全 文 ：第20卷　第6期
　Vol.20　 No.6
草　地　学　报
ACTA AGRESTIA SINICA
　　　　　2012年 11月
　 Nov.　　2012
AFLP分子标记对9份狗牙根材料的鉴定分析
赵　琴,刘　君,杨志民∗
(南京农业大学草坪研究与开发工程技术中心,江苏 南京　210095)
摘要:狗牙根(Cynodondactylon)是全球最重要、品种最丰富的暖季型草坪草种之一,种或品种间形态相近,采用传
统形态学和田间小区试验等方法难以作出鉴定,本试验利用 AFLP分子标记技术,对9份常用狗牙根材料的遗传
多样性进行了分析。结果表明:13对引物共扩增出1326个条带,平均每对引物扩增出93.2条带,其中多态性条带
有1212条,多态性条带比率为91.71%,材料间遗传相似系数(GS)为0.469~0.797,变幅为0.328。聚类分析表
明,在GS值为0.648处,可将9份常用狗牙根材料分为5类:T-419、小矮人和老鹰草为一类,摄政王单独为一类,
瑞拉和黑杰克为一类,南京狗牙根和普通狗牙根聚为一类,阳江狗牙根单独为一类。依据P7/M3引物对电泳图
谱,构建了9份狗牙根材料的指纹图谱。
关键词:狗牙根;品种鉴定;AFLP;遗传多样性;聚类分析
中图分类号:S338　　　　文献标识码:A　　　　　文章编号:1007-0435(2012)06-1156-07
IdentificationAnalysisof9BermudagrassMaterialsbyAFLPMolecularMarkers
ZHAOQin,LIUJun,YANGZhi-min∗
(TurfEngineeringandTechnologyCenterofNanjingAgriculturalUniversity,Nanjing,JiangsuProvince210095,China)
Abstract:Bermudagrassisoneofthemostimportantwarm-seasonturfgrassspecieswithabundantvarie-
tiesalovertheworld.Becauseofthesimilarmorphology,itisdifficulttoidentifyspeciesorvarieties
throughthetraditionalmorphologicalmethodsandfieldplottestmethod.Inthisstudy,amplifiedfrag-
mentlengthpolymorphism(AFLP)molecularmarkerwasusedtoanalyzegeneticdiversitiesof9bermuda-
grassmaterials.Resultsshowedthatatotalof1326bandswereamplifiedbythirteenAFLPprimerpairs
frombermudagrassgeneticDNA.Therewere1212(98.74%)polymorphicbands.TheAFLP-basedge-
neticsimilarityvaluesamong9bermudagrassaccessionsrangedfrom0.469to0.797withtherangeof
0.328.Clusteranalysisindicatedthatalaccessionscouldbedividedinto5groupswhenthegeneticssimi-
laritycoefficientwas0.648.Tifway(T-419),TifeagleandTifdwarfwereclusteredintothefirstgroup;
Regentbelongedtothesecondgroup;RivieraandBlackjackwerethethirdgroup;NanjingandCommon
wereclusteredastheforthgroupandYangjiangasthefifthgroup.Fingerprintsof9bermudagrassmateri-
alswereestablishedbasedonelectrophoresismapofproductsamplifiedbyP7/M3primercombinations.
Keywords:Bermudagrass;Varietyidentification;AFLP;Clusteranalysis;Fingerprinting
　　狗牙根(Cynodondactylon)又名绊根草、百慕
大草,属禾本科狗牙根属多年生草本植物,具有繁殖
力强、抗旱、耐践踏、质地细腻、色泽好等优良特性,
广泛用于高尔夫球场、足球场和城市绿化,是全球暖
季型草坪草中坪用价值最高、应用最广泛的草种之
一[1-2]。
近年来随着狗牙根市场应用品种的增多,出现
了品种混淆、冒名顶替的现象,影响了品种的使用年
限和特定设计功能的发挥,法律纠纷案件时有发生。
传统的品种鉴定主要采用形态学方法、田间小区法
等,这些方法都不同程度地存在缺陷,不能充分地将
坪用狗牙根品种鉴定开来。AFLP(amplifiedfrag-
mentlengthpolymerphism)是在 RAPD和 RFLP
标记系统基础上发展而来的一种分子标记技术[3]。
具有稳定性高、重复性好、多态性检测效率高等特
点,因此,被广泛应用于植物的遗传多样性、遗传图
谱、基因定位、指纹图谱等方面的研究[4-7]。在草坪
草遗传多样性方面,白史且等采用AFLP技术对9
收稿日期:2012-06-12;修回日期:2012-11-18
基金项目:江苏省基础研究计划项目(BK2009481)资助
作者简介:赵琴(1986-),女,河南三门峡人,硕士研究生,研究方向为草坪草遗传育种,E-mail:zhaoqin0217@163.com;∗通信作者 Author
forcorrespondence,E-mail:nauyzm@njau.edu.cn
第6期 赵琴等:AFLP分子标记对9份狗牙根材料的鉴定分析
份假俭草(Eremochloaophiuroides)种质资源进行
了DNA指纹图谱分析[8],Puecher等利用AFLP技
术有效地检测了扁穗雀麦(Bromuscartharticus)的
遗传多样性[9],Ferdinandez和 Coulman用 AFLP
分子标记技术有效地评估了无芒雀麦(B.inermis)
2个种以及它们的杂种遗传变异和遗传关系[10],于
卓等利用 AFLP分子标记技术对加拿大披碱草
(Elymuscanadensis)与披碱草(E.dahuricus)、圆
柱披碱草(E.cylindricus)2个种间杂种F1 及其亲
本的遗传差异性进行比较分析,其中多态性位点比
率高达83.56%;各供试材料的遗传距离(GD)为
0.4276~0.7486[11]。Zhang等利用 AFLP标记技
术鉴别了27个狗牙根品种(品系),并用 UPGMA
将其聚为3类[12],Wu等利用AFLP分析了来自11
个国家的狗牙根种质资源的遗传变异,并分析了中
国的119份狗牙根种质资源的遗传多样性[13-14],
Kang等利用AFLP标记将采自韩国的43份野生
狗牙根分为6类[15],齐晓芳等利用AFLP标记对采
自非洲以及中国的44份野生狗牙根材料进行遗传
多样性分析[16]。在品种鉴定方面,利用AFLP技术
进行草坪草品种鉴定的研究较少,主要集中在园艺
作物和观赏植物方面,李红斌等[17]利用AFLP标记
技术对杭州地区10个主要青菜(Brassicachinen-
sis)品种进行了指纹图谱分析,5对引物对10个青
菜品种的区分率均达100%。尹佟明等利用AFLP
标记将42个美洲黑杨(Populusdeltoides)无性系
清楚地区分开来[18],朱红霞采用AFLP技术建立了
芍药属牡丹(Paeoniasuffruticosa)5个品种和芍
药(P.lactiflora)6个品种的DNA指纹图谱[19],刘
淑君等利用AFLP技术对12个番茄(Solanumlycop-
ersicum)品种进行鉴定分析[20],RoldanRuiz等用
AFLP标记技术对14个多年生黑麦草(Loliumpe-
renne)品种遗传一致性进行了评估[21],贺小霞等利用
AFLP标记技术对5个海滨雀稗(Paspalumvagina-
tum)品种进行了鉴定分析[22]。
本研究利用 AFLP分子标记技术对目前9份
常用坪用狗牙根材料进行鉴定分析,旨在建立9份
狗牙根指纹图谱,为坪用狗牙根的应用和保护提供
技术支持。
1　材料与方法
1.1　材料
供试狗牙根材料分别为黑杰克(Blackjack)、瑞
拉(Riviera)、摄政王(Regent)、老鹰草(Tifeagle)、
阳江狗牙根(Yangjiang)、T-419(Tifway)、普通狗
牙根(Common)、小矮人(Tifdwarf)和南京狗牙根
(Nanjing),预培养在南京农业大学芳华园艺中心牌
楼实验基地,材料来源如表1所示。2010年5月上
旬,草坪草完全返青后,分别随机采集9份狗牙根材
料的新鲜幼叶2g,每份材料重复3次取样,去离子
水冲洗擦干后用自封袋封装,编号保存在-80℃冰
箱中备用。
表1　试验材料及其来源
Table1　Originsofbermudagrasstestedmaterials
编号
No.
材料名称 Materials 材料来源 Materialsources
1 老鹰草 Tifeagle 南京农业大学芳华园艺中心
2 小矮人 Tifdwarf 南京农业大学芳华园艺中心
3 摄政王 Regent 南京钟山高尔夫球场
4 黑杰克Blackjack 北京绿冠草业科技发展中心
5 T-419Tifway 南京农业大学芳华园艺中心
6 瑞拉 Riviera 北京绿冠草业科技发展中心
7 南京狗牙根 Nanjing 南京中山植物园
8 普通狗牙根Common 南京当地野生资源
9 阳江狗牙根 Yangjiang 南京中山植物园
1.2　方法
1.2.1　基因组DNA的提取与检测　采用CTAB
法提取狗牙根基因组DNA。用8g·L-1琼脂糖、
GoldView染色凝胶电泳检测质量,核酸蛋白分析
仪检测DNA的浓度和纯度。并将各组DNA用灭
菌水稀释成50ng·μL-1的工作液,保存在-20℃
冰箱中备用。
1.2.2　AFLP分析
1.2.2.1　限制性酶切及连接反应　采用PstⅠ和
MseⅠ 限制性内切酶对供试材料基因组DNA进行
酶切和连接,反应体系为:基因组 DNA 模板(50
ng·μL-1)4μL,Adapter(表2)1μL,PstⅠ/MseⅠ
2μL,10×Reactionbuffer2.5μL,10mM ATP
2.5μL,T4Ligase1μL,H2O7μL。混匀离心数
秒,37℃ 保温5h,8℃保温4h,4℃过夜,完成后于
-20℃保存备用。
表2　PstⅠ-MseⅠ的接头序列
Table2　AdaptersequenceofPstⅠandMseⅠ
接头名称
Adaptername
序列
Sequence
PstⅠ 5′-CTCGTAGACTGCGTACATGCA-3′
5′-TGTACGCAGTCTAC-3′
MseⅠ 5′-GACGATGAGTCCTGAG-3′
5′-TACTCAGGACTCAT-3′
7511
草　地　学　报 第20卷
1.2.2.2　预扩增和选择性扩增　按王斐等[23]的方
法稍加改进。通过PstⅠ和 MseⅠ接头引物进行
预扩增,其反应程序为94℃2min,94℃30s,56℃
30s,72℃80s,30个循环,72℃5min,4℃保存。
取7μL预扩增产物,用15g·L-1琼脂糖凝胶电泳
检测。预扩产物1∶20稀释后作为选扩模板,PstⅠ
和MseⅠ选择性引物各8个,随机组合64个引物
对进行筛选(表3)。选择性扩增反应程序为:第一
个循环:94℃30s,65℃30s,72℃80s;以后每循
环温度递减0.7℃,扩增12个循环;94℃30s,55℃
30s,72℃80s,23个循环;72℃ 延伸5min;4℃保
存。扩增产物在ABI377测序仪上电泳,筛选出能
够扩增出清晰条带且多态性高的引物。
表3　AFLP分析所用的选扩引物及其碱基序列
Table3　PrimersusedinAFLPanalysis
引物Primers 序列Sequences
P1 5′-GACTGCGTACATGCAGAA-3′
P2 5′-GACTGCGTACATGCAGAC-3′
P3 5′-GACTGCGTACATGCAGAG-3′
P4 5′-GACTGCGTACATGCAGAT-3′
P5 5′-GACTGCGTACATGCAGTA-3′
P6 5′-GACTGCGTACATGCAGTC-3′
P7 5′-GACTGCGTACATGCAGTG-3′
P8 5′-GACTGCGTACATGCAGTT-3′
M1 5′-GATGAGTCCTGAGTAACAA-3′
M2 5′-GATGAGTCCTGAGTAACAC-3′
M3 5′-GATGAGTCCTGAGTAACAG-3′
M4 5′-GATGAGTCCTGAGTAACAT-3′
M5 5′-GATGAGTCCTGAGTAACTA-3′
M6 5′-GATGAGTCCTGAGTAACTC-3′
M7 5′-GATGAGTCCTGAGTAACTG-3′
M8 5′-GATGAGTCCTGAGTAACTT-3′
　　注:MseⅠ引物5′端采用FAM荧光标记
Note:MseⅠprimers5′endwiththeFAMfluorescencelabeling
1.2.2.3　数据处理　对完全扩增引物的电泳结果
进行量化,有谱带记为“1”,无谱带记为“0”,对多态
性位点进行统计,并计算多态性位点百分率。利用
NTSYS2.1软件进行统计分析,选择 Qualitiative
data程序,计算遗传相似系数(GS)[24]。获得相似
系数矩阵后,采用SAHN程序中非加权配对算术方
法(UPGMA)进行聚类分析,并通过Treeplot模块
生成聚类图。
1.2.2.4　9份狗牙根材料的指纹图谱构建　根据
PCR扩增结果,以扩增产物电泳图为基础,选取清
晰的多态性位点绘制电泳模式图,构建9份狗牙根
材料的指纹图谱。
2　结果与分析
2.1　酶切连接结果
采用酶切与连接一步完成方式进行,经检测在
15g·L-1琼脂糖凝胶上可形成非常明亮且比较集
中的带纹,表明酶切较完全,连接效果较好,可用于
下一步试验(图1)。
2.2　AFLP扩增产物的多态性分析
从64对引物中筛选出13对带型稳定、清晰均
匀、多态性较高的AFLP引物(表4),对9份狗牙根
材料进行AFLP扩增。试验共统计到1326个扩增
片段,平均每对引物的扩增条带为102条,扩增条带
数目变化范围为82~118条,多态性条带为1212
条,平均每对引物的多态性条带为93.2条,变化范
围为 68~111 条,多 态 性 比 率 (PPB)平 均 为
91.71%,不同引物PCR扩增产物的多态性比率变
化范围为80.68%~99.07%(表4)。AFLP引物扩
增出的狗牙根DNA片段长度大小约在50~500bp
之间。以上结果表明供试狗牙根间的变异大,多态
性高,存在着丰富的遗传多样性(图2),AFLP技术
可用于检测狗牙根品种间的遗传差异。
图1　狗牙根基因组DNA酶切连接琼脂糖凝胶电泳结果
Fig.1　AgarosegelelectrophoresisofdoubledigestionandadapterligatedofbermudagrassgenomeDNA
注:1:老鹰草;2:小矮人;3:摄政王;4:黑杰克;5:T-419;6:瑞拉;7:南京狗牙根;8:普通狗牙根;9:阳江狗牙根
Note:1:Tifeagle;2:Tifdwarf;3:Regent;4:Blackjack;5:Tifway;6:Riviera;7:Nanjing;8:Common;9:Yangjiang
8511
第6期 赵琴等:AFLP分子标记对9份狗牙根材料的鉴定分析
图2　9份狗牙根材料的P7/M3AFLP选择性扩增产物电泳图谱
Fig.2　Selectiveamplificationof9bermudagrassmaterialsbyP7/M3primers
注:C1~C3:老鹰草;C4~C6:小矮人;C7~C9:摄政王;C10~C12:黑杰克;C13~C15:T-419;C16~C18:瑞拉;C19~C21:南京狗牙
根;C22~C24:普通狗牙根;C25~C27:阳江狗牙根
Note:C1~C3:Tifeagle;C4~C6:Tifdwarf;C7~C9:Regent;C10~C12:Blackjack;C13~C15:Tifway;C16~C18:Riviera;C19~C21:
Nanjing;C22~C24:Common;C25~C27:Yangjiang
表4　狗牙根AFLP标记的多态性结果
Table4　PolymorphicresultsofAFLPmarkerinbermudagrassmaterials
引物对
Primerpairsbands
扩增总带数
Totalnumberofpolymorphicbands
多态性条带数
Numberofpolymorphicbands
多态性比率/%
Percentageofpolymorphicbands
P1/M1 94 83 88.30
P1/M2 106 97 91.51
P1/M8 86 83 96.51
P2/M2 96 84 87.50
P2/M3 111 99 89.20
P3/M5 118 111 94.07
P3/M7 111 106 95.50
P4/M1 112 107 95.54
P4/M2 82 68 82.93
P4/M5 88 71 80.68
P4/M6 115 103 89.57
P7/M3 108 107 99.07
P8/M5 99 93 93.94
总计 Total 1326 1212
平均 Mean 102.0 93.2 91.40
9511
草　地　学　报 第20卷
2.3　AFLP标记的遗传相似性分析
对扩增结果采用Nei-Li相似系数(GS)的计算
方法,得到供试材料的遗传相似矩阵(表5)。供试
材料的GS值在0.469~0.797之间,变幅为0.328。
由相似系数矩阵可以看出,在供试狗牙根材料中,摄
政王和南京狗牙根之间的遗传相似系数最小,为
0.469,其遗传距离最大,表明摄政王和南京狗牙根
之间的亲缘关系最远;而老鹰草和小矮人之间的遗
传相似系数最大,为0.797,其遗传距离最小,表明
老鹰草和小矮人之间的亲缘关系最近。由遗传相似
系数分析可知,供试各材料之间差异较为明显。
表5　9份狗牙材料AFLP标记的遗传相似系数矩阵
Table5　Coefficientsofgeneticsimilarityfor9bermudagrassmaterialsbasedonAFLPmarkers
老鹰草
Tifeagle
小矮人
Tifdwarf
摄政王
Regent
黑杰克
Blackjack
T-419
Tifway
瑞拉
Riviera
南京狗牙根
Nanjing
普通狗牙根
Common
阳江狗牙根
Yangjiang
老鹰草Tifeagle 1.000
小矮人Tifdwarf 0.797 1.000
摄政王Regent 0.538 0.532 1.000
黑杰克Blackjack 0.543 0.543 0.550 1.000
T-419Tifway 0.698 0.683 0.585 0.528 1.000
瑞拉Riviera 0.563 0.576 0.514 0.690 0.535 1.000
南京狗牙根Nanjing 0.498 0.512 0.469 0.617 0.513 0.655 1.000
普通狗牙根Common 0.512 0.526 0.512 0.658 0.506 0.666 0.695 1.000
阳江狗牙根Yangjiang 0.573 0.567 0.522 0.623 0.548 0.666 0.594 0.606 1.000
2.4　AFLP标记的聚类分析
基于遗传相似系数,利用UPGMA法对供试材
料进行聚类分析(图3)。从聚类图可以看出,在遗
传相似系数为0.561水平时,9份供试狗牙根材料
可聚为3类:T-419、老鹰草和小矮人聚为第1类,从
形态特征方面观察,三者都具有植株矮小,叶片短而
小等特点。摄政王单独聚为第2类;其余5份材料
聚为第3类。在遗传相似系数0.648水平时,可将
第3类分为3个亚类:黑杰克和瑞拉聚为第1亚
类;南京狗牙根与普通狗牙根聚为第2亚类;阳江狗
牙根自成第3亚类。摄政王与T-419、老鹰草、小矮
人的遗传距离较远,容易区分。
图3　基于AFLP标记的9份狗牙根材料的UPGMA聚类图
Fig.3　Dendrogramof9bermudagrassmaterials
basedonAFLPmarkers
2.5　9份狗牙根材料AFLP标记的指纹谱带
从13对引物的扩增结果,在3次重复中选择电
泳带型稳定、清晰均匀、多态性较高的引物对P7/M3
的扩增图谱,构建9份狗牙根材料指纹谱带(表6)。
由表6可知,每个供试材料均有特征性谱带与其他
8份材料相区分。老鹰草在70和396bp有特征条
带,小矮人在317,358和376bp处有特征条带,摄
政王在310bp处有特征条带,黑杰克在152bp处
有特征条带,T-419在480bp处有特征条带,瑞拉
在314,330,367,402和408bp处有特征条带,南京
狗牙根在347,349,391和444bp处有特征条带,普
通狗牙根在411和441bp处有特征条带,阳江狗牙
根在369和373bp处有特征条带。
3　讨论与结论
利用AFLP标记技术,采用荧光标记引物检测
分析了供试9份狗牙根材料的遗传多样性。13对
引物组合共检测到了1212个多态位点,多态性比率
(PPB)平均为91.40%,不同引物PCR扩增产物的
多态性比率变化范围为80.68%~99.07%,多态性
丰富。说明 AFLP分子标记技术适用于植物遗传
多样性分析和品种鉴定分析研究。
狗牙根种质资源异常丰富,其形态学特征往往
是基因型和环境条件相互作用的表现,很多研究结
果表明,来源相同或相近的种质资源遗传聚类与地
0611
第6期 赵琴等:AFLP分子标记对9份狗牙根材料的鉴定分析
表6　引物对P7/M3构建的9份狗牙根材料的AFLP指纹模式图
Table6　AFLPfingerprintsof9bermudagrassmaterialsamplifiedbyP7/M3primer
供试狗牙根Bermudagrassmaterials
DNA片段长度/bp
DNAfragmentlength
老鹰草
Tifeagle
小矮人
Tifdwarf
摄政王
Regent
黑杰克
Blackjack
T-419
Tifway
瑞拉
Riviera
南京狗牙根
Nanjing
普通狗牙根
Common
阳江狗牙根
Yangjiang
70 -
75 - - - - - - -
152 -
310 -
314 -
317 -
330 -
347 -
349 -
350 - -
352 - - - -
358 -
367 -
369 -
373 -
376 -
378 - - -
391 -
394 - - - -
396 -
402 -
405 - - -
408 -
411 -
441 -
444 -
480 -
理来源之间并无严格的一致性关系。如周少云
等[25]对我国广东地区狗牙根的遗传多样性分析显
示种质资源的基因型与地理来源之间并无严格的一
致性关系。另外,采用不同的标记方法进行的聚类
分析,其结果也存在差异,刘君等利用SRAP分子
标记可将9个狗牙根聚为2类,T-419、老鹰草、小矮
人为一类,摄政王、瑞拉、南京狗牙根、黑杰克、阳江
狗牙根和普通狗牙根为一类[26],而本试验将9份狗
牙根材料聚为5类,T-419、小矮人、老鹰草聚为一
类,摄政王和阳江狗牙根各自聚为一类,南京狗牙根
和普通狗牙根聚为一类,瑞拉和黑杰克聚为一类。
二者试验结果存在一定差异,但不论采用哪一种标
记方法,都将T-419、小矮人、老鹰草聚为一类,说明
这3种狗牙根无论从选择性扩增限制性酶切片段,
还是从内含子、启动子与间隔区长度不同角度分析,
三者都具有较高的遗传相似性。同时,由于2种标
记方法分析角度的不同,使其分析结果也存在着差
异,二者之间的区别与联系都需要进一步研究。因
此,在研究植物遗传多样性和亲缘关系时,应根据试
验的目的和要求选择相应的分子标记方法,以获得
较好的试验结果。
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(责任编辑　李美娟)
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