
报
ACTA AGRESTIA SINICA



2010 年
1 月

Jan.

2010
利用 RAPD标记对不同秋眠级苜蓿种质的聚类和评价
刘荣霞1, 2 , 于林清1, 5* , 张
宇3, 苏
东4 , 云锦凤5
( 1.中国农业科学院草原研究所 , 内蒙古呼和浩特
010010; 2.甘肃省金川集团公司生活服务分公司园林公司, 甘肃 金昌
737100;
3. 内蒙古农业大学林学院, 内蒙古 呼和浩特
010018; 4.内蒙古大学生命科学院, 内蒙古 呼和浩特
010021;
5.内蒙古农业大学生态环境学院, 内蒙古 呼和浩特
010019)
摘要 : 利用 RAPD标记对 25 份不同秋眠等级的苜蓿材料进行分析,构建了 25 份苜蓿材料的 DNA 指纹图谱,用两
种方法(特异的谱带类型和不同引物谱带类型的组合)可以有效的鉴别苜蓿单株, 说明 RAPD 标记是鉴定苜蓿的一
种有效方法。通过计算 25 份苜蓿材料的遗传距离, 进行聚类分析,探讨它们之间的亲缘关系。结果如下: 25 份苜
蓿材料间的遗传距离介于 4. 69- 8. 14 之间, 说明材料间的遗传距离较大, 亲缘关系较远, 遗传基础较宽;从 50 条
RAPD引物中筛选出 19 条引物, 总共扩增出 144 条带, 其中 134 条呈多态性, 占 93. 05% , 10 条为单态性带, 占
6. 94% ; 遗传距离为 7. 39时, 试验材料可以分为差异明显的 4 类, 苜蓿材料间有较大的遗传差异, 这为苜蓿引种、
亲本选配,分子标记辅助选择育种提供良好的理论基础和科学依据。
关键词: RAPD,秋眠级, 苜蓿,聚类分析
中图分类号: Q527. 3; S541



文献标识码: A




文章编号: 1007-0435( 2010) 01-0108-07
Clustering and Evaluation of Alfalfa Germplasms with Different Fall
Dormancy Levels by RAPD Markers
LIU Rong-xia
1, 2
, YU Lin-qing
1, 5*
, ZHANG Yu
3
, WU Dong
4
, YU N Jin- feng
5
( 1. Grassland Research Ins ti tute, C hinese Academy of Agricultural Science, H ohhot , In ner Mongolia Auton om ous Region 010010, China;
2. Lan dscape Bran ch, Living Service Grou p, J in C huan Group, Jin Chang, Gansu Province 737100, China; 3. Colleg e of Forest ry
S cien ce, Inner M ong ol ia Agricul tu ral U nivers ity, H ohhot , Inn er Mongolia Autonom ou s Region 010018, China; 4. College of
Life S cien ce, Inner M on gol ia University, Hohhot , Inner M ongolia Autonomous Region 010021, C hina; 5. College of Ecology
and Environm ental Sciences, In ner Mongolia Agricultural University, Hohhot, Inner M on gol ia Autonomous Region 010019, Ch ina)
Abstract: RAPD technology w as employed to analyze the 25 alfalfa accessions w ith dif ferent fall dormancy
lev els and the RAPD fingerpr int ing w ere const ructed. T w o independent and ef fective w ays, including u-
nique band types and combination of the band types of different primers, in ident ificat ion of the alfalfa ind-i
v iduals w ere proved, w hich indicates that RAPD is very ef fective to ident ify alfalfa g ermplasms. The ge-
netic distance in tested alfalfa materials w as betw een 4. 69 and 8. 14, which suggested that the genet ic d-i
v ersity of alfalfa w as high and the genet ic base w as w ide. To tally 144 bands w ere generated w ith 19 RAPD
primers, of w hich 134 ( 93. 05% ) w ere polymorphic, 10 ( 6. 94%) w ere monomo rphic. T he cluster analysis
based on RAPD markers revealed that the tested materials belonged to four groups by
CD= 7. 39. T here
w as a w ide genetic dif ference among the tested materials, which w ould provide the theor et ical base for g e-
netic improvement and select ion of cross-bred parents in alfal fa.
Key words: RA PD; Fall do rmancy level; Alfalfa; Cluster ing analy sis


苜蓿(Medicago sat iv a L. )因其优质高产而享
有
牧草之王
的美称,是世界上栽培最广泛, 也是我
国栽培历史最悠久的优良牧草之一 [ 1]。秋眠性是苜
蓿的一种生长特性, 它是苜蓿对光照及气温变化的
一个综合反应。美国将苜蓿的秋眠性划分为 9级标
准 ,并作为全美苜蓿评价和商业化生产的第一评定
收稿日期: 2009-04-03;修回日期: 2009- 12-15
基金项目:国家自然科学基金( 30371487)、国家科技支撑项目( 2008BADB3B06)、863 项目( 2008AA10Z149) ,内蒙古草地生态学重点实验
室课题( 2007- 01)
作者简介:刘荣霞( 1980-) ,女,甘肃金昌人,硕士, 研究方向为牧草种质资源与育种, E- mail : liu- rong-x ia@ hotmail. com; * 通讯作者 Au-
thor for correspondence, E-m ail: lin qin g-yu@ 126. com
第 1期 刘荣霞等:利用 RAPD 标记对不同秋眠级苜蓿种质的聚类和评价
指标[ 2] 。苜蓿的秋眠性在品种鉴定、制定种植区划、
预测抗寒性、推广及引进品种等生产实际中也得到
广泛地利用[ 3]。
DNA 分子标记已在动植物遗传育种中得到了
广泛应用。其中 RAPD ( Random Amplified Po ly-
morphf ic DNA)随机扩增多态性 DNA 作为一种以
PCR技术为基础的分子标记技术, 具有简单易行、
DNA 样品需求少、成本低、无放射性、不需要探针等
优异特点。目前该方法被广泛的应用于种质资源的
鉴定、遗传多样性分析、亲缘关系分析、连锁图谱的
构建、分子标记辅助育种等方面[ 4~ 10 ]。李拥军等 [ 11]
利用 RAPD分子标记技术对中国 18个苜蓿地方品
种和北美 9个苜蓿代表品种分别进行了聚类分析;
毕玉芬等[ 12] 利用 RA PD分子标记技术计算了 13个
弱秋眠性紫花苜蓿品种间的遗传距离, 并进行聚类
分析;蒿若超等 [ 13]利用 RAPD分子标记对 53 份苜
蓿种质资源进行了分析。分子标记已经成为苜蓿遗
传育种研究和种质资源评价的有力工具。
本实验以不同秋眠等级的苜蓿为材料, 应用
RAPD分子标记对这些代表性材料进行遗传分析,
为了解苜蓿遗传背景,指导苜蓿种质资源的引进、利
用和遗传改良, 进而进行品种鉴定和分子标记辅助
选择育种等提供科学依据。
1
材料与研究方法
1. 1
实验地自然概况
实验地位于呼和浩特市南部郊区中国农业科学
院草原研究所农牧交错试验示范基地。地理位置为
北纬 40
34
,东经 111
56
,海拔1065 m ;属大陆性半
干旱气候,干旱、寒冷、多风沙。年平均气温 5. 8-
6. 3
, 7月份极端高温 37. 3
, 1 月份极端低温-
32. 8
,大于 10
积温 2700
以上, 无霜期 130 天
左右。年平均降水 440 mm。土壤类型为浅色草甸
土,沙壤有机质含量为 0. 6%。
1. 2
实验材料
本实验所选的 25份具有代表性的苜蓿材料均
为生长势良好的不同秋眠级别的苜蓿单株,其编号、
品种名称、类型、秋眠级及材料来源(表 1)。
1. 3
方法
1. 3. 1
基因组 DNA的提取
在苜蓿初花期, 对各
供试材料进行取样,并存储于- 80
的超低温冰箱
中待用。采用植物基因组提取试剂盒(上海生工)进行
DNA的提取,并用紫外分光光度法和0. 8%的琼脂糖
凝胶(加核酸染料)电泳检测 DNA的浓度、纯度。
1. 3. 2
RAPD-PCR 反应体系的建立
PCR 反应
体系为:总体积为 20
L,其中 1
L 引物, 1
L 的
DNA 模板约 30 ng, 10
L 的 2
T aq PCR Mater-
M ix , 8
L 灭菌水。
PCR扩增程序为: 94
预变性 3 m in; 进入循
环, 94
变性 20 s, T m 复性 30 s, 72
延伸 1 min,
共 40个循环; 最后 72
延伸 10 min, 于 4
保存。
根据不同引物设置不同退火温度 Tm 值。
对 50个随机引物(上海生工)进行初步 PCR扩
增,淘汰扩增结果不稳定的引物, 再以 12 个实验材
料的 DNA 为模板,对所选引物进行 PCR 扩增以筛
选多态性稳定、条带清晰的 RAPD标记。
PCR扩增产物用 1. 5% ( w / v )的琼脂糖凝胶电
泳检测, 稳定功率 70W电泳 50 min 左右,再用凝胶
成像仪观察扩增结果并拍照保存。
1. 3. 3
数据分析
采用 Quantity one 统计软件对
扩增谱带进行统计, 每个引物所有扩增片段按分子
量大小的顺序排列, 全部材料在重复扩增过程中稳
定出现的带无论强弱均赋值为 1 ,不存在时赋值为
0
[ 14]
,建立 0、1 统计表, 利用 DPS 软件计算苜蓿单
株间的欧氏遗传距离, 采用类平均法( Unw eighted
Pair Group Method Arithmet ic averages, U PGMA)对
遗传距离矩阵进行聚类分析,构建遗传聚类图。
2
结果与分析
2. 1
RAPD-PCR扩增谱带分析
2. 1. 1
特异的谱带类型
利用不同秋眠级苜蓿材
料为模板 DNA ,经 PCR扩增后,筛选出 19条均能
扩增出清晰条带, 且扩增效果良好、多态性高的引物
(表 3) ,其中引物 S20、S146、S52、S311和 S156产生
了丰富的谱带类型, 可以用来对苜蓿材料进行鉴别
(表 2、图 1)。例如引物 S20 的 20种谱带类型中的
15种特异性谱带就可以鉴别 UC1465 、UC1887、
CUF101、Pierce、Dona Anna、ABI700、Sima593、Maver-
ick、锡盟黄花苜蓿 4、锡盟黄花苜蓿 2、疏付、博乐-1、
龙牧 801、富蕴-1和图牧 1号 15份实验材料(图 1)。
2. 1. 2
不同引物谱带类型的组合
将能产生丰富
谱带类型的引物进行组合,这样就可以利用引物间
的互补性获得最大的鉴定能力, 以此对苜蓿进行更
好的鉴定。S20和 S146两条引物的带型组合可以
鉴别 21 株苜蓿; S20、S146 和 S52 等 3 条及 S20、
S146、S52和 S311等 4条引物带型组合都可以鉴别
24株苜蓿; S20、S146、S52、S311和 S156 等 5条引
物带型组合可以鉴别所有 25株苜蓿(表 2)。
109
草
地
学
报 第 18卷
表 1
供试苜蓿品种
T able 1
25 alfalfa mater ials tested in t his experiment
编号
No.
材料名称
Material
类型
Type
秋眠等级
Fall dorman cy level
来源
S ource
1 U C1465 UC1465
紫花苜蓿
Med icag o sa ti v a L.
11
美国农业部
United States Department of Agricu lture
2 U C1887 UC1887
紫花苜蓿
Med icag o sa ti v a L.
10
美国农业部
United States Department of Agricu lture
3 CU F101 CUF101
紫花苜蓿
Med icag o sa ti v a L.
9
美国农业部
United States Department of Agricu lture
4 Pier ce Pierce
紫花苜蓿
Med icag o sa ti v a L.
8
美国农业部
United States Department of Agricu lture
5 Dona Anna Dona Anna
紫花苜蓿
Med icag o sa ti v a L.
7
美国农业部
United States Department of Agricu lture
6 ABI700 ABI700
紫花苜蓿
Med icag o sa ti v a L.
6
美国农业部
United States Department of Agricu lture
7 Sim a593 Sima593
紫花苜蓿
Med icag o sa ti v a L.
5
美国农业部
United States Department of Agricu lture
8 Ran ger Ranger
紫花苜蓿
Med icag o sa ti v a L.
3
美国农业部
United States Department of Agricu lture
9 Maverick M averick
紫花苜蓿
Med icag o sa ti v a L.
1
美国农业部
United States Department of Agricu lture
10 锡盟黄花苜蓿 4 Falcata-4( Ximeng) 黄花苜蓿
Med icag o f alcata L .
1
中国农业科学院草原研究所
Gras sland Research Inst itute of CAAS
11 锡盟黄花苜蓿 3 Falcata-3( Ximeng) 黄花苜蓿
Med icag o f alcata L .
1
中国农业科学院草原研究所
Gras sland Research Inst itute of CAAS
12 黄花苜蓿 2 Falcata-2 黄花苜蓿
Med icag o f alcata L .
1
俄罗斯
Russia
13 黄花苜蓿 1 Falcata-1 黄花苜蓿
Med icag o f alcata L .
1
美国农业部
United States Department of Agricu lture
14 锡盟黄花苜蓿 2 Falcata-2( Ximeng) 黄花苜蓿
Med icag o f alcata L .
1
中国农业科学院草原研究所
Gras sland Research Inst itute of CAAS
15 新疆黄花苜蓿 Falcata( Xinjian g) 黄花苜蓿
Med icag o f alcata L .
1
中国农业科学院草原研究所
Gras sland Research Inst itute of CAAS
16 锡盟黄花苜蓿 1 Falcata-1( Ximeng) 黄花苜蓿
Med icag o f alcata L .
1
中国农业科学院草原研究所
Gras sland Research Inst itute of CAAS
17 疏付 Shufu 紫花苜蓿
Med icag o sa ti v a L.
1
中国农业科学院草原研究所
Gras sland Research Inst itute of CAAS
18 博乐-1 Bole-1 紫花苜蓿
Med icag o sa ti v a L.
1
中国农业科学院草原研究所
Gras sland Research Inst itute of CAAS
19 肇东 Zhaodong 紫花苜蓿
Med icag o sa ti v a L.
1
中国农业科学院草原研究所
Gras sland Research Inst itute of CAAS
20 龙牧 801 Longmu801
扁蓿豆与紫花
苜蓿杂交种
M eli lotoid es ru thenicu s( L. )
Sojak
Med icag o sa ti v a L.
1
黑龙江省畜牧研究所
Animal Research Institute of
H eilongjiang Province
21 塔什库尔干 T ashikuergan 紫花苜蓿
Med icag o sa ti v a L.
1
中国农业科学院草原研究所
Gras sland Research Inst itute of CAAS
22 富蕴-2 Fuyun-2 紫花苜蓿
Med icag o sa ti v a L.
1
中国农业科学院草原研究所
Gras sland Research Inst itute of CAAS
23 富蕴-1 Fuyun-1 紫花苜蓿
Med icag o sa ti v a L.
1
中国农业科学院草原研究所
Gras sland Research Inst itute of CAAS
24 图牧 1号 Tumu No. 1 紫花苜蓿
Med icag o sa ti v a L.
1
中国农业科学院草原研究所
Gras sland Research Inst itute of CAAS
25 图牧 2号 Tumu No. 2 紫花苜蓿
Med icag o sa ti v a L.
1
中国农业科学院草原研究所
Gras sland Research Inst itute of CAAS
110
第 1期 刘荣霞等:利用 RAPD 标记对不同秋眠级苜蓿种质的聚类和评价
图 1
苜蓿 RAPD扩增的 DNA指纹图谱
Fig. 1
RAPD fingerpr inting o f alfalfa ( pr imer S20)
M: Marker; 1-25:试验材料名称见表 1 ( S ee T able 1 for nam e of tested m aterial)
表 2
RAPD扩增带型及鉴定能力
Table 2
RAPD amplification band patterns and their identification capacity
编号
No
材料名称
Material
S 20 S146 S52 S311 S156 S20
S20
S146
S20,
S 146,
S 52
S20,
S146, S52,
S311
S20, S 146,
S52, S 311,
S156
1 UC1465 UC1465 A A A A A + + + + +
2 UC1887 UC1887 B A B B B + + + + +
3 CU F101 CUF101 C B C C C + + + + +
4 Pier ce Pierce D C D D C + + + + +
5 Dona Anna Dona Anna E D E E D + + + + +
6 ABI700 ABI700 F E F F E + + + + +
7 Sim a593 Sima593 G F G G F + + + + +
8 Ran ger Ranger H G H H G - + + + +
9 Maverick M averick I H I I H + + + + +
10 锡盟黄花苜蓿 4 Falcata-4 ( Xim eng) J I J J I + + + + +
11 锡盟黄花苜蓿 3 Falcata-3 ( Xim eng) H J K J J - - - - +
12 黄花苜蓿 2 Falcata-2 K J L K K - - + + +
13 黄花苜蓿 1 Falcata-1 L K K L L - + + + +
14 锡盟黄花苜蓿 2 Falcata-2 ( Xim eng) M L M M M + + + + +
15 新疆黄花苜蓿 Falcata ( Xinjiang) K M N L N - + + + +
16 锡盟黄花苜蓿 1 Falcata-1 ( Xim eng) N N O N O - + + + +
17 疏付 Shufu O O P O P + + + + +
18 博乐-1 Bole-1 P P Q P Q + + + + +
19 肇东 Zhaodong N Q Q Q R - + + + +
20 龙牧 801r Longmu801 Q R R R S + + + + +
21 塔什库尔干 T ashikuergan R S S S T - - + + +
22 富蕴-2 Fuyun-2 L S T T U - - + + +
23 富蕴-1 Fuyun-1 S S U U V + + + + +
24 图牧 1号 Tumu No. 1 T T G V R + + + + +
25 图牧 2号 Tumu No. 2 R U V W U - + + + +
合计 T otal 20 21 22 23 22 15 21 24 24 25


注:字母代表每个引物的谱带类型;
+
代表该资源可以用于鉴定;
-
代表该资源不能用于鉴定
Note: Let ter repres ents the band ty pe of primer;
+
repres ents the g ermplasm can b e discriminated by the prim er;
-
represents the
g ermplasm cann ot be dis criminated by the primer
2. 2
不同秋眠级苜蓿 RAPD多态性分析
本实验以 50个随机引物对 12个实验材料进行
PCR扩增,其中 19 条引物扩增后都能得到清晰的
条带见图 1。对这 19 条引物的扩增结果进行统计
分析(表 3)。19条引物总共扩增出 144 条带, 134
条呈多态性, 10 条为共有带(引物 S28、S37、S47、
S70、S73、S89、S109、S141、S146和 S152) ,平均每个
引物产生 7. 58条扩增带和 7. 05条多态性带, 多态
性带比率平均为 92. 54% ; 其中扩增带数最少的引
物是 S47和 S123,带数变幅为 1- 4, 扩增带数最多
的是S311,带数变幅为 2- 7;且同一材料,不同引物
进行扩增产生的条带数也有差异, 最大变幅为 1-
7, 最小变幅为 1- 5。可见不同引物对不同材料的
扩增条带数差异很大 [ 6] ;同一引物在不同材料上具
有不同的指纹图谱,而且多态性丰富,较好地显示了
苜蓿的遗传多样性。
111
草
地
学
报 第 18卷
表 3
不同 RAPD引物扩增结果
Table 3
Amplificat ion results of differ ent RAPD primer s
引物名称
Primer
nam e
序列
Primer
sequence
总带数
Total
band no.
多态性带数
Polymorphic
band no.

多态性比率(% )
Polym or phic
band
percentage
S1 GTT T CGCTCC 6 6 100
S20 GGACCCT T AC 7 7 100
S28 GT GACGTAGG 8 7 87. 5
S37 GACCGCT TGT 9 8 88. 88
S47 T TGGCACGGG 4 3 75
S52 CACCGT ATCC 10 10 100
S70 T GT CT GGGTG 8 7 87. 5
S73 AAGCCTCGT C 7 6 85. 71
S74 T GCGTGCT TG 9 9 100
S89 CTGACGTCAC 6 5 83. 33
S109 TGT A GCT GGG 7 6 85. 71
S123 CCT GAT CACC 4 4 100
S140 GGT CTAGAGG 6 6 100
S141 CCCAA GGTCC 7 6 85. 71
S146 AAGACCCCTC 10 9 90
S152 T TA TCGCCCC 9 8 88. 88
S156 GGT GACTGT G 9 9 100
S264 CAGAAGCGGA 7 7 100
S311 GGAGCCTCAG 11 11 100
总数
Total
144 134
平均数
Average
7. 58 7. 05 92. 54
2. 3
不同秋眠级苜蓿材料间的遗传距离与聚类分析
利用 19条 RAPD引物产生的 144条 DNA 片
段计算 25株不同秋眠等级苜蓿材料间的平均遗传
距离为 6. 6964,并进行聚类分析(图 2)。从图 2和
表4都可以反映出这25株不同秋眠级苜蓿材料间
的亲缘关系, U C1887 与 CU F101亲缘关系最近聚
为一类 (遗传距离为 4. 69) ; 其次是 U C1887 与
Pierce聚为一类(遗传距离为 5. 56) ; 图牧 2号与图
牧 1号,肇东与龙牧 801,图牧 1号与富蕴-2等聚为
一类;锡盟黄花苜蓿 4与 U C1465的亲缘关系最远
(遗传距离为 8. 14)。这说明材料间的遗传距离较
大,亲缘关系较远,遗传基础也较宽。


根据苜蓿植株间的遗传距离进行划分时,在遗
传距离为 7. 39时, 可将 25个材料聚成 4 个类组。
第 1 组为 UC1465、UC1887、CUF101、Pierce、Dona
Anna、ABI700; 第 2组为 Sima593、Maverick、疏付、
肇东、龙牧801、塔什库尔干、富蕴-2、图牧1号、图牧
2号、富蕴-1、Ranger;第 3组为锡盟黄花苜蓿 3、黄
花苜蓿 2、黄花苜蓿 1、新疆黄花苜蓿、博乐-1、锡盟
黄花苜蓿 2、锡盟黄花苜蓿 1;第四组为锡盟黄花苜
蓿 4。聚类结果显示除紫花苜蓿博乐-1外,其他所
有紫花苜蓿单株和黄花苜蓿单株都分别聚在一起。
图 2
不同秋眠等级苜蓿材料 RAPD 聚类图
F ig . 2
Dendrogr am of 25 alfalfa mater ials according to UPGMA cluster analy sis on RAPD data
注:实验材料名称依次为: 1. UC1465; 2. U C1887; 3. CUF101; 4. Pierce 5. Dona Anna 6. ABI700; 7. Sima593; 8 M averick; 9.疏付; 10.肇东
11.龙牧 801; 12.塔什库尔干; 13.富蕴-2; 14.图牧 1号; 15.图牧 2号; 16.富蕴- 1; 17. Ranger 18.锡盟黄花苜蓿 3; 19.黄花苜蓿 2; 20.黄花苜蓿 1
21.新疆黄花苜蓿; 22.博乐-1; 23.锡盟黄花苜蓿 2; 24.锡盟黄花苜蓿 1; 25.锡盟黄花苜蓿 4
Name of tested material ; 9. S hufu 10. Zhaodon g; 11. Lon gmu801; 12. Tash ikuergan; 13. Fuyu n-2; 14. T umu No. 1;
15. Tumu No. 2; 16. Fuyu n-1; 18. Falcata-3( Ximeng) ; 19. Falcata-2; 20. Falcata-1; 21. Falcata( Xinjiang) ;
22. Bole-1; 23. Falcata-2( Ximeng) ; 24. Falcata-1( Xim eng) ; 25. Falcata-4( Ximeng)
112
第 1期 刘荣霞等:利用 RAPD 标记对不同秋眠级苜蓿种质的聚类和评价 113
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报 第 18卷
3
讨论
3. 1
自 20世纪 80年代以来, RAPD技术的广泛应
用,为进行苜蓿品种鉴定研究提供了技术先导和研
究基础[ 15]。魏臻武等 [ 9]从 1500个 RAPD引物中筛
选出多态性高、条带清晰的 36个引物, 构建了苜蓿
基因组 DNA 指纹图谱, 可以用来鉴别不同苜蓿品
种。毛培胜等[ 15] 从 120 条 RAPD 引物中筛选出
S1、S78、S89和 S115共 4条能够产生稳定多态性标
记的随机引物, 通过反应体系的优化、标记程序的完
善, 确定品种特异性标记谱带, 可以鉴别不同的紫
花苜蓿品种。本实验利用筛选到的 19条 RAPD 引
物对不同秋眠等级的苜蓿单株进行了分析, 并构建
了指纹图谱,研究结果表明, RAPD标记可以通过几
种独立的或者组合的方式来鉴别苜蓿单株材料。用
引物 S20的 20种谱带类型中的 15种特异性谱带就
可以鉴别其中的 15份试验材料(图 1) ,而通过 S20、
S146、S52、S311和 S156 等 5条引物带型的组合就
可以鉴别所有的 25株苜蓿(表 2)。
3. 2
利用 RAPD标记对不同秋眠等级的苜蓿材料
进行遗传分析, 从 50条 RA PD引物中筛选出 19条
引物, 这 19条引物总共扩增出 144条带, 其中 134
条呈多态性, 占 93. 05% , 10 条为单态性带, 占
6. 94%。可见引物对试验材料的扩增条带数差异很
大,而且具有丰富的多态性,能较好地显示苜蓿的遗
传多样性。
3. 3
遗传距离及聚类分析的结果表明,不同秋眠等
级苜蓿单株间的遗传距离在 4. 69- 8. 14之间,这说
明材料间的遗传距离较大,亲缘关系较远,遗传基础
也较宽。从聚类图可以看出, 美国农业部提供的紫
花苜蓿 U C1465、UC1887、CUF101、Pierce 和 Dona
Anna聚为一类,且都为高秋眠的苜蓿材料, 秋眠等
级介于 7-11之间。同为黄花苜蓿的黄花苜蓿 2、黄
花苜蓿 1、新疆黄花苜蓿等也聚为一类 (博乐-1 除
外) , 这些都为低秋眠的苜蓿材料。且实验材料被分
为差异明显的四类,这表明苜蓿单株间有较大的遗
传差异。虽然本实验所选材料数量不多, 但所表现
的多态性高、遗传距离大,由此可以说明苜蓿具有更
高的遗传多样性和比较复杂的遗传基础。因此今后
的实验应该增多材料的数量, 筛选更多的引物,选择
更多的指标,以便正确的对苜蓿进行遗传分析。只
有通过分子生物技术对苜蓿的遗传背景进行详细的
研究,才能为苜蓿引种、亲本选配、丰富种质资源和分子
标记辅助选择育种提供良好的理论基础和科学依据。
4
结论
4. 1
从 19条 RAPD引物, 在 25株苜蓿中总共扩
增出 144条带, 其中 134条呈多态性, 占 93. 05%,
10条为单态性带,占 6. 94%。
4. 2
本实验中不同秋眠等级苜蓿单株间有较大的
遗传差异,遗传距离在 4. 69- 8. 14之间, 遗传距离
为 7. 39时, 实验材料可以分为差异明显的四类, 其
中高秋眠等级苜蓿单株明显与其它材料分开。
4. 3
RAPD标记可以通过几种独立的或者组合的
方式来鉴别苜蓿单株材料。用引物 S20的 20种谱
带类型中的 15种特异性谱带就可以鉴别其中的 15
份试验材料, 而通过 S20、S146、S52、S311 和 S156
等 5条引物带型的组合就可以鉴别所有的 25 株
苜蓿。
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