全 文 ：第２１卷　第３期
　Vol．２１　 No．３
草　地　学　报
ACTA AGRESTIA SINICA
　　　　　２０１３年 ５月
　 May　２０１３
doi:１０．１１７３３/j．issn．１００７Ｇ０４３５．２０１３．０３．０２６
紫花苜蓿DExD/HboxRNA解旋酶基因的克隆与分析
高燕丽１,２,龙瑞才３,康俊梅２,张铁军２,杨青川１,２∗,董宽虎１
(１．山西农业大学动物科技学院,山西 太谷　０３０８０１;２．中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,北京　１００１９３;
３．重庆大学生命科学院,重庆　４０００４４)
摘要:基于紫花苜蓿(MedicagosativaL．)盐胁迫抑制消减杂交文库中的一条EST序列,使用RACE技术克隆得
到一条１６７８bp的cDNA序列.核酸序列分析表明该cDNA序列包含一个１２８１bp的最大开放阅读框,编码４２６
个氨基酸,与拟南芥(Arabidopsisthaliana)RNA解旋酶RH１５和RH５６的氨基酸序列相似性在９０％以上,将该基
因命名为MsRH(GenBank序列号:JX５０８６４８).对此基因编码蛋白进行结构域预测表明其含有明显的DEXDc和
HELICc结构域,预测其为DExD/HboxRNA解旋酶.洋葱(Alliumcepa)表皮细胞亚细胞定位分析表明MsRH
定位于细胞核.为进一步研究此基因的功能,构建了MsRH 基因的超表达载体pBIＧMsRH,使用农杆菌介导法转
化烟草(Nicotianatobacum),筛选得到５株具有卡那霉素抗性再生烟草植株.PCR和 RTＧPCR检测结果表明
MsRH 基因成功插入烟草基因组中并表达.使用２５０mMNaCl处理７d后,转基因烟草中脯氨酸含量低于野生型
烟草,而丙二醛和相对电导率则高于野生型烟草.初步试验结果表明转MsRH 基因烟草对盐敏感性升高.
关键词:紫花苜蓿;解旋酶;亚细胞定位;烟草转化
中图分类号:Q９４３．２　　　　文献标识码:A　　　　　文章编号:１００７Ｇ０４３５(２０１３)０３Ｇ０５８１Ｇ０９
CloningandCharacterizationofaDExD/HboxRNA
HelicaseGenefromMedicagosativaL．
GAOYanＧli１,２,LONGRuiＧcai３,KANGJunＧmei２,ZHANGTieＧjun２,YANGQingＧchuan１,２∗,DONGKuanＧhu１
(１．ColegeofAnimalScienceandTechnology,ShanxiAgricultureUniversity,Taigu,ShanxiProvince０３０８０１,China;２．Institute
ofAnimalScience,CAAS,Beijing１００１９３,China;３．SchoolofLifeScience,ChongqingUniversity,Chongqing４０００４４,China)
Abstract:BasedonanESTintheSSHlibraryofMedicagosativaL．,afullengthof１６７８bpcDNAwas
isolatedbyRACE．ThecDNAsequencewaspredictedtocontaina１２８１bpORFandcodeaproteinof４２６
aminoacids,whichishomologytoArabidopsisthaliana DEADＧboxATPＧdependentRNAhelicase５６
(RH５６)andRH１５．ThegenewaspredictedtobeaDExD/HboxRNAhelicasegeneandnamedasMsRH
(GenBankaccessionNo．JX５０８６４８)．TransientexpressionofMsRHＧGFPfusioninonionepidermiscelinＧ
dicatedthattheMsRHlocalizedinnucleus．ToinvestigatethefunctionofMsRH,theplantoverＧexpresＧ
sionvectorpBIＧMsRH wasconstructedandtransferredintotobaccobyAgrobacteriumLBA４４０４．After
PCRandRTＧPCRanalysisoffivekanamycinresistantplants,３５S::MsRHwasconfirmedtoinsertintotoＧ
baccogenomeandtranscribemRNAsuccessfuly．Aftertreatedwith２５０mM NaClforsevendays,the
prolinecontentsoftransgenicplantswerelowerthanthoseofcontrolplants(WT),andthemalondialdeＧ
hydecontentsandrelativeelectricconductivitywerehigherthanthoseofcontroltobacco(WT)．TakentogethＧ
er,theseresultsdemonstratedthatMsRHincreasedthesaltsensitivityoftobaccoplantsundersaltstress．
Keywords:MedicagosativaL．;RNAhelicase;Subcelularlocalization;Tobaccotransformation
　　解旋酶是一种驱动蛋白,广泛存在于生物体中,
在DNA 或RNA 复制过程中起到催化双链DNA
或RNA解旋的作用.依据不同的生物学功能,解
旋酶可以分为 DNA解旋酶和 RNA解旋酶２类.
RNA解旋酶参与RNA的结构调控并影响RNA的
合成、翻译起始、RNA剪接、rRNA加工、核糖体组
收稿日期:２０１２Ｇ１１Ｇ２３;修回日期:２０１３Ｇ０１Ｇ１２
基金项目:“十二五”国家科技支撑计划项目(２０１１BAD１７B０１Ｇ０１Ｇ３);国家牧草产业体系岗位科学家资助
作者简介:高燕丽(１９８７Ｇ),女,山西忻州人,硕士研究生,研究方向为牧草种质资源与育种,EＧmail:gaoyanli．０２５＠１６３．com;∗通信作者
Authorforcorrespondence,EＧmail:qchyang６６＠yahoo．com．cn
草　地　学　报 第２１卷
装、核mRNA输出及mRNA稳定化与降解,它几乎
参与RNA生化过程的每一步[１Ｇ２].解旋酶在序列
水平上含有７到９个保守基序(Ⅰ,Ⅰa,Ⅰb,Ⅱ,Ⅲ,
１V,V,Ⅵ和Q)[３],根据保守基序的顺序以及特点可
将其分为５个家族:SF１~SF５,其中SF３,SF４和
SF５为细菌和病毒所特有,在结构上与前两者存在
较大差异[４].SF１和SF２包含了解旋酶有活性的
单体或者二聚体,是最大的２个家族.在SF１与
SF２中,基序Ⅰ是高度保守的ATP酶的特征序列,
也称 WalkerA 序列.DNA 解旋酶含有经典的
WalkerA(GＧXＧXＧXＧXＧGＧKＧT),属于SF１;RNA解
旋酶含有变异 WalkerA 基序(AＧXＧXＧXＧXＧGＧKＧ
T),属于SF２[５].
RNA解旋酶属于SF２,根据保守基序Ⅱ的氨基
酸序列特征,又可将其分为 DEADＧbox 家 族,
DEAHＧbox家族和 DEXD/H 家族[１,６].目前研究
最多的是DEADＧbox蛋白,其核心区域高度保守基
序约有２００~７００个氨基酸,并且存在已知基序Q,
该基序上的谷氨酸盐残基高度保守,而DEAHＧbox
和DExD/Hbox解旋酶蛋白并没有Q基序[４,７].
在胁迫应答途径中,DEADＧbox解旋酶位于逆
境应答途径的上游,在转录、转录后或翻译水平上调
控下游功能基因的表达.RNA解旋酶充当 RNA
伴侣角色,能够利用ATP水解能量有效阻止RNA
错误折叠,保证其正确转录[８].因此,在逆境胁迫条
件下,解旋酶通过调节相应机制,在植物生长发育中
可能发挥重要作用.
２００１年,通过cDNA微阵列技术分析发现拟南
芥(Arabidopsisthaliana)中DEADＧbox解旋酶基
因受冷害胁迫诱导,表明解旋酶在胁迫应答中发挥
一定作用[９],后有研究表明AtRH９和AtRH２５,在
低温胁迫中表达量显著上调,而盐胁迫和干旱胁迫
中表达量下调[１０].在拟南芥中研究比较透彻的
LOS４蛋白在低温胁迫中的作用可能与CBF等转
录因子的 mRNA出核运输有关.在大豆(Glycine
max)中分离DEADＧboxRNA解旋酶基因GmRH
能够响应低温和高盐胁迫[１１].在水稻(OryzasatiＧ
va)中,DEADＧboxRNA解旋酶基因OsBIRH１能
被稻瘟病所诱导,并且在水稻与稻瘟病菌的非亲和
互作反应中表现出明显的表达差异,SA,JA,ACC
等抗病信号分子都能诱导该基因的表达,可能参与
水稻抗病反应的调控[１２].这些研究表明RNA解旋
酶基因在植物非生物和生物胁迫中都具有重要作
用.２００８年在紫花苜蓿(Medicagosativa)中首次
克隆解旋酶 DEADＧbox解旋酶家族基因 MH１
(GenBankaccessionnumber:EF０１１０２２),该基因与
起始因子elF４III亲缘关系比较近,在植物受非生物
胁迫应答中起到重要作用[１３],而迄今为止,未见有
关紫花苜蓿DExD/Hbox解旋酶相关基因及其功
能研究报道.
紫花苜蓿分布面积广,产量高,品质好,是世界
范围内重要的饲料作物.RNA解旋酶存在于不同
的生物体中以及不同的器官中,而且起着十分重要
的作用,近年来已成为研究热点.本研究在紫花苜
蓿中成功分离出MsRH 基因,构建超表达载体,转
化烟草(Nicotianatobacum)获得阳性植株,并进行
生理指标等方面的测定,为进一步研究此基因功能
及作用机理提供了试验依据,以期为培育苜蓿抗逆
新品种奠定理论和试验基础.
１　材料与方法
１．１　试验材料
紫花苜蓿中苜１号、野生型烟草品种 Nc８９种
子、根癌农杆菌LBA４４０４和植物表达载体PBI１２１
均为由中国农业科学院北京畜牧兽医研究所提供材
料.大肠杆菌 DH５α 感受态细胞和克隆载体
pEASYＧT１购自北京全式金生物技术有限公司.
质粒提取试剂盒,RNA提取试剂盒和PCR产物纯
化试剂盒购自北京博迈德生物技术公司.SMART
RACEKit购自美国Clonetech公司;MLV反转录
酶,限制性内切酶(XhoⅠ,SpeⅠ,XbaⅠ,BamHⅠ)
购自TAKARA公司.其他所需试剂均为国产分析
纯.
表１　引物序列
Table１　Sequencesofprimersusedintheexperiment
引物名称
Nameofprimer
引物序列５′Ｇ３′
Sequenceofprimer５′Ｇ３′
P１ TGTTGACGACGAAGCGAAATTGACCCTT
P２ CGCTTCAACCTTTCTTCCTGGGACATTC
P３ TACTCGAGATGGGTGAAACAAAGGA
P４ CGACTAGTTGATGGCATGTAGGTAG
P５ GCTCTAGAATGGGTGAAACAAAGGAAG
P６ ATGGATCCTGATGGCATGTAGGTAGAT
P７ CGACACACTTGTCTACTCCAAAAAT
１．２　总RNA提取
将中苜１号种子置于培养皿中发芽,等２片子
叶完全展开后,置于 Hoagland水培液中生长,３~５
d换一次营养液,光照(３０００lx)１６h,黑暗８h,相对
２８５
第３期 高燕丽等:紫花苜蓿DExD/HboxRNA解旋酶基因的克隆与分析
湿度７５％,２５°C培养.取生长２周的幼苗,用RNA
试剂盒提取总RNA,通过１．５％变性琼脂糖胶和紫
外分 光 光 度 计 检 测 RNA 质 量 和 浓 度.参 照
SMARTRACEKit说明进行反转录及目的基因两
端序列的克隆.
１．３　获得目的基因全长
根据已知的EST序列应用Primer５．０设计３′Ｇ
RACE引物P１和５′ＧRACE引物P２(表１),扩增目
的基因的３′和５′端序列.取５μL总 RNA 加入
DnaseI３７℃处理３０min,然后加入３′ＧRACEoligo
dT/５′ＧRACEoligodT接头在 MＧMLV反转录酶作
用下合成cDNA.以此cDNA为模板,使用基因特
异性引物P１/P２和接头引物UPM 扩增３′/５′末端
序列.PCR程序为:９５℃预变性３min;９５℃变性３０
s,６８℃退火３０s,７２℃延伸２min,３０个循环;７２℃
延伸１０min.通过１％琼脂糖胶中电泳检测PCR
产物,使用 Takara切胶回收试剂盒回收特异性条
带,把回收产物连接到pEASYＧT１载体上并转化
DH５α感受态大肠杆菌,用氨苄青霉素挑阳性单菌
落,３７℃,２３０r􀅰min－１,５h摇菌,菌落PCR检测.
将含有目的条带的阳性克隆送到北京博迈德生物技
术有限公司测序.
１．４　目的基因编码蛋白的生物信息学分析
用DNAMAN软件将测序得到的目的基因３′
和５′端序列拼接,利用NCBI中的BLAST和OFR
finder软件将序列进行比对分析和查找开放阅读
框.在瑞士生物信息学研究所网站上(http://us．
expasy．org/)运用ComputePi/Mw软件对目的基
因编码蛋白等电点和分子量进行预测,并运用
Protscale和ScanProsite软件对编码蛋白疏水性和
作用位点进行预测分析.采用PBILLYONＧGERＧ
LAND信息库对蛋白序列进行二级结构预测.采
用SMART软件对编码蛋白结构域进行预测.在
GenBank中查找到１１个其他物种的解旋酶氨基端
序列,应用进化树构建软件 MEGA５．０,采用邻接
法构建进化树.
１．５　亚细胞定位
以获得第１条cDNA为模板,引物P３和P４扩
增完整开放阅读框.回收产物连接到克隆载体
pEASYＧT１上,转化大肠杆菌.测序后将正确插入
目的基因的重组质粒命名为pEASYＧMsRH．用限
制性内切酶 Xho Ⅰ和Spe Ⅰ同时酶切pEASYＧ
MsRH 和Pa７ＧGFP,琼脂糖凝胶检测后回收各自目
的片段.用T４连接酶将目的片段在１６℃连接５h.
连接产物转化大肠杆菌感受态DH５α中,挑取阳性
单克隆菌落,菌液PCR检测并且测序.将正确插入
目的基因的重组子命名为Pa７ＧGFPＧMsRH.撕取
新鲜洋葱(Alliumcepa)表皮,平铺于培养皿中 MS
培养基上,使用基因枪(Biorad公司)轰击转化洋葱
表皮细胞.２５℃黑暗培养１６~２４h后,将洋葱表皮
取出并在激光共聚焦显微镜下观测绿色荧光信号并
拍照.
１．６　超表达载体构建及烟草转化
根据已经获得的MsRH 基因序列,以cDNA为
模版,P５和P６为引物扩增 MsRH 基因全长,PCR
产物胶回收后连接到克隆载体pEASYＧT１上,转化
大肠杆菌感受态DH５α,阳性克隆鉴定,测序.选择
测序结果提取没有发生碱基突变的菌液,提取质粒,
该质粒命名为pEASYＧMsRH.用限制性内切酶
XbaⅠ和BamH Ⅰ同时酶切克隆载体和空载体
pBI１２１,琼脂糖凝胶检测后回收各自目的片段.用
T４DNA连接酶将目的片段在１６℃连接５h.连接
产物成功转化大肠杆菌后,进行菌体PCR检测并且
酶切鉴定,提取质粒,该质粒命名为pBIＧMsRH.
采用CaCl２ 冻融法将构建好的超表达载体转入
农杆菌LBA４４０４中,采用叶盘法[１４]转化烟草.选
取培养基中生长良好的无菌烟草叶片,打孔器打成
直径７mm的圆片,在OD６００为０．５的农杆菌转化菌
液中浸泡１０min,取出后滤纸吸干水分,然后摆放
培养基中,２８℃黑暗共培养４８h.然后转入卡那霉
素筛选培养基中,２５℃培养直至叶盘周围分化愈伤
组织,并长出抗性芽.待芽长至１~３cm时,将芽切
下,转入生根培养基中继续培养,至长成完整的烟草
苗后移栽到营养土中在温室继续培养.
１．７　转基因烟草检测与生理指标测定
经过抗生素的筛选,获得５株抗性苗.对其进
行目的基因PCR和RTＧPCR检测.提取抗性苗的
基因组DNA为模板,质粒PBIＧMsRH 为阳性对照
模板、未转基因烟草基因组DNA为阴性对照模板,
以P５和P６为引物,进行PCR扩增.提取抗性苗
的总RNA反转录成cDNA,以cDNA为模板,阳性
对照模板、阴性对照模板同上,以P６和P７为引物
PCR扩增.扩增产物在１％琼脂糖凝胶上电泳分析.
３８５
草　地　学　报 第２１卷
用２５０mMNaCl处理转基因烟草和未转基因
烟草,７d后测定电导率和脯氨酸含量.每个样品
都做３次重复,测定结果用SAS９．０数据分析软件
在０．０５水平进行统计分析.
２　结果与分析
２．１　目的基因全长序列的获得与生物信息学分析
经３′ＧRACE引物P１和５′ＧRACE后分别获得
的特异性条带(图１),经回收纯化,克隆,测序,分别
得到８７１bp和１０６４bp的序列.用DNAMAN软
件将２条序列和已知 EST 序列进行拼接,得到
１６７８bp的全长序列.使用NCBI中的OFRfinder
找到最大开放阅读框长度为１２８１bp,编码蛋白含
４２６氨基酸(图２),将此基因命名为 MsRH.该基
因预测等电点pI为５．４７,分子量为４８．２６kD;其编
码蛋白的疏水性结果表明,其大部分区域为疏水区,
二级结构预测表明含有大量的螺旋结构.MsRH
基因编码蛋白结构预测发现,功能结构区域有２部
分,分别是DEXDc结构域和 HELICc结构域,氨基
酸位置分别是６５到２６６,３０２到３８３.(图３)通过序
列比对MsRH 与拟南芥RH１５和RH５６具有９０％
以上的相似度,与玉米(Zeamays)剪接体RNA解
旋酶BAT１相似性为９０％.将MsRH 编码氨基酸
序列与其他１１个物种的解旋酶氨基酸序列构建进
化树(图４),比较分析表明,MsRH 编码蛋白属于
DECD解旋酶,与其他物种相比较,MsRH 编码蛋
白与豆科植物亲缘关系比较近.
图１　MsRH基因３′ＧRACE和５′ＧRACE产物电泳结果
Fig．１　Electrophoresisresultofthe３′and５′ＧRACEfragments
注:M:DL２０００plus;３′:３′ＧRACE产物;５′:５′ＧRACE产物
Note:M:DL２０００plus;３′:３′ＧRACEfragment;
５′:５′ＧRACEfragment
２．２　亚细胞定位
将正确插入目的基因的重组子命名为 Pa７Ｇ
GFPＧMsRH,使用基因枪(Biorad公司)轰击转化洋
葱表皮细胞.２５℃黑暗培养１６~２４h后,将洋葱表
皮取出并在激光共聚焦显微镜下观测绿色荧光信号
并拍照.在激光共聚焦显微镜下观察发现,转化了
Pa７ＧGFPＧMsRH 的洋葱细胞,在细胞核中的荧光信
号很强,转化了Pa７ＧGFP的洋葱细胞,在整个细胞
中都有荧光信号.因此证明了目的基因蛋白定位于
细胞核.
２．３　超表达载体构建
用XbaⅠ和BamH Ⅰ双酶切质粒PBIＧMsRH,
１％琼脂糖凝胶电泳得到约１３００bp的条带(图６),
与目标大小相符.测序发现目的片段无碱基突变,
表明植物超表达载体构建成功.
２．４　烟草转化
经过农杆菌转化的烟草叶盘,在５０mg􀅰mL－１
卡那霉素筛选培养基上生长２周后在叶盘周围可见
到抗性芽,待抗性芽长到１cm 左右时,将其切下转
入生根培养基中,再生植株根长１０cm左右时,即可
转入营养土中,在温室中继续培养(图７).
２．５　转基因烟草检测
经过卡那抗生素的筛选,获得５株抗性苗,对其
在DNA 和 RNA 水平上进行检测.PCR产物在
１％琼脂糖凝胶电泳上分析,均得到１３００bp左右的
条带(图８),与目标大小一致;同时对这５株抗性苗
进行RTＧPCR检测,结果表明得到１７００bp左右的
条带(图９),其中包括目的基因和３５S启动子片段,
与目的大小一致.以上结果均证明转基因烟草转化
成功.
２．６　转基因烟草生理指标测定
以未转基因的烟草做对照,采用高盐胁迫
(２５０mMNaCl)７d后同时测定对照和转基因烟草
苗的丙二醛、脯氨酸和电导率.结果显示,在高盐
处理后,脯氨酸含量均增加,转基因烟草低于对
照;丙二醛含量在胁迫后均显著升高(P＜０．０５),
转基因烟草丙二醛含量显著高于对照,电导率均
显著增加(P＜０．０５),转基因烟草电导率要高于对
照.经过试验初步表明MsRH 基因在转基因烟草
中增强对高盐的敏感性.
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第３期 高燕丽等:紫花苜蓿DExD/HboxRNA解旋酶基因的克隆与分析
图２　MsRH基因全长核算序列及推测的氨基酸序列
Fig．２　NucleotideandpredictedaminoacidsequenceofMsRH
注:划线氨基酸序列分别是解旋酶超家族典型的DEXDc结构域和 HELICc结构域;
７９８号与１２２４号碱基之间序列为已知的EST序列;７６号与１３５７号碱基之间序列为编码区
Note:TheunderlinedaminoacidsareDEXDcandHELICcdomains,whicharethecharacteristicsofDEADＧboxRNAhelicasesandconservedmotifs．
Thenucleotidesequencebetween７９８and１２２４isESTsequence;Thenucleotidesequencebetween７６and１３５７isacodingregion
图３　MsRH基因编码蛋白结构预测
Fig．３　PredictedproteinstructureoftheMsRHencode
３　讨论与结论
DEADbox解旋酶作为 RNA分子伴侣,参与
RNA二级结构稳定,mRNA的剪切、修饰及运输以
及核糖体发生等过程,对植物的生长发育、抗逆胁迫
等方面具有重要作用.
本试验在紫花苜蓿中克隆一个 DExD/Hbox
RNA解旋酶基因 MsRH,该基因所对应的氨基酸
序列与拟南芥 DEADＧboxRNA 解旋酶 RH１５,
RH５６具有９２％的相似度,与玉米剪接体RNA解
旋酶BAT１相似度为９０％,在基序Ⅱ中经典的DＧEＧ
AＧD模块中变为DＧEＧCＧD,是一个新类群.研究发
现拟南芥 DEADＧboxRNA 解旋酶 RH５６与人类
UAP５６,酵母SUB２以及水稻BAT１是相似蛋白[１５].
５８５
草　地　学　报 第２１卷
图４　MsRH蛋白与其他植物的解旋酶蛋白的进化树分析
Fig．４　PhylogenetictreeanalysisofMsRHandotherRNAhelicases
注(Note):Medicagosativa紫花苜蓿;Medicagotruncatula 截型苜蓿;Glycinemax 大豆;Populustrichocarpa 毛果杨;Vitisvinifera 葡萄;
Jatrophacurcas麻疯树;Brachypodiumdistachyon二穗短柄草;Arabidopsisthaliana 拟南芥;Ricinuscommunis蓖麻;
OryzasativaJaponicaGroup粳稻;Selaginellamoellendorffii江南卷柏;Zeamays玉米
图５　pA７ＧGFPＧMsRH转化洋葱表皮细胞的亚细胞定位情况
Fig．５　SubcelularlocalizationofpA７ＧGFPＧMsRHfusioninonionepidermalcels
注:A,B,C:空载体瞬时表达;D,E,F:pA７ＧGFPＧMsRH 瞬时表达;A,D为荧光检测;B,E为明场图像;C,F为暗场图像
Note:A,B,C:Transientexpressionoftheemptyvector;D,E,F:pA７ＧGFPＧMsRHtransientexpression;
Thephotographsweretakeninthesuperpositionofbrightanddarkvision(A,D),brightlightvision(B,E),darkfieldvision(C,F)
DECDＧboxRNA解旋酶Sub２p或者 UAP５６直接
参与剪接体组装过程[１６].mUAP５６蛋白石是从酵
母到人类广泛存在的DExD/HboxRNA解旋酶成
员之一,是重要的剪接因子,在剪接前体组装和剪接
体组装中都具有重要作用[１７Ｇ２０].RNA前体剪接是
从信使RNA前体中去除内含子,成为成熟RNA的
过程.这一成熟过程是由剪接体完成的,而剪接体
除了含有５个核小RNA分子和７０多种蛋白外,还
包括８种 RNA 解旋酶(DEADＧbox蛋白).虽然
RNA解旋酶在剪接反应中的确切功能仍不清楚,但
６８５
第３期 高燕丽等:紫花苜蓿DExD/HboxRNA解旋酶基因的克隆与分析
图６　超表达载体酶切鉴定
Fig．６　IdentificationofoverＧexpressedvectors
注:A:PBI质粒;B:双酶切后的质粒PBIＧMsRH;M:Marker
Note:A:PBIplasmid;B:plasmiddigestedbyXbaⅠandBamHⅠ
是有证据说明DEADＧbox蛋白家族的剪接因Sub２
和Prp２８蛋白可能参与了 RNAＧ蛋白联合体的解
离[２,２１].成熟 RNA 需要从细胞核转运到细胞质
中,因此剪接过程和转运RNA过程也是有联系的,
在酿酒酵母中也发现Sub２p参与 mRNA 转运过
程[２２].因此MsRH蛋白也可能是紫花苜蓿中的剪
接因子并且具有转运功能.结构上看 MsRH 蛋白
含有DEADＧboxRNA解旋酶家族所含有的８个高
度保守的基序.目前研究DEADＧboxRNA解旋酶
较多,已经在水稻、玉米、拟南芥、菠菜(SpinaciaolＧ
eracea)等作物上被广泛研究,而作为一种新类群
DECDＧboxRNA解旋酶在苜蓿中还没有被研究.
　　RNA解旋酶的主要功能是利用水解 ATP产
生的能量修饰RNA的结构,有效阻止RNA的错误
折叠,调控并且影响着细胞生长和分化等生命活动.
DEADＧboxRNA解旋酶在植物非生物胁迫应答中
发挥着重要的作用.近年来成为许多科学家们研究
的热点.研究发现在低温胁迫、盐胁迫、渗透胁迫,
氧化胁迫以及抵抗热胁迫中,DEADＧboxRNA解旋
酶均发挥一定的调节功能.
　　很多研究表明,DEADＧbox解旋酶在低温下被
上调 表 达,它 们 有 AtRH９,AtRH２５[１０],AtＧ
RH１４[９],AvDH１[２３]和CbDRH[２４],其中CbDRH
是根据蛋白组学研究结果,从高山离子芥(ChorisＧ
porabengeana)中克隆到一个冷响应RNA解旋酶
基因,首次报道了该家族蛋白在零度低温下的表达
图７　烟草抗性芽的筛选及再生植株的获得
Fig．７　Tobaccoregeneratedshootsandtransplantedplantlets
注:A:共培养叶盘;B:再生芽;C:再生植株;D:移栽苗
Note:A:cocultivationleafＧdisk;B:regeneratedshoots;C:regeneratedplantlets;D:transplantedplantlets
图８　转基因再生烟草PCR检测
Fig．８　Screeningoftransgenictobaccoseedling
注:CK－:阴性对照;CK＋;阳性对照;M:Marker;１~５:再生植株
Note:CK－:negativecontrol;CK＋;positivecontrol;M:DNAMarker;１~５:transgenictobaccoseedling
７８５
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图９　再生烟草RTＧPCR检测
Fig．９　RTＧPCRdetectionoftransgentictobaccoseedling
注:CK－:阴性对照;CK＋:阳性对照;M:Marker;
１~５:再生植株RTＧPCR鉴定
Note:CK－:negativecontrol;CK＋:positivecontrol;M:DNAMarker;
１~５:RTＧPCRdetectionoftransgentictobaccoseedling
情况.盐胁迫应答方面,DEADＧboxRNA解旋酶也
积极响应,在大麦(Hordeumvulgare)中,一种
ATP依赖型的DEADＧboxRNA解旋酶 HVD１应
答盐胁迫和脱落酸,在这２种处理诱导下,HVD１
转录 物 积 累[２５].罗 布 麻 (Apocynumvenetum)
AvDH１基因为盐诱导特异表达基因,在渗透胁迫
下基因不表达,在盐胁迫下该基因在罗布麻的根、茎
及叶片组织中成型表达,在维持细胞基本功能方面
可能具有重要作用.在４℃低温处理后,其表达量
开始上升然后随着时间推移而降低.外施ABA处
理下不表达,说明受到不依赖 ABA的盐胁迫信号
转导途径调节[２３].
　　减法杂交和差异显示表明,DEADＧbox解旋酶
基因是受盐胁迫诱导表达的基因,表明解旋酶在植
图１０　再生植株逆境胁迫下生理指标的测定
Fig．１０　Physiologicalparametersofregenerationplants
注:WT:未转基因烟草苗;RH１~RH５:５株转基因烟草苗
Note:WT:wildtobacco;RH１~RH５:fivetransgenictobaccoplants
物受到非生物胁迫过程中发挥重要作用[２６].拟南芥
AtHELPS作为典型的拟南芥DEVHＧboxRNA解旋
酶,能够响应盐胁迫和低钾胁迫,参与盐胁迫响应过
程和钾离子吸收和运输途径[２７].DEVDＧboxRNA解
旋酶AtRDEM 基因能够控制拟南芥幼苗和成熟期的
生长发育[２８].拟南芥STRS１和STRS２突变体能够
增强多种胁迫耐受力,包括盐胁迫、氧化胁迫和高温
胁迫,揭示了STRS１和STRS２在响应非生物胁迫中
起到负调控作用[２９].经过初步的生理指标检测,发
现MsRH 基因超表达烟草植株增强了对盐胁迫的敏
感性.因此明确DExD/HＧboxRNA解旋酶在响应逆
境胁迫方面的作用具有重要意义.
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第３期 高燕丽等:紫花苜蓿DExD/HboxRNA解旋酶基因的克隆与分析
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(责任编辑　刘云霞)
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