全 文 ：文章编号: 1007-0435( 2004) 04-0276-05
紫花苜蓿品种根瘤菌表型多样性研究
万晓红1 ,韦革宏1, 2* ,杨亚珍1,朱毓华1
( 1.西北农林科技大学资源环境学院, 陕西杨凌 712100; 2.黄土高原土壤侵蚀与旱作农业国家重点实验室,陕西杨凌 712100)
摘 要: 选用 52 株分离自 22 个紫花苜蓿品种的根瘤菌和 34 株已知参比菌株, 进行生长温度、营养利用、抗生素抗性和
耐逆性等 113 个表型性状研究, 结果表明: NWMSH022、NWMSH023 和 NWMSH028 这 3 株菌抗逆性较强; 通过
MINT S 软件分析,得到数值分类树状图; 在 89%的相似水平上, 除 NWMSH009 和 NWM SH023, 供试未知菌株聚为不
含已知参比菌株的新表观群, 该表观群是否为新属种有待进行基因研究。
关键词: 草原学;紫花苜蓿; 根瘤菌;表型多样性
中图分类号: S 182; S154. 381 文献标识码: A
Phenotype Diversities of Rhizobia Isolated from
Different starins of Medicago sativa
WAN Xiao-hong 1, WEI Ge-hong1, 2* , YANG Ya-zhen1, ZHU Yu-hua1
( 1. Co llege o f Resour ces and Env ir onment, No rthw est Agr icult ur e and Forestry
Sci-Tech Univer sity , Yangling , Shanxi Pr ov ince 712100, China
2. Key Stat e Labo rat or y o f Soil Er osion and Dryland Farming on the Loess Plateau, Yang ling , Shanx i P ro vince 712100, China)
Abstract: A study o f 113 pheno type features, including plant-g row ing temperatur e, nutr it ion utilizat ion,
ant ibio tic resistance, and NaCl and alkali tolerance, of 52 str ains o f M edicago sat iva, isolated fr om the r hizobia
of 22 M . sat iva st rains and 34 representat iv e st rains, w as conducted. The result show s that the thr ee st rains:
NWMSH022, NWMSH023, and NWMSH028 boast st ronger NaCl and alkali tolerance than the others. By the
analy sis o f M INTS sof tw are, a dendrogr am of numerical tax onomy show s that , ex cept NWMSH009, and
NWMSH023, al l the examined st rains cluster into one phenotype at a sim ilar ity level of 89%. It takes a fur ther
genet ic study to determ ine w hether this new phenotype dif fers f rom the known rhizobial species.
Key words : Grassland science; Medicago sat iva; Rhizobium; Phenotype div ersity
我国西北地区干旱少雨,气候干燥,虽然有很多天
然草原,但因雨量不足, 加上乱垦滥挖, 沙化现象十分
严重。而不少牧草耐干旱, 即使年降雨量为 200～300
mm ,也能生长 [ 1]。牧草还可培肥地力,尤其豆科牧草与
根瘤菌共生体系可以固定空气中游离态氮,增加土壤
含氮量。被誉为“牧草之王”的苜蓿,根系发达,产量高,
营养丰富,适应性强,在我国已有 2000多年的栽培史,
种植苜蓿既可为家畜提供优质的绿色蛋白质饲料, 又
可利用根瘤菌固氮改良土壤,培肥地力 [ 2]。近年来, 苜
蓿在人类健康食品、土壤生物改良剂等方面又拥有了
新的应用前景。本试验选取陕西杨凌某试验田的 22个
品种的紫花苜蓿根瘤菌为研究对象, 进行生理生化表
型性状的测定和多样分析, 并选育优良菌株,为进一步
研究其与不同品种苜蓿的最佳匹配提供科学依据, 为
西北干旱半干旱区高效抗逆高产紫花苜蓿的筛选及其
基地建设服务。
收稿日期: 2003-07-03;修回日期: 2004-03-03
基金项目:陕西省农业攻关项目( 2003K02-G16) ,教育部全国优秀博士学位论文专项基金( 200254)和高等学校优秀青年教师教学科研奖励计划
作者简介:万晓红( 1978-) ,女,硕士研究生,主要从事根瘤菌资源多样性研究, w anx iaohonggg @ 163. net ; * 通讯作者Au th or for correspondence
weigehong@ yah oo. com. cn
致谢:本试验选用的参比菌株由中国农业大学陈文新院士提供,特此致谢
第 12卷 第 4期
Vo l. 12 No. 4
草 地 学 报
ACT A AGRESTIA SIN ICA
2004 年 12 月
Dec. 2004
1 材料与方法
1. 1 菌株
选用从陕西杨凌某试验田的 22个紫花苜蓿品种
的新鲜根瘤分离纯化后得到 52株快生型根瘤菌和 34
株快生型已知参比菌株,其中未知菌株编号、寄主品种
名称及来源见表 1。根瘤采集以 S型布点进行。
表 1 供试菌株
Table 1 L ist o f the refer ence str ains
菌株
S trains
寄主品种名称
N ame of hosts
寄主来源
Origin of hosts
NWMSH001、NWMSH002、NWM SH003 维多利亚( V ictor ia) 美国 U . S. A
NWMSH004、NWMSH005、NWM SH006 全能( Total) 美国 U . S. A
NWMSH007 皇后( Empress) 美国 U . S. A
NWMSH008、NWMSH009、NWM SH010 牧歌( AmeriGraze) 美国 U . S. A
NWMSH012、NWMSH013 阿尔冈金( A lgonquin) 荷兰N etherlands
NWMSH015、NWMSH016 三得力( Sanditi) 中国 Chin a
NWMSH017、NWMSH018、NWM SH019 中苜一号( Zhongmu No. 1) 荷兰N etherlands
NWMSH020、NWMSH021、NWM SH022 塞特( Sitel) 美国 U . S. A
NWMSH023、NWMSH024、NWM SH025 苜蓿王( Emperor ) 中国 Chin a
NWMSH026、NWMSH027、NWM SH028 关中( Gu anzhong) 美国 U . S. A
NWMSH029、NWMSH030、NWM SH031 WL252HQ 美国 U . S. A
NWMSH032 WL324 美国 U . S. A
NWMSH033 WL323M L 美国 U . S. A
NWMSH034 WL323HQ 美国 U . S. A
NWMSH035、NWMSH036、NWM SH037 WL232HQ 美国 U . S. A
NWMSH038、NWMSH039、NWM SH040 金皇后( Golden Empress ) 美国 U . S. A
NWMSH041、NWMSH042、NWM SH043 爱菲尼特( A ffinity) 美国 U . S. A
NWMSH044、NWMSH045、NWM SH046 德福( Deft) 荷兰N etherlands
NWMSH047 德宝( Derby) 荷兰N etherlands
NWMSH048、NWMSH049、NWM SH050 宁夏( N ingxia) 中国 Chin a
NWMSH051、NWMSH052、NWM SH053 苜蓿 54( Alfalfa N o. 54) 荷兰N etherlands
NWMSH054 放牧者( Haygrazer) 加拿大Canada
1. 2 性状测定
1. 2. 1 测定方法按文献[ 3]进行, 86株菌测定了 113
项生理生化表型性状, 其中唯一碳源利用包括蔗糖、马
尿酸钠、肌醇、赤丝草醇、山梨醇、密三糖、密二糖、树胶
醛糖、山梨糖、鼠李糖、糖原、半乳糖、D-木糖、D-核糖、
二硫苏糖醇、盐酸氨基葡萄糖、阿冬糖醇、麦芽糖、乳
糖、D-果糖 20 项; 唯一氮源利用包括天冬氨酸、L-正
白氨酸、A-鸟氨酸、丙氨酸、L-白氨酸、L-酪氨酸、3, 5-
溴洛氨酸、L-半胱氨酸、甘氨酸、L-谷氨酸、L-赖氨酸、
L-精氨酸 12项,且碳氮源的终浓度均为 0. 1%。
1. 2. 2 抗生素测定 32项, 8种抗生素分别是红霉素、
白霉素、青霉素、链霉素、磷雷素钠、洁霉素、卡那霉素、
庆大霉素,每种抗生素 4个浓度为 5 Lg / ml、50 Lg/ m l、
100 Lg/ m l、300 Lg / ml。
1. 2. 3 染料抗性测定 20项, 去氧胆酸钠、中性红、亚
甲基蓝、刚果红、孟加拉红、孔雀石绿、甲基绿、甲基红、
甲基橙、百里香酚兰,浓度为 0. 1%和 0. 2%。
1. 2. 4 耐盐性测定浓度为 1%、2%、3%、4%、5%和
6% ;初始pH 为 4、5、9、10、11、12。
1. 2. 5 其他测定项目还包括温度生长范围、石蕊牛奶
试验、硝酸盐还原、耐尔兰还原、BT B 酸碱反应、过氧
化氢酶、尿酶、肉汤生长等。
1. 3 聚类方法
采用平均连锁法( UPGMA) ,用中国科学院微生
物所的 M INTS 软件包在电脑上完成,聚类结果以树
状图谱的方式表示 [ 4]。
2 结果与分析
2. 1 生理生化测定结果及分析
2. 1. 1 未知菌株生理生化性状测定结果表明: 52 株
菌均能利用肌醇、密三糖、半乳糖、D-木糖、D-核糖、麦
芽糖、L-白氨酸和 A-鸟氨酸; 对二硫苏糖醇只有
NWMSH016可以利用,而 L-酪氨酸都不能利用;其它
碳源和氮源不同菌株的利用程度不同, 说明不同菌株
产生的酶有所差异。
2. 1. 2 在抗生素敏感试验中, 52 株未知菌株在低浓
度下绝大部分能够正常生长,但随着浓度的升高,能够
生长的菌株呈递减趋势。其中红霉素、链霉素、卡那霉
素和庆大霉素对供试菌株的抑制能力较强,所有菌株
在浓度为 50 Lg / ml 时均停止生长; 在浓度为 100～
300 Lg / ml的白霉素、青霉素和洁霉素下仍有菌株生
长,它们是 NWMSH003、NWMSH010、NWMSH012、
NWMSH016、NWMSH017、NWMSH022、NWMS-
H023、NWMSH028、NWMSH032、NWMSH035 和
NWMSH047,说明这 11株菌对白霉素、青霉素和洁霉
素有较强的耐受性; 所有未知菌和已知参比菌株在磷
雷素钠浓度为 0～300 Lg / ml时均能生长。
2. 1. 3 未知菌株对去氧胆酸钠、刚果红、孟加拉红、甲
基橙和百里香酚兰的耐受性较强,在 0. 2%的浓度下
所有菌株能正常生长;在中性红 0. 1%浓度下未知菌
株均能生长, 而在 0. 2%浓度下, 只有 NWMSH023、
NWMSH028、NWMSH029、NWMSH033、NWMS-
H047能够正常生长;在甲基红 0. 1%浓度下有 10 株
菌生长, 而在 0. 2%浓度下生长的只有 NWMSH023;
在甲基绿 0. 1%浓度下只有 NWMSH023 一株菌生
长;所有菌株都不能在亚甲基蓝和孔雀石绿上生长。
2. 1. 4 未知菌株的耐碱性较强,耐酸性较弱。在初始pH4
时所有未知菌都能生长,但在初始pH11时所有未知菌株
277第 4期 万晓红等:紫花苜蓿品种根瘤菌表型多样性研究
能够生长。NWMSH023、NWMSH028、NWMSH032和
NWMSH035在初始pH12时仍能生长。
2. 1. 5 在 4℃条件下进行培养,所有的未知菌株和已
知参比菌株都停止生长, 说明它们不耐低温; 而在
40℃条件下培养时, 所有未知菌株都能生长但大部分
已知参比菌株则停止生长, 说明未知菌株能耐一定高
温;但在 50℃下所有菌株均停止生长;经 60℃处理 10
分钟后放于 28℃培养所有菌株正常生长,说明根瘤菌
能耐瞬间高温。
2. 1. 6 在 石 蕊 牛 奶 反 应 中, NWMSH001 和
NWMSH015 发生胨化, NWMSH 007 和 NWMSH
044发生还原, 其它均为酸凝, 而已知参比菌株 76%为
产 碱; 在 过 氧 化 氢 酶 测 定 中 除 NWMSH022、
NWMSH023、NWMSH039,均有气泡产生;在肉汤培
养基上 未知菌株均 能生长; 在亚甲 蓝反应 中
NWMSH005、NWMSH013、NWMSH020、NWMS-
H042和 NWMSH049表现为蓝色,其它未知菌还原为
白色; 在硝酸盐还原反应中除 NWMSH014均能使硝
酸 盐 还 原; 除 NWMSH017、NWMSH031 和
NWMSH039都能产生脲酶。
2. 2 数值分类结果及分析
对测定的 113项生理生化表型性状数据, 去除 35
项全同性状, 采用平均连锁法进行聚类分析,得到数值
分类树状图(图 1)。
2. 2. 1 从图 1可看出,全部未知菌株和已知参比菌株
在 68%的相似水平上聚在一起, 而已知参比菌株中
R. hainanense 种的两株菌在 98%的相似水平上聚在
一起, R . gall icum 种的两株菌在 95%的相似水平上聚
在一起, R . l eguminosar um 种的两株菌在 88%的相似
水平上聚在一起,M . t ianshanense种的两株菌在 93%
的相似水平上聚在一起, S. x inj iangense种的两株菌
在 89%的相似水平上聚在一起,说明试验结果是可信
的[ 5]。在 89%的相似水平 上, 除 NWMSH009 和
NWMSH023外所有的供试未知菌株单独聚在一个新
表观群内, 参照其他研究者对表观群确定时的菌株
数[ 6] , 可认为该表观群可能是不同于已知快生型根瘤
菌的新类群, 其分类地位的最终确定,尚需对其中心菌
株进行 16S rRNA 基因序列测定,根据结果分析它们
与已知菌株的亲缘关系,并进一步测定与已知属种的
DNA 同源性。
2. 2. 2 新表观群在 95%的相似水平上又分为 5个小
亚群。
2. 2. 2. 1 亚群Ⅰ由分离自维多利亚的 NWMSH001、
NWMSH002, 全能的 NWMSH004、NWMSH006, 赛
特的NWMSH020组成。
2. 2. 2. 2 亚 群 Ⅱ 由 分 离 自 WL252HQ 的
NWMSH030、NWMSH031, WL324 的 NWMSH032,
WL323HQ的 NWMSH034组成。
2. 2. 2. 3 亚群Ⅲ由分离自维多利亚的 NWMSH003,
全能的 NWMSH005, 牧歌的 NWMSH008,阿尔冈金
的 NWMSH013, 关中的 NWMSH026, WL232HQ 的
NWMSH035组成。
2. 2. 2. 4 亚群Ⅳ由分离自关中的 NWMSH027,
WL232HQ 的 NWMSH036、NWMSH037, 金皇后的
NWMSH038组成; 2. 2. 2. 5 亚群Ⅴ由分离自德福的
NWMSH045, 宁 夏 的 NWMSH048、NWMSH049、
NWMSH050,苜蓿 54的 NWMSH052、NWMSH053,
放牧者的NWMSH054组成。
从亚群分类情况可看出分别分离自宁夏、维多利
亚、全能、WL252HQ、WL323HQ 和苜蓿 54的三株菌
中至少有两株聚在一起,说明根瘤菌的聚类与寄主有
一定关系。但亚群Ⅲ中的 6株菌分别分离自 6个不同
的寄主,但这 6株菌的采样点较集中,处于同一个垄的
两侧,说明土壤环境对根瘤菌的聚类也有很大影响。
2. 3 鉴别特征分析
以新表观群菌株的生理生化性状出现频率 100%
的特征作为鉴别特征,即该群内的菌株 100%表现正
反应的记为“+ ”, 反之为“- ”,结果见表 2。
表 2 新表观群与 S. medica 和 S.meliloti的鉴别特征
Table 2 Dist inctiv e fea tures of t he new cluster ,
S. medica, a nd S. meliloti
鉴别特征
Distinct iv e fea tures
新表观群
New cluster
S.medica S.mel iloti
D-核糖( D-ribose) + + -
L-白氨酸( L -leucine) + + -
L-酪氨酸( L -ty rosine) + - -
A-鸟氨酸(A-ornithine) + + -
白霉素( albomycin) ( 50 Lg /ml) + - +
青霉素( p enicil lin) ( 100 Lg/ ml) + - -
中性红( neutral red ) ( 0. 1% ) + - -
甲基橙(methy l orange) ( 0. 2% ) + - -
NaCl( sodium chlor ide) ( 3% ) + + -
40℃ + + -
石蕊牛奶产碱 ( litmus milk alkali product ion) - + +
BTB反应( reaction of BTB) + + -
新表观群中的菌株在对 D-核糖、L-白氨酸、A-鸟
氨酸的利用上与 S. medica 相同, 对 L-酪氨酸的利用
则与 S. medica和 S . mel ilot i都不同;对白霉素的耐受
性与 S . meliloti 相同, 而对青霉素 100 Lg / ml 的耐受
性与 S . medica和 S . mel iloti都不同; 对 0. 1%中性红
278 草 地 学 报 第 12卷
和 0. 2%甲基橙的耐受性及石蕊牛奶产碱与S . medica
和 S. mel iloti 也都不同; 对 3% NaCl和 40℃的耐受
性、BT B反应则与 S . medica 相同。由此可见,该表观
群之所以没能与同寄主的两株模式菌 S. medica或 S .
meli lot i聚在一起,是因其在鉴别特征上存在着较明显
的特殊性。
图 1 数值分类树状图
F ig . 1 Dendrog ram o f numer ical tax onom y of rhizobia l str ains
279第 4期 万晓红等:紫花苜蓿品种根瘤菌表型多样性研究
3 结论与讨论
3. 1 国际上对豆科根瘤菌的研究和应用已有一百多
年的历史。几乎在全世界范围内对苜蓿进行根瘤菌接
种都已没有争议, 认为绝大多数农业土壤,特别是新
区,种植苜蓿都需要接种相适宜的根瘤菌。接种根瘤菌
可提高苜蓿的成苗率、幼苗结瘤率,增加苜蓿产草量和
蛋白质含量, 同时还可以增加土壤肥力,使苜蓿的后茬
作物获得增产。所以世界各国都很重视苜蓿根瘤菌的
研究及应用。但苜蓿根瘤菌的不同菌株与不同品种相
互间有很强的选择性, 只有共生性很强的“菌株——品
种”组合才能形成共生固氮最佳体系。因此,苜蓿根瘤
菌优良菌种的筛选、与植物的最优匹配及根瘤菌剂生
产工艺的研究应用已势在必行。
3. 2 本试验通过对 22个不同品种紫花苜蓿根瘤菌表
型多样性分析,得到 3株对抗生素、化学药剂和盐碱耐
受性较强的菌株, 它们是 NWMSH022、NWMSH023
和 NWMSH028, 其寄主分别为塞特、苜蓿王、关中。塞
特引进于荷兰,根系发达, 适宜在干旱地区生长; 苜蓿
王从美国引进,苗期生活力强,产量较高, 刈割再生能
力极强,适于东北、内蒙古东部和西北地区种植; 关中
是陕西关中及渭北旱塬古老的苜蓿地方品种,返青早,
生长速度快, 属早熟品种,抗旱和抗寒性中等。这 3株
菌与其寄主是否为最优匹配还有待回接结果证实。同
时从数值分析得出:
3. 2. 1 在 89%的相似水平上, 除 NWMSH009 和
NWMSH023 外, 所有的未知菌株聚为一个不含已知
参比菌株的新表观群,说明它们可能是一类新的根瘤
菌种群;
3. 2. 2 来自同一试验田不同品种紫花苜蓿的根瘤菌能
很好地聚在一个新表观群中,说明生态环境是影响根瘤
菌生理生化表型特征的重要因素,即环境影响表型[ 7] ;
3. 2. 3 从亚群的划分又说明根瘤菌的表型特征也会
受到寄主的影响[ 3] ,那么根瘤菌的系统发育进化究竟
与哪些外部因素有关, 还有待进一步研究。
参考文献
[ 1] 王宗礼. 优质牧草新品种及栽培技术[ M ] .北京:中国劳动保障出
版社, 2002, 1
[ 2] 高振生,马其东,牛志强. 沿海滩涂地区苜蓿根瘤菌接种方法和效
果的研究[ J] . 草地学报, 1996, 4( 4) : 288～293
[ 3] 韦革宏,陈文新,朱铭莪. 陕甘宁地区根瘤菌数值分类与 DNA 同
源性分析[ J] . 应用与环境生物学报, 1999, 5( 1) : 73～78
[ 4] 韦革宏,陈文新,朱铭莪. 分离自鸡眼草和木兰的根瘤菌分类研究
[ J] . 微生物学报, 1999, 39( 5) : 387～395
[ 5] 阚凤玲,陈文新. 西部某些根瘤菌的数值分类和 16srDNA PCR-
RFLP 分析[ J] . 微生物学通报, 2002, 29( 3) : 1～8
[ 6] 王素英,许晓东,蔡雪梅,邓必清,杨晓丽. 西藏根瘤菌的数值初步
分类研究[ J] . 微生物学通报, 2002, 29( 6) : 5～9
[ 7] 阎爱民,陈文新. 苜蓿、草木樨、锦鸡儿根瘤菌的表型多样性分析
[ J] . 生物多样性, 1999, 7( 2) : 112～119
(上接 275页)
参考文献
[ 1] DHalluin K, Boteerman J , d e Greef W . Engineer ing of herbicide-
res istant al falfa and evaluat ion under f ield condit ions [ J ] . Crop
Sci, 1990, 30: 866～871
[ 2 ] T homas J C, Wasmann C C, Echt C, et al . Int roduct ion and
exp res sion of an ins ect proteinase inh ibitor in alfal fa ( Medicago
sat iv a L. ) [ J ] . Plant Cel l Rep, 1994, 14: 31～36
[ 3 ] Hil l K K, et al . T he development of vi rus-resis tant alfal fa,
Med icag o sat iv a L[ J] . Bio/T echnolog y, 1991, 9: 373～377
[ 4] Wandelt C, et al. Vicilin w ith carboxy-termin al KDEL is retained
in th e endoplasmic ret iculum and accumulates to high levels in the
leaves of t rans genic plants [ J ] . T he Plant Journ al , 1992, ( 2) :
181～192
[ 5] S chroeder H E, et al. Expr ess ion of chicken ovalbumin gene in
three Lu cer ne cul t ivars [ J ] . Aust ralian Journal of Plant
Physiology , 1991, 18: 495～505
[ 6] 吕德扬,曹学远, 唐顺学,等. 紫花苜蓿外源基因共转化植株的再
生[ J] .中国科学( C辑) , 2000, 30( 4) : 342～348
[ 7] 吕德扬,等. 苜蓿高含硫氨基酸蛋白转基因植株再生[ J] . 遗传学
报, 2000, 27( 4) : 331～337
[ 8 ] Shahin E A, et al . Transformat ion of cu lt ivated alfalfa us ing
disarmed A g robacter ium tumef aciens [ J ] . C rop S ci. , 1986, 26:
1235～1239.
280 草 地 学 报 第 12卷