全 文 ：第２０卷　第１期
　Ｖｏｌ．２０　 Ｎｏ．１
草　地　学　报
ＡＣＴＡ　ＡＧＲＥＳＴＩＡ　ＳＩＮＩＣＡ
　　　２０１２年　 １月
　 Ｊａｎ．　　２０１２
红三叶新品系组织培养和植株再生
高雪芹１，王俊杰１，２＊，云锦凤１，２＊，侯永霞１，王明涛１，张元科 １
（１．内蒙古农业大学生态环境学院，内蒙古 呼和浩特　０１００１９；
２．内蒙古自治区草品种育繁工程技术研究中心，内蒙古 呼和浩特　０１００１９）
摘要：利用红三叶（Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ　ｐｒａｔｅｎｓｅ　Ｌ．）新品系无菌苗不同部位，通过愈伤组织诱导及分化途径获得再生植株。
结果表明：子叶、下胚轴、叶柄、叶片及根段在 ＭＳ＋０．５ｍｇ·Ｌ－１　６－ＢＡ＋１～２ｍｇ·Ｌ－１　２，４－Ｄ培养基上都极易诱
导出愈伤组织。最佳继代培养基为 ＭＳ＋０．５ｍｇ·Ｌ－１　６－ＢＡ＋１．０ｍｇ·Ｌ－１　２，４－Ｄ，添加２，４－Ｄ比ＮＡＡ更利于愈
伤的增长和保存；最佳分化培养基为 ＭＳ＋０．７５ｍｇ·Ｌ－１　６－ＢＡ＋０．５ｍｇ·Ｌ－１　ＮＡＡ，最高分化率为１６．６７％，且分
裂素６－ＢＡ优于ＫＴ，６－ＢＡ与ＮＡＡ组合比与ＩＢＡ组合更有利于红三叶愈伤组织的分化；茎芽增殖最佳培养基为
ＭＳ＋０．５ｍｇ·Ｌ－１　６－ＢＡ＋１．０ｍｇ·Ｌ－１　ＩＢＡ，再生苗的增殖效果ＩＢＡ＞ＮＡＡ，２，４－Ｄ不利于茎芽生长；最佳生根条
件为５０ｍｇ·Ｌ－１浓度的ＩＢＡ中浸泡１ｈ后植入含０．５ｍｇ·Ｌ－１　ＩＢＡ的 ＭＳ中，生根率达８０％，红三叶新品系ＩＢＡ
生根最大极限浓度为０．７５ｍｇ·Ｌ－１，浓度过高表现出对根系生长的毒害。
关键词：红三叶；愈伤组织诱导；分化；植株再生
中图分类号：Ｓ５４１．２；Ｑ９４３．１　　　　文献标识码：Ａ　　　　　文章编号：１００７－０４３５（２０１１）０１－０１５９－０７
Ｔｉｓｓｕｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　ａｎｄ　Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｒｅｄ　Ｃｌｏｖｅｒ　Ｎｅｗ　Ｌｉｎｅ
ＧＡＯ　Ｘｕｅ－ｑｉｎ１，ＷＡＮＧ　Ｊｕｎ－ｊｉｅ１，２＊，ＹＵＮ　Ｊｉｎ－ｆｅｎｇ１，２＊，ＨＯＵ　Ｙｏｎｇ－ｘｉａ１，
ＷＡＮＧ　Ｍｉｎｇ－ｔａｏ１，ＺＨＡＮＧ　Ｙｕａｎ－ｋｅ１
（１．Ｃｏｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｅｃｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｎｅｒ　Ｍｏｎｇｏｌｉａ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈｕｈｈｏｔ，Ｉｎｎｅｒ　Ｍｏｎｇｏｌｉａ
Ａｕｔｏｎｏｍｏｕｓ　Ｒｅｇｉｏｎ　０１００１９，Ｃｈｉｎａ；２．Ｉｎｎｅｒ　Ｍｏｎｇｏｌｉａ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｆｏｒａｇｅ
Ｂｒｅｅｄｉｎｇ　ａｎｄ　Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，Ｈｕｈｈｏｔ，Ｉｎｎｅｒ　Ｍｏｎｇｏｌｉａ　Ａｕｔｏｎｏｍｏｕｓ　Ｒｅｇｉｏｎ　０１００１９，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｒｅｄ　ｃｌｏｖｅｒ　ｎｅｗ　ｌｉｎｅ（Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ　ｐｒａｔｅｎｓｅ　Ｌ．）ｉｓ　ａ　ｃｏｌｄ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ　ｍａｔｅｒｉａｌ　ｄｏｍｅｓｔｉｃａｔｅｄ　ｆｒｏｍ　ｎａｔｕ－
ｒａｌ　ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｅｄ　ｒｅｄ　ｃｌｏｖｅｒ　ｉｎ　Ｄａｘｉｎｇａｎｌｉｎｇ．Ｉｔ　ｗａｓ　ｃｕｌｔｉｖａｔｅｄ　ａｎｄ　ｓｅｌｅｃｔｅｄ　ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃａｌｙ　ｂｙ　Ｉｎｎｅｒ　Ｍｏｎｇｏｌｉａ
Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｖｅｒ　１０ｙｅａｒｓ．Ｉｔ　ｈａｄ　ｇｏｏｄ　ａｄａｐｔａｂｉｌｉｔｙ　ａｎｄ　ｃｏｌｄ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｃｅｎｔｒａｌ　ａｎｄ　ｗｅｓｔ－
ｅｒｎ　ｏｆ　Ｉｎｎｅｒ　Ｍｏｎｇｏｌｉａ．Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｐｌａｎｔｓ　ｗｅｒｅ　ｐｒｏｐａｇａｔｅｄ　ｂｙ　ｍｅａｎｓ　ｏｆ　ｃａｌｕｓ　ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａ－
ｔｉｏｎ　ｕｓｉｎｇ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｅｘｐｌａｎｔｓ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｃｏｔｙｌｅｄｏｎｓ，ｈｙｐｏｃｏｔｙｌ，ｐｅｔｉｏｌｅ，ｌｅａｆ　ａｎｄ　ｒｏｏｔ　ｃａｌｕｓ　ｗｅｒｅ
ｅａｓｉｌｙ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｉｎ　ａ　ｇｒｏｗｔｈ　ｍｅｄｉｕｍ　ｏｆ　ＭＳ　ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　０．５ｍｇ·Ｌ－１　６－ＢＡ　ａｎｄ　１～２ｍｇ·Ｌ－１　２，４－Ｄ．Ｔｈｅ
ｂｅｓｔ　ｃａｌｕｓ　ｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅ　ｍｅｄｉｕｍ　ｗａｓ　ＭＳ　ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　０．５ｍｇ·Ｌ－１　６－ＢＡ　ａｎｄ　１．０ｍｇ·Ｌ－１　２，４－Ｄ．Ａｄｄｉｎｇ　２，
４－Ｄ　ｗａｓ　ｍｏｒｅ　ｃｏｎｄｕｃｉｖｅ　ｔｏ　ｃａｌｕｓ　ｇｒｏｗｔｈ　ａｎｄ　ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ　ｔｈａｎ　ＮＡＡ．Ｔｈｅ　ｂｅｓｔ　ｍｅｄｉｕｍ　ｆｏｒ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ
ｗａｓ　ＭＳ　ｐｌｕｓ　０．７５ｍｇ·Ｌ－１　６－ＢＡ　ａｎｄ　０．５ｍｇ·Ｌ－１　ＮＡＡ　ｗｉｔｈ　ｕｐ　ｔｏ　１６．６７％ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｒａｔｅ．Ｔｈｅ　ｄｉｆ－
ｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｅｆｆｅｃｔ　ｗａｓ　ｂｅｔｔｅｒ　ｗｉｔｈ　６－ＢＡ　ｔｈａｎ　ＫＴ，ｗｈｉｌｅ　ｔｈｅ　ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　６－ＢＡ　ａｎｄ　ＮＡＡ　ｗａｓ　ｂｅｔｔｅｒ　ｔｈａｎ
ｔｈａｔ　ｏｆ　６－ＢＡ　ａｎｄ　ＩＢＡ．Ｃｏｒｍ－ｂｕｄ　ｃｏｕｌｄ　ｂｅ　ｍｕｌｔｉｐｌｉｃａｔｅｄ　ｉｎ　ＭＳ　ｍｅｄｉｕｍ　ｐｌｕｓ　０．５ｍｇ·Ｌ－１　６－ＢＡ　ａｎｄ　１．０ｍｇ
·Ｌ－１　ＩＢＡ，ａｎｄ　２，４－Ｄ　ｗａｓ　ｎｏｔ　ｃｏｎｄｕｃｉｖｅ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｏｆ　ｓｔｅｍ　ａｎｄ　ｂｕｄｓ．ＩＢＡ　ｗａｓ　ｂｅｔｔｅｒ　ｔｈａｎ　ＮＡＡ　ｆｏｒ
ｒｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ　ｓｅｅｄｌｉｎｇ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ．Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ　ｐｌａｎｔｓ　ｗｅｒｅ　ｉｍｍｅｒｓｅｄ　ｉｎ　５０ｍｇ·Ｌ－１　ＩＢＡ　ｆｏｒ　１ｈｔｈｅｎ　ｓｕｂ－
ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｉｎ　ＭＳ　ｍｅｄｉｕｍ　ｐｌｕｓ　ＩＢＡ　０．５ｍｇ·Ｌ－１，ｔｈｅ　ｒｏｏｔｉｎｇ　ｒａｔｅ　ｗａｓ　８０％．Ｔｈｅ　ｍａｘｉｍｕｍ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ
ＩＢＡ　ｆｏｒ　ｒｏｏｔｉｎｇ　ｗａｓ　０．７５ｍｇ·Ｌ－１，ｏｔｈｅｒｗｉｓｅ　ｔｈｅ　ｈｉｇｈ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｉｓ　ｈａｒｍｆｕｌ　ｔｏ　ｒｏｏｔ　ｇｒｏｗｔｈ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｒｅｄ　ｃｌｏｖｅｒ；Ｃａｌｕｓ　ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ；Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ；Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ
　　红三叶（Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ　ｐｒａｔｅｎｓｅ　Ｌ．）是豆科（Ｌｅｇｕ－
ｍｉｎｏｓａｅ）车轴草属（ＴｒｉｆｏｌｉｕｍＬ．）的一年生或多年
生优良牧草，也是优良的草坪地被和水土保持植物。
１９６８年，Ｋｅｎｄａｌ［１］最早开展了红三叶的试管苗研究。
收稿日期：２０１１－０８－１２；修回日期：２０１１－１０－１１
基金项目：内蒙古科技厅重大项目（２０１０１４０５）资助
作者简介：高雪芹（１９８４－），女，甘肃白银市人，博士研究生，研究方向为牧草种质资源与育种，Ｅ－ｍａｉｌ：ｑｉｎｑｉｎ＿８０３＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ；＊通信作者
Ａｕｔｈｏｒ　ｆｏｒ　ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅ，Ｅ－ｍａｉｌ：ｊｗ６２＠１６３．ｃｏｍ；ｃｓｇｒａｓｓ＠ｐｕｂｌｉｃ．ｈｈ．ｎｍ．ｃｎ
草　地　学　报 第２０卷
究。１９７９年Ｂｅａｃｈ和Ｓｍｉｔｈ［２］建立了详细的红三叶
植株再生体系。１９８２年Ｐａｒｒｏｔ和Ｃｏｌｉｎｓ［３］成功地
从愈伤途径和生长点直接再生途径得到了红三叶草
的再生植株。１９９４年Ｒａｄｉｏｎｅｎｋｏ等［４］用原生质体
培养得到了红三叶草的再生植株，为三叶草再生开
辟了一条新途径。２００４年Ｃａｒｒｉｌｏ等［５］优化了红三
叶器官直接发成条件。在国内，孟玉玲［６］于１９９６年
开展了红三叶的组织培养研究，愈伤组织分化苗时
间长且再生率也较低，仅为８％～１０％。２００８年，厚
彦明等［７］报道了岷山红三叶愈伤组织诱导和再生的
研究。尽管已有红三叶再生体系的研究报道，但是
基因型在植株再生中的重要作用已得到许多学者的
肯定，不同品种再生能力存在着显著遗传差异，红三
叶再生是属于基因依赖型的［８～１０］，同一植株不同部
位在离体培养中的反应也不同［１１，１２］，没有一种“万
能”的培养基完全适用于每个三叶草品种。红三叶
新品系是以内蒙古大兴安岭地区自然分布的红三叶
为材料，经过１０多年栽培驯化和系统选育而形成的
抗寒型新品系，是内蒙古农业大学三叶草种质创新
的重点研究对象。在已完成的红三叶新品系无菌苗
培养体系优化的基础上［１３］，本文从外植体选择以及
愈伤组织诱导、分化和生根培养等方面做了较详尽
的研究，旨在建立一个高效稳定的组织培养体系，为
下一步田间选择育种、细胞学和分子学育种相结合
的育种进程打下坚实的基础。
１　材料和方法
１．１　试验材料
红三叶新品系种子来源于内蒙古农业大学红三
叶新品系原种繁殖田，于２００８年８月至９月采收。
１．２　试验方法
１．２．１　无菌苗培养　挑选饱满、大小均匀的种子，
用砂皮纸磨擦破除种子硬实后，纱布包裹，自来水冲
洗约２０ｍｉｎ，用７５％的乙醇浸泡０．５～１ｍｉｎ，０．１％
ＨｇＣｌ２ 溶液浸泡１０ｍｉｎ，取出后无菌水冲洗４～５
次，吸干表面残留液体。种子植入１．５％蔗糖＋
０．７％琼脂＋１／４ＭＳ无激素培养基中，ｐＨ＝６．０，放
在培养架上进行无菌苗培养。
１．２．２　愈伤组织的诱导　子叶和下胚轴取自第８ｄ
后的无菌苗，叶片、叶柄及根取自第２０ｄ后的无菌
苗。下胚轴、叶柄、叶片和根切成０．５ｃｍ左右的小
段，子叶切成两半，分别接种于 ＭＳ＋３％蔗糖＋
０．７％琼脂的基本培养基上，激素配比如表１所示，
本试验中所有培养基ｐＨ＝６。每瓶７个外植体，共
７瓶，每个处理重复３次。置于 ＧＸＺ　２６８Ｂ培养箱
中，（２５±１）℃温度下暗培养。愈伤组织诱导率（％）
＝愈伤组织块数／接种外植体总数×１００％。
表１　愈伤组织的诱导因素水平及处理
Ｔａｂｌｅ　１　Ｃａｌｕｓ　ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒｓ，ｌｅｖｅｌｓ　ａｎｄ　ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ
因素水平／ｍｇ·Ｌ－１
Ｆａｃｔｏｒ　ａｎｄ　ｌｅｖｅｌ
（２，４－Ｄ）１ （２，４－Ｄ）２ （２，４－Ｄ）３
（６－ＢＡ）０ Ｙ１ Ｙ４ Ｙ７
（６－ＢＡ）０．２５ Ｙ２ Ｙ５ Ｙ８
（６－ＢＡ）０．５ Ｙ３ Ｙ６ Ｙ９
１．２．３　愈伤组织的继代　初生愈伤组织经继代培
养，使部分愈伤少、质量差的愈伤组织，转变为淡黄
绿色、质地疏松、嵌有绿点的胚性愈伤组织。愈伤组
织继代接种于 ＭＳ＋３％蔗糖＋０．７％琼脂的基本培
养基，因素及水平处理如正交表２所示，９个处理，
每个处理重复３次，继代周期为２０ｄ。胚性愈伤组
织改造率（％）＝胚性愈伤组织块数／接入的愈伤组
织总块数×１００％。
１．２．４　愈伤组织的分化　取疏松颗粒状淡黄（绿）
色胚性愈伤组织接种于分化培养基上，如表３所示，
观察愈伤组织的分化情况并统计出现茎芽分化的愈
伤个数。愈伤组织分化率（％）＝分化出茎芽的块
数／接入的愈伤组织总块数×１００％。
１．２．５　分化苗的增殖培养　 将＞２ｃｍ左右的再
生苗剥离后，剩余分化出芽的愈伤组织块进一步进
行继代培养，以提高分化苗的数量和质量及再生效
率，培养基激素配比如表４所示。
１．２．６　再生苗的生根　取苗高＞２ｃｍ的再生苗，
彻底剥离底部愈伤，接种到生根培养基上。生根培
养基如表 ５ 所示。Ｇ８ 接种前将再生苗在 ５０
ｍｇ·Ｌ－１　ＩＢＡ中浸泡１ｈ。观察开始生根时间和根
的生长形态，计算生根率。生根率（％）＝生根苗数／
接种再生苗总数×１００％。
１．３　数据处理
采用Ｅｘｃｅｌ　２００３和ＳＡＳ　９．０进行数据统计和
方差分析。
２　结果与分析
２．１　不同外植体愈伤组织诱导
各外植体在不同培养上脱分化形成的愈伤组织
０６１
第１期 高雪芹等：红三叶新品系组织培养和植株再生
结果如图１所示。下胚轴和叶柄极易脱化形成白色
半透明愈伤组织，接种３ｄ就明显膨大，７～１０ｄ在
切口端形成愈伤组织，１５～２０ｄ完成出愈。子叶、
叶片和根段切块脱分化要比下胚轴和叶柄脱分化启
动慢，第５ｄ才开始明显膨大，９～１２ｄ形成愈伤组
织，２５ｄ后完成出愈。单纯使用激素２，４－Ｄ的培养
基Ｙ１，Ｙ４和Ｙ７上，不同外植体诱导出的愈伤组织
均水渍化，稀糊状不成形，且愈伤量少，生长缓慢愈
伤率低。下胚轴和叶柄在０．２～０．５ｍｇ·Ｌ－１　６－ＢＡ
＋１～３ｍｇ·Ｌ－１　２，４－Ｄ范围内出愈率都很高，且生
长良好。子叶脱分化最佳激素配比为０．５ｍｇ·Ｌ－１
６－ＢＡ＋１～３ｍｇ·Ｌ－１　２，４－Ｄ，叶片和根段脱分化最
佳激素范围是０．５ｍｇ·Ｌ－１　６－ＢＡ＋１～２ｍｇ·Ｌ－１
２，４－Ｄ。
图１　不同外植体在不同培养基上的出愈率
Ｆｉｇ．１　Ｃａｌｕｓ　ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　ｒａｔｅ　ｏｆ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｅｘｐｌａｎｔｓ　ｉｎ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｍｅｄｉａ
２．２　愈伤组织的继代
初生愈伤组织经一次继代培养后明显质量提
高、体积增大，形成表面突起、有绿色内核的胚性愈
伤组织。如表２显示，６－ＢＡ能提高胚性愈伤诱导率
和增加愈伤褐化，不添加６－ＢＡ激素的Ｊ１，Ｊ４和Ｊ７
处理下胚性愈伤诱导率为０％，褐化也为０％。未添
加２，４－Ｄ的Ｊ２和Ｊ３处理，胚性愈伤组织诱导率在
３６．７３％～４０．１４％之间，但愈伤体积增大不明显，可
见２，４－Ｄ比ＮＡＡ更有利于愈伤组织的增长。Ｊ８处
理下愈伤块大，且胚性愈伤组织诱导率最高，达到
４８．３０％，如图２所示，最适合初生愈伤组织继代
培养。
表２　愈伤组织生长和胚性愈伤组织的改造
Ｔａｂｌｅ　２　ｃａｌｕｓ　ｇｒｏｗｔｈ　ａｎｄ　ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ　ｃａｌｕｓ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ
培养基编号
Ｎｏ．
２，４－Ｄ
／ｍｇ·Ｌ－１
６－ＢＡ
／ｍｇ·Ｌ－１
ＮＡＡ
／ｍｇ·Ｌ－１
胚性愈伤诱导率／％
Ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ　ｃａｌｕｓ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｒａｔｅ
褐化率／％
Ｂｒｏｗｎｉｎｇ　ｒａｔｅ
Ｊ１　 ０　 ０　 ０　 ０．００ｅ ０．００ｄ
Ｊ２　 ０　 ０．５　 ０．２　 ３６．７３ｃ １０．２０ａｂ
Ｊ３　 ０　 ０．７５　 ０．５　 ４０．１４ｂｃ　 １２．２４ａ
Ｊ４　 ０．５　 ０　 ０．２　 ０．００ｅ ０．００ｄ
Ｊ５　 ０．５　 ０．５　 ０．５　 ３８．７８ｃ １１．５６ａ
Ｊ６　 ０．５　 ０．７５　 ０　 ２６．５３ｄ ９．５２ａｂ
Ｊ７　 １　 ０　 ０．５　 ０．００ｅ ０．００ｄ
Ｊ８　 １　 ０．５　 ０　 ４８．３０ａ ８．１６ｂ
Ｊ９　 １　 ０．７５　 ０．２　 ４３．５４ｂ ４．０８ｃ
　　注：同列不同小写字母间差异显著（Ｐ＜０．０５）。下同
Ｎｏｔｅ：Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｌｅｔｔｅｒｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｓａｍｅ　ｃｏｌｕｍｎ　ｉｎｄｉｃａｔｅ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ　ａｔ　ｔｈｅ　０．０５ｌｅｖｅｌ．Ｔｈｅ　ｓａｍｅ　ａｓ　ｂｅｌｏｗ
２．３　不同激素配比对愈伤组织分化率和褐化率的
影响
愈伤组织分化结果如表３所示，分化率最高为
Ｆ８处理０．７５ｍｇ·Ｌ－１　６－ＢＡ＋０．５ｍｇ·Ｌ－１　ＮＡＡ，
分化率最高为１６．６７％（图３）。６－ＢＡ浓度低于０．５
ｍｇ·Ｌ－１时分化率明显降低，升至１．５ｍｇ·Ｌ－１时
分化率为１２．２４％，但没有持续升高的趋势，而褐化
率增加到９３．３３％。红三叶分化过程中褐化率较高
的原因一方面是随６－ＢＡ浓度的增加褐化率呈上升
趋势，另一方面可能是由于红三叶本身含较多的多
１６１
草　地　学　报 第２０卷
酚氧化酶所致。处理Ｆ１２，Ｆ１３和Ｆ１４中，ＫＴ 浓度
为０．５～１ｍｇ·Ｌ－１，ＮＡＡ 浓度为０．２５～０．７５
ｍｇ·Ｌ－１，分化率为８．５６％～１０．６７％，说明细胞分
裂素６－ＢＡ比 ＫＴ效果稍好一些。处理Ｆ８比 Ｆ１６
分化率高，说明６－ＢＡ与ＮＡＡ组合比６－ＢＡ与ＩＢＡ
组合更有利于胚性愈伤组织的分化。
表３　不同激素配比对愈伤组织分化的影响
Ｔａｂｌｅ　３　Ｃａｌｕｓ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｒａｔｅ　ｉｎ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｈｏｒｍｏｎｅ　ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ
处理
Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ
６－ＢＡ
／ｍｇ·Ｌ－１
ＫＴ
／ｍｇ·Ｌ－１
ＮＡＡ
／ｍｇ·Ｌ－１
ＩＢＡ
／ｍｇ·Ｌ－１
愈伤组织块数
Ｎｕｍｂｅｒ　ｏｆ　ｃａｌｕｓ
分化率／％
Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｒａｔｅ
褐化率／％
Ｂｒｏｗｎｉｎｇ　ｒａｔｅ
Ｆ１　 ０．１　 ０　 ０　 ０　 ４９　 ０．００ｈ　 ６．１２ｉ
Ｆ２　 ０．１　 ０　 ０．０５　 ０　 ４９　 ０．０６ｈ　 １０．２０ｈｉ
Ｆ３　 ０．１　 ０　 ０　 ０．０５　 ４９　 ０．００ｈ　 １２．２４ｈｉ
Ｆ４　 ０．１　 ０　 ０．０５　 ０．０５　 ４９　 ０．００ｈ　 １６．２９ｈ
Ｆ５　 ０．２　 ０　 ０．１　 ０　 ４９　 ４．０８ｆｇ　 ２０．４１ｈ
Ｆ６　 ０．２　 ０　 ０　 ０．１　 ４９　 ２．０４ｇｈ　 ２８．５７ｇ
Ｆ７　 ０．５　 ０　 ０．２５　 ０　 ４９　 １４．００ａｂ　 ５３．０６ｆ
Ｆ８　 ０．７５　 ０　 ０．５　 ０　 ４９　 １６．６７ａ ７７．５５ｃｄ
Ｆ９　 １　 ０　 ０．７５　 ０　 ４９　 １０．２０ｃ　 ８６．６７ａｂ
Ｆ１０　 １．５　 ０　 １　 ０　 ４９　 １２．２４ｂｃ　 ９３．３３ａ
Ｆ１１　 １　 ０　 ０．５　 ０．２５　 ４９　 ７．３３ｄｅ　 ８５．００ａｂｃ
Ｆ１２　 ０　 １　 ０．７５　 ０　 ４９　 ８．５６ｃｄ　 ７８．３３ｂｃｄ
Ｆ１３　 ０　 ０．７５　 ０．５　 ０　 ４９　 １０．６７ｃ　 ７２．６７ｄｅ
Ｆ１４　 ０　 ０．５　 ０．２５　 ０　 ４９　 ９．３３ｃｄ　 ６６．３３ｅ
Ｆ１５　 ０　 ０．７５　 ０　 ０．５　 ４９　 ９．３３ｃｄ　 ７０．６７ｄｅ
Ｆ１６　 ０．７５　 ０　 ０　 ０．５　 ４９　 ６．１２ｅｆ　 ７１．００ｄｅ
２．４　分化苗的继代增殖培养
由表４可知，单一使用生长素ＮＡＡ或ＩＢＡ的
Ｚ１和Ｚ２处理，苗长势好但不利于苗的分化增殖，而
且会生根。单独添加分裂素６－ＢＡ的Ｚ６处理，苗分
化数增多，但没有生长素来促进生长，苗小且黄弱，
不利于下一步生根培养。ＮＡＡ和６－ＢＡ都为０．５
ｍｇ·Ｌ－１的Ｚ３处理，生长一般，分化也少。添加
２，４－Ｄ对分化苗的继代增殖影响不大。Ｚ４处理，即
１ｍｇ·Ｌ－１　ＩＢＡ＋０．５ｍｇ·Ｌ－１　６－ＢＡ时，茎芽大量
分化，长势好，几乎铺满三角瓶，每个带芽愈伤块分
化出新苗５～１０个，生长良好（图４）。
表４　分化苗的增殖培养
Ｔａｂｌｅ　４　Ｔｈｅ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｏｆ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ　ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ
处理
Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ
６－ＢＡ
／ｍｇ·Ｌ－１
ＮＡＡ
／ｍｇ·Ｌ－１
ＩＢＡ
／ｍｇ·Ｌ－１
２，４－Ｄ
／ｍｇ·Ｌ－１
分化苗数／块
Ｎｕｍｂｅｒ　ｏｆ　ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ　ｐｅｒ　ｂｌｏｃｋ
生长状况
Ｇｒｏｗｔｈ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ
Ｚ１　 ０　 ０　 ０．５　 ０　 ３～５ 茎芽长势良好，部分生根
Ｚ２　 ０　 ０．５　 ０　 ０　 ２～４ 茎芽长势良好，部分生根
Ｚ３　 ０．５　 ０．５　 ０　 ０　 １～２ 茎芽长势一般，分化极少
Ｚ４　 ０．５　 ０　 １　 ０　 ５～１０ 大量分化，几乎铺满三角瓶
Ｚ５　 １　 ０．３　 ０　 ０．３　 １～２ 茎芽长势一般，分化极少
Ｚ６　 ２　 ０　 ０　 ０　 ５～１５ 茎芽大量分化，但苗小，偏黄
２．５　不同浓度ＮＡＡ和ＩＢＡ处理下红三叶再生苗
生根率差异
试验表明，添加ＮＡＡ或ＩＢＡ的培养基比不添
加激素的 ＭＳ和１／２ＭＳ，初生根时间被延迟。ＮＡＡ
和ＩＢＡ有利于根系的生长，比不添加激素的 ＭＳ和
１／２ＭＳ的主根更粗壮，侧根更发达。Ｇ３处理下生
根率要高于Ｇ４处理，ＩＢＡ比ＮＡＡ更有利于三叶草
的生根，随着ＩＢＡ浓度的加大生根率没有提高，ＩＢＡ
浓度＞０．７５ｍｇ·Ｌ－１时长出的根系发黑，移栽后不
易成活，出现ＩＢＡ对根系生长毒害现象，ＩＢＡ生根
最大极限浓度为０．７５ｍｇ·Ｌ－１，生根率为５５％。
在５０ｍｇ·Ｌ－１高浓度ＩＢＡ中浸泡再生苗１ｈ后，经
无菌水冲洗后植入０．５ｍｇ·Ｌ－１　ＩＢＡ的 ＭＳ中其
生根率达８０％（图５，图６，图７）。开瓶炼苗５～７ｄ
后，移入细沙∶细土＝１∶１的基质中成活率达
７４．４％。
２６１
第１期 高雪芹等：红三叶新品系组织培养和植株再生
表５　再生苗的生根率
Ｔａｂｌｅ　５　Ｒｏｏｔｉｎｇ　ｒａｔｅ　ｏｆ　ｒｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ　ｐｌａｎｔｓ
处理
Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ
培养基
Ｍｅｄｉｕｍ
ＮＡＡ
／ｍｇ·Ｌ－１
ＩＢＡ
／ｍｇ·Ｌ－１
初生根时间／ｄ
Ｉｎｉｔｉａｌ　ｒｏｏｔｉｎｇ　ｔｉｍｅ
生根率／％
Ｒｏｏｔｉｎｇ　ｒａｔｅ
根形态
Ｒｏｏｔ　ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ
Ｇ１ ＭＳ　 ０　 ０　 ５　 ２１．４３ｄ 根细长，白色
Ｇ２　 １／２ＭＳ　 ０　 ０　 ５　 ３１．２５ｃｄ 根细长，白色
Ｇ３ ＭＳ　 ０．５　 ０　 ８　 ２８．５７ｃｄ 主根粗，侧根发达，黄白色
Ｇ４ ＭＳ　 ０　 ０．５　 ８　 ３７．５０ｃ 主根粗，侧根发达，黄绿色
Ｇ５ ＭＳ　 ０　 ０．７５　 ８　 ５５．００ｂ 主根粗，侧根发达，灰褐色
Ｇ６ ＭＳ　 ０　 １　 ８　 ５０．００ｂ 主根粗，侧根发达，灰褐色
Ｇ７ ＭＳ　 ０　 １．５　 ８　 ５０．００ｂ 主根粗，侧根发达，黑褐色
Ｇ８ ＭＳ　 ０　 ０．５　 ７　 ８０．００ａ 主根粗，侧根发达，黄绿色
　　注：Ｇ８接种前将再生苗在５０ｍｇ·Ｌ－１　ＩＢＡ中浸泡１ｈ
Ｎｏｔｅ：Ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ　ｗｅｒｅ　ｉｍｍｅｒｓｅｄ　ｉｎ　５０ｍｇ·Ｌ－１　ＩＢＡ　ｆｏｒ　１ｈｂｅｆｏｒｅ　ｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｉｎ　Ｇ８
图２　Ｊ８处理诱导的胚性愈伤组织；图３　Ｆ８处理愈伤组织分化出茎芽；图４　茎芽增殖培养；
图５　待生根的再生苗；图６　生根的再生苗；图７　诱导出的根
Ｆｉｇ．２　Ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ　ｃａｌｕｓ　ａｔ　０．５ｍｇ·Ｌ－１　６－ＢＡ，１ｍｇ·Ｌ－１　２，４－Ｄ；
Ｆｉｇ．３　Ｃａｌｕｓ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ａｔ　０．７５ｍｇ·Ｌ－１　６－ＢＡ，０．５ｍｇ·Ｌ－１　ＮＡＡ
Ｆｉｇ．４　Ｔｈｅ　ｍｕｌｔｉｐｌｉｃａｔｅｄ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｏｆ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ　ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ；Ｆｉｇ．５　Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ　ｐｌａｎｔｓ　ｂｅｆｏｒｅ　ｒｏｏｔｉｎｇ；
Ｆｉｇ．６　Ｈａｄ　ｔａｋｅｎ　ｒｏｏｔ　ｐｌａｎｔｓ　ａｎｄ　ｒｏｏｔｓ；Ｆｉｇ．７　Ｉｎｄｕｃｅｄ　ｒｏｏｔｓ
３　讨论与结论
３．１　愈伤组织诱导
２，４－Ｄ在红三叶愈伤诱导中起着重要的作用，
单一使用时诱导效果不佳，和适当浓度的细胞分裂
素（ＢＡＰ，６－ＢＡ，ＫＴ）配合使用，可促进愈伤组织的
形成。孟玉玲等［６］和厚彦明等［７］研究表明０．５
ｍｇ·Ｌ－１　６－ＢＡ＋２ｍｇ·Ｌ－１　２，４－Ｄ为三叶草及岷
山红三叶愈伤诱导最适激素配比。红三叶新品系子
叶、下胚轴、叶柄、叶片及根在 ＭＳ＋０．２～０．５
ｍｇ·Ｌ－１　６－ＢＡ＋１～３ｍｇ·Ｌ－１　２，４－Ｄ条件下都极
易诱导出愈伤组织。下胚轴、叶柄愈伤诱导最容易，
叶片愈伤诱导最困难，取幼嫩叶片诱导率明显提高。
以８ｄ龄无菌苗为取材对象，每个无菌苗可产生外
植体个数为子叶４个，下胚轴１～２个，而以２０～２５
ｄ龄无菌苗为取材对象，叶柄１５～２０个，嫩叶片６～
１２个，根５～１０个，明显单个无菌苗利用充分而节
约材料，产生的外植体数多。所以单从愈伤组织诱
导考虑以２０～２５ｄ龄无菌苗为取材对象，以叶柄、
叶片和根为外植体是愈伤组织诱导的最佳选择。
３６１
草　地　学　报 第２０卷
３．２　愈伤组织继代培养
邓百万等［１４］认为２，４－Ｄ的减少使愈伤组织极
易出现绿化，不能继代保存，０．５ｍｇ·Ｌ－１　２，４－Ｄ＋
０．５ｍｇ·Ｌ－１　６－ＢＡ使苏联苜蓿（Ｍｅｄｉｃａｇｏ　ｓａｔｉｖａ
Ｌ．）、罗默苜蓿、扁蓿豆（Ｔｒｉｇｏｎｅｌｌａ　ｒｕｔｈｅｎｉｃａ　Ｌ．）、
白三叶草（Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ　ｒｅｐｅｎ　Ｌ．）、红三叶继代２～３
次仍能很好地保持其胚性能力。愈伤组织连续继代
培养，即要有快速的增殖力，又要保持器官发生的潜
力，不适宜的激素种类及浓度组合，愈伤组织很容易
失去形态发生的潜力。本试验继代培养不仅考虑继
代保存，更侧重胚性愈伤组织的改造，６－ＢＡ能提高
胚性愈伤诱导率，红三叶新品系初生愈伤组织经
０．５ｍｇ·Ｌ－１　６－ＢＡ＋１ｍｇ·Ｌ－１　２，４－Ｄ一次继代培
养后明显质量提高、体积增大，形成表面突起有绿色
内核的胚性愈伤组织，诱导率达４８．３０％。持续高
浓度生长素和分裂素加重褐化，可能引起愈伤组织
细胞老化死亡，因此在愈伤继代培养中，降低激素的
诱导培养基有利于愈伤的继代。
３．３　愈伤组织的分化
愈伤组织分化出茎芽，是组织培养的关键，也是
决定再生能力和效率的关键。高浓度的细胞分裂素
和低浓度的生长素配比适宜诱导芽的分化，细胞分
裂素６－ＢＡ能促进细胞分化，添加２，４－Ｄ对愈伤分
化成苗不利［６，１５，１６］。因此，分化处理未添加２，４－Ｄ，
结果表明，分化最优培养基为０．７５ｍｇ·Ｌ－１　６－ＢＡ
＋０．５ｍｇ·Ｌ－１　ＮＡＡ，最高分化率为１６．６７％，显著
高于孟玉玲［６］报道的８％分化率。大部分红三叶组
织培养研究显示［６，１７，１８］，它们的再生能力不强，因
此，红三叶新品系分化率总体较低是可以理解的。
Ｗａｎｇ和 Ｈｏｌ［１９］１９８８年研究中同样也得出了红三
叶草再生率低的结论，并推断红三叶草的再生能力
受到遗传机制的控制。１９９３年 Ｑｕｅｓｅｎｂｅｒｒｙ和
Ｓｍｉｔｈ［１０］利用４代轮回选择最终将红三叶叶柄再
生效率从４％提高到７２％，显示出愈伤诱导再生效
率的可遗传特性。也有研究认为，高纬度红三叶品
种再生性明显强于纬度较低的品种［１７，１８］。可见再
生效率的高低受基因型、生境和培养条件等多因素
的限制，单纯改善培养条件，优化分化体系并不一定
能得到很高的分化率。利用群体间和群体内的遗传
变异来筛选高分化率的材料，轮回选择证明是比较
有效的方法之一。
３．４　分化苗的增殖培养
Ｚ４处理中ＩＢＡ浓度为１ｍｇ·Ｌ－１，６－ＢＡ浓度
为０．５ｍｇ·Ｌ－１时，红三叶新品系带芽愈伤块大量
分化出苗几乎铺满三角瓶，每个分化芽愈伤块分化
出新苗５～１０个，且生长很好，是分化苗增殖的最适
培养基。分裂素大于生长素时，利于芽的分化，生长
素大于分裂素利于分化芽的生长，单一使用生长素
ＮＡＡ或ＩＢＡ时苗长势好但分化苗少且易生根。单
独添加分裂素６－ＢＡ时苗分化数增多，但没有生长
素促进生长，苗小且黄弱，营养供给不足。红三叶受
基因型的限制其分化率并不高，但如果将分化出茎
芽的愈伤组织块进行多次继代培养，就能获得大量
的分化苗，显然能提高三叶草再生效率，一定程度上
弥补分化率较低的缺陷。
３．５　生根
大多数物种诱导生根需要适当的生长素，其中
最常用的是ＩＢＡ和 ＮＡＡ，也有部分不需添加任何
激素在 ＭＳ，１／２ＭＳ或１／４ＭＳ上直接生根的。如
孟玉玲［６］在０．１ｍｇ·Ｌ－１　ＮＡＡ或无激素培养基中
红三叶２周形成发达根系，厚彦明等［７］研究表明岷
山红三叶在１／２ＭＳ生根率最高。本试验将再生苗
在５０ｍｇ·Ｌ－１高浓度ＩＢＡ中浸泡再生苗基部１ｈ，
后植入０．５ｍｇ·Ｌ－１　ＩＢＡ 的 ＭＳ中生根率可达
８０％，显著高于前２位的报道，为最佳选择。
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欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍
）
（上接１５１页）
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（责任编辑　邵新庆）
５６１