全 文 ：文章编号: 1007-0435( 2003) 01-0027-06
RAPD 技术在苜蓿耐盐遗传育种中的应用
杨青川1, 韩建国2
( 1. 中国农业科学院畜牧研究所, 北京 100094; 2. 中国农业大学动物科技学院草地研究所, 北京 100094)
摘要:以中苜一号苜蓿和繁盐苜蓿大西洋为材料,应用 RAPD 技术, 对 14 组 280 条随机引物进行筛选,结果
表明: OPW 三条引物、OPV 三条引物、OPM 四条引物、OPT 五条引物、OPQ 五条引物、OPZ 三条引物、OPP
三条引物、OPK 三条引物、OPL 一条引物、OPO 七三条引物, 共 37 条都呆作炎 DNA 多态性引物, 为耐盐苜蓿
的耐盐基因分子遗传标记的研究奠定了基础。
关键词:苜蓿; RAPD; 耐盐育种
中图分类号: Q943; S541　　　文献标识码: A
A Study on Using RAPD in Alfalfa Salt Tolerant Breeding
Yang Qing-chuan
1
, HAN Jian-guo
2
( 1. Instit ut e of Animal Science , CAAS, Beijing 100094, China;
2. Institute of G rassland Science, China Agicultura l Univ ersity, Beijing 100094, China)
Abstract: The salt tolerant alfalfa Zhongmu No . 1 and the salt sensit iv e alfalfa At lant ic o cean are used as
materials for ex t ract ing DNA, and polymorphic DNA molecular markers of 280 pr imer s ar e selected
thr ough RAPD technolog y. T hirty-seven pr imer s of polymorphic DNA have been found: OPW5、OPW8、
OPW9、OPV4、OPV 5、OPV 9、OPM7、OPM8、OPM14、OPM18、OPT 2、OPT 3、OPT 9、OPT11、OPT19、
OPQ3、OPQ 5、OPQ10、OPQ 11、OPQ19、OPZ3、OPZ6、OPZ9、OPP5、OPP8、OPP20、OPK3、OPK8、OPK14、
OPL13、OPO1、OPO2、OPO6、OPO9、OPO13、OPO16、OPO20. The study establ ishes for the r esearch into
the salt tolerant mo lecular genet ic marker o f alfalfa.
Key words : Alfalfa; RAPD; Salt tolerant br eeding
前言
　　随着分子生物技术的飞速发展,尤其是分子标
记的问世在植物遗传分析中掀起了一场革命,并为
遗传学家,生理学家,农学家和育种学家提供了确定
植物重要性状的有用工具。
　　在了解植物耐盐性遗传基础的同时, 相信也会
大大地推进育种选育工作。如能用 RAPD( Random
Amplified Polymor phic DNAs) , SSR、AFLP( Amp-
l if ied Fragments Length Polymorphism )等分子标
记技术找到与耐盐主效基因连锁的分子遗传标记,
将会为苜蓿耐盐基因的克隆或 QTL(数量性状点) ,
分子标记辅助育种奠定基础, 克服了传统育种的盲
目性。具有不受环境条件和植物生长发育阶段影响的
优点, 且检测直接快速方便。这对于我国加快苜蓿耐盐
育种进程具有极其重要的科学意义。而耐盐苜蓿的育
成,在我国大面积的盐碱地将具有广阔的应用前景。
有关苜蓿耐盐遗传基础及分子标记的研究, 国
内外都有一些报道: Bouton( 1997) [ 1]等定位了苜蓿
收稿日期: 2003-01-28; 修回日期: 2003-02-28
基金项目:国家高技术研究发展计划( 863计划)项目( 2002AA241101)
作者简介:杨青川( 1966-) ,男,副研究员,中国农科院研究生院获硕士学位,现为中国农业大学在读博士,一直从事牧草常规育种与生物技
术育种研究,发表论文 30余篇
第 11卷　第 1期
　Vo l. 11　　No. 1
草　地　学　报
ACT A AGRESTIA SIN ICA
　2003 年　3月
March 　2003
耐铝数量性状位点( QT L)。在苜蓿染色体上有 4个
位点与耐铝有关, 其中一个位点起主效作用[ 1, 2]。另
有报道, PA 9基因与富含脯氨酸的细胞壁蛋白有
关,在苜蓿耐盐性、脯氨酸积累、抗氧化酶和谷胱甘
肽还原酶显著增加方面起重要作用。Winicov 和
shirzadegan 在耐盐苜蓿中已发现有两种耐盐基因
PA 18和 MsPRP2。测序后发现 M sPRP2是一个含
有 475 bp的基因片段,该基因同紫花苜蓿富含脯氨
酸的细胞壁蛋白转录后盐调节有关[ 3, 4]。Petrusa、
Winicov
[ 3～5] ( 1997年)在苜蓿 cDNA 文库中分离出
PUM90-1、PUM90-2、PUM91-4三个脱落酸诱导基
因, 这三个基因都与盐胁迫有关 [ 5]。1996 年Wini-
cov、Krishnan[ 6]发现,细胞中 mRNA 的积累与稳定
程度对苜蓿耐盐、基因转录调节有影响; 细胞中
mRNA 的增加, 可以使形成核与叶绿体的编码基因
表达能力增强,使耐盐苜蓿细胞中叶绿体的内嵴比
敏盐苜蓿的多出 2. 5～4. 5 个; 另外,在耐盐苜蓿的
细胞核中, 参与光合作用的基因 rbcs Cab1 Cab4都
具有较高的转录水平。通过筛选耐盐苜蓿的 cDNA
文库,发现该文库染色体上存在一段锌结合区域,其
上的 Cys4和 Cys3基因可编码一种 Alf inl 蛋白[ 7] ,
该 Alfinl蛋白的mRNA 在苜蓿根中发现, 在盐诱导
下耐盐苜蓿中 Alf inl蛋白的 mRNA 含量更高一些;
值得注意的是 Alf inl蛋白同 M sPRP2的启动子的
三个片段结合, 因此, Alf inl蛋白可能在苜蓿根部的
M sPRP2调节表达方面起重要作用,并对植物是否
耐盐有决定性贡献 [ 8]。
本文以 RAPD 技术对中国农业科学院畜牧研
究所培育出的中苜一号耐盐苜蓿及从大西洋苜蓿筛
选出的敏盐苜蓿材料进行了 RAPD多态性标记的
筛选, 为下一步应用 BSA(分离群体组群分析法)法
确定苜蓿耐盐分子遗传标记奠定基础,在耐盐苜蓿
中筛选出耐盐的分子遗传标记旨在建立快速、准确
的耐盐鉴定方法,同时也为利用该技术对苜蓿进行
耐盐分子标记辅助育种提供理论指导及新技术手
段,进而加速苜蓿的耐盐育种进程[ 9]。
1　试验材料与方法
1. 1　试验材料
本试验在引物的初选过程中, 所用的试验材料
为“中苜一号 Medicago sativ a L. cv . Zhongmu
No . 1”、“大西洋 Med icago sativ a L. cv. At lantic o-
cean”二个苜蓿品种。中苜一号为中国农业科学院培
育的耐盐苜蓿新品种;大西洋敏盐苜蓿材料是从大
西洋苜蓿品种中筛选出来的(首先从 69个苜蓿品种
中筛选出敏盐苜蓿品种大西洋,而后盆栽育苗,在苗
期进行浓度为 0. 3%的 NaCl盐胁迫, 胁迫后, 把表
现出明显敏盐症状(如叶片变黄、萎蔫等)的单株立
即移出予以抢救, 隔离种植,单独收种, 供进行了三
代选择而得到的材料)。
试验中所用 14 组 280条引物由 OPEROR 公
司提供,分别为 OPI、OPK、OPL、OPM、OPO、OPP、
OPQ、OPR、OPS、OPT、OPU、OPV、OPW、OPZ 组
的引物; dNT P、TaqDNA 聚合酶( 5 U /LL, 加拿大
Biostar 公司)、1 kbDNA Ladder、100 bp DNA Lad-
der等生物试剂分别购于北京鼎国、华绿渊等公司。
1. 2　试验方法
1. 2. 1　DNA 提取　本实验采用 CTAB ( cety1
t rimethy1 ammonium bromide 十六烷基三甲基溴
化铵)法, 从供试材料的叶片提取 DNA。
1. 2. 1. 1　取叶片 3小叶,放入液氮致冷、研磨;
1. 2. 1. 2　加入 65℃的 2×CTAB( 2%CTAB, 2
mol/ L tr is. HCl , 0. 5 mol/ L EDT A, 5 mo l/ L Na-
Cl)提取液 900 LL;
1. 2. 1. 3　65℃水浴 15至 20 m in;
1. 2. 1. 4　冷却后加入 500 LL 氯仿:异戊醇( 24: 1) ;
1. 2. 1. 5　6000～8000转/分下离心 10 min;
1. 2. 1. 6　取上清液,重复 4～5步;
1. 2. 1. 7　取上清液, 加入 1/ 10体积的 3 mol / L 醋
酸钠和等体积的异丙醇, 摇匀至出现絮状沉淀;
1. 2. 1. 8　12 000转/分下离心 5 min,倒掉上清液;
1. 2. 1. 9　用 75%酒精清洗, 室温干燥 1 h 后溶于
T E( 2 mol/ L t ris. HC1 0. 5 mol/ L EDT A)缓冲液保
存备用。
1. 2. 2　DNA组检测
1. 2. 2. 1　DNA 纯度检测　称取琼脂糖 0. 4 g ,溶于
50 mL 电泳缓冲液( 1×TAE)中(制成 0. 8%的琼脂
糖胶) ; 灌胶前加入 4 LL 溴化乙锭( EB) ; 灌胶, 凝
胶; 待测 DNA 样品中加入适量溴酚蓝染色液; 点
样; 1～5 V/ CM 电压下电泳;紫外灯下观察,拍照。
1. 2. 2. 2　DNA 总浓度测定　取 1 LL DNA 样品于
1. 5 mL 扩增管中,加入 99 LL 双蒸水, 对供试材料
28 草　地　学　报 第 11卷
进行 100倍的稀释, 后利用分光光度计对样品分别
进行波长为 260 nm、280 nm、310 nm 三个光密度值
的测定, 以便于 DNA 浓度的计算、纯度比较及
DNA 稀释。DNA 浓度计算公式为:
　　[ dsDNA ] = 50( OD260- OD310 )×稀释倍数
在 DNA 的提取过程中,由于有部分 DNA 也同
时被提取出来, 为了降低 RNA 对试验效果的影响,
要求样品 260 nm 与 280 nm 波长的光密度值之比
应在 1. 8～2. 2之间。
1. 2. 3　DNA 池构建　为了检测出与苜蓿耐盐性状
相关的 RAPD标记,将具有相同表型性状的基因组
DNA 等量地加以混合,构建苜蓿 DNA 池。从中苜
一号、大西洋敏盐材料中,随机选择 20株, 分别提取
DNA ,然后将每一品种 DNA 等量混合,构成 1个耐
盐苜蓿 DNA 池(中苜一号)和一个敏盐苜蓿 DNA
池(大西洋)。
1. 2. 4　RAPD反应体系的建立
1. 2. 4. 1　RAPD反应热程序　RAPD反应热程序
如下:
94℃/ 3′ 94℃/ 15″ 36℃/ 30″ 72℃/ 1′ 72℃/ 10′
45个循环
1. 2. 5　苜蓿耐盐性状 RAPD标记引物筛选
1. 2. 5. 1　引物的初步筛选　利用优化的 RAPD反
应体系及上述反应热程序, 以中苜 1号耐盐苜蓿、大
西洋敏盐苜蓿的 DNA 为材料,对十四组随机引物
( OPI、OPK、OPL、OPM、OPO、OPP、OPQ、OPR、
OPS、OPT、OPU、OPV、OPW、OPZ)进行五轮的筛
选,选出可产生稳定多态性 DNA 的引物。
1. 2. 5. 2　增产物的检验　制作浓度 1. 2%～1. 4%
的琼脂糖凝胶;加入 3 LL 溴酚蓝于扩增产物中,进
行染色;点样;点 1孔 DNA Ladder; 电泳;紫外灯下
观察并记录拍照。
2　结果与分析
2. 1　DNA提取与检测
2. 1. 1　DNA 提取　采用 CTAB 法提取 DNA, 具
有抽提彻底、能有效地去除植物中大量存在的多糖
物质等特点。再结合氯仿、异戊醇混合液对蛋白质等
成分的多次溶解和离心沉降, 使得 DNA 提取液比
较纯净,所得 DNA 产物较理想。
2. 1. 2　DNA 纯度的检测　对所提七株 DNA 进行
纯度检测,结果见图 1。七株苜蓿 DNA 组谱带整齐
一致,整个泳道比较干净,只是在泳道前端有少量小
片段物质存在, 尽管在 DNA 提取过程中已注意到
杂质的去除,但苜蓿中蛋白质含量较高,可能是产生
该结果的原因。
图 1　七株苜蓿 DNA 纯度检测结果
F ig . 1　The detected r esult fo r DNA g roups
o f sev en sing le alfalfa
2. 1. 3　DNA总浓度的测定
对二个苜蓿品种单株的 DNA 混合样, 分别进
行了两个平行样的光密度值测定, 结果见表 4。双链
DNA 平均浓度分别为: 中苜一号 835 Lg / mL、大西
洋610 Lg/ mL、试验中需对中苜一号、大西洋苜蓿二
个 DNA 组分别进行 2倍的稀释,使供试 DNA 浓度
在要求范围内。OD260与OD 280比值在 2. 15～3. 0之
间基本符合RAPD 反应要求。
2. 2　苜蓿耐盐性状 RAPD标记引物的筛选
2. 2. 1　引物的初步筛选
经过五轮的筛选后, 在 280条引物中有 37条引
物可在耐盐苜蓿中苜一号与敏盐大西洋苜蓿产生多
态性差异谱带, 这 37条引物的序列及所产生的谱带
数和特异带数见表 2。在二个苜蓿材料 DNA 池中,
其中 OPW5、OPW8、OPW9、OPV4、OPV5、OPV 9、
OPM7、OPM8、OPM14、OPM18(该引物的排列次
序即为图片中的排列顺序)十条引物产生的 DNA
多态性片段见图 2; OPT 2、OPT 3、OPT9、OPT11、
OPT19、OPQ3、OPQ5、OPQ 10、OPQ 11、OPQ 19 十
条引物产生的 DNA 多态性片段见图 3; OPZ3、
OPZ6、OPZ9、OPP5、OPP8、OPP20、OPK3、OPK8、
OPK14、OPL13十条引物产生的 DNA 多态性片段
29第 1期 杨青川等: RAPD 技术在苜蓿耐盐遗传育种中的应用
见 图 4; OPO1、OPO2、OPO6、OPO9、OPO13、
OPO16、OPO20七条引物产生的 DNA 多态性片段
见图 5。
表 1　各试验材料光密度值及 DNA浓度
T able 1　L ight density and DNA content of experiment mater ials
苜蓿品种
Cult ivar of alfalfa
光密度值 Light den sity value
260 nm 280nm 310nm
[ dsDNA] OD260/OD 280
中苜一号
Med icag o sati va L. cv. Zhongm u No. 1
0. 175 - 0. 079 + 0. 003 850 2. 2
中苜一号
Med icag o sati va L. cv. Zhongm u No. 1
0. 118 - 0. 053 - 0. 001 595 2. 2
大西洋
Med icag o sati va L. cv.At lant ic ocean
0. 131 - 0. 061 + 0. 006 625 2. 2
大西洋
Med icag o sati va L. cv.At lant ic ocean
0. 121 - 0. 055 + 0. 002 595 2. 2
图 2　OPW5、OPW8、OPW9、OPV4、OPV5、OPV9、OPM7、OPM8、OPM14、OPM18十条引物
在二个苜蓿品种间的 DNA 多态性, 1.中苜一号苜蓿 DNA 池　2. 大西洋敏盐苜蓿 DNA池　M 标准分子量
F ig . 2　DNA po lymorphism bet ween tw o alfalfa cultivar s w it h OPW5、OPW8、
OPW9、OPV4、OPV5、OPV9、OPM 7、OPM 8、OPM14、OPM 18 t en pr imer s
图 3　OPT2、OPT3、OPT9、OPT11、OPT19、OPQ3、OPQ5、OPQ10、OPQ11、OPQ19 十条引物在
二个苜蓿品种间的 DNA多态性, 1. 中苜一号苜蓿 DNA池　2.大西洋敏盐苜蓿 DNA 池　M标准分子量
Fig . 3　DNA polymo rphism betw een t wo alfalfa cultiv ars w ith OPT 2、OPT 3、OPT9、OPT 11、
OPT 19、OPQ3、OPQ5、OPQ10、OPQ11、OPQ19 ten pr imer s, 1. DNA Pool of Zhongmu No. 1, 2. DNA Poo l o f A tlant ic ocean
30 草　地　学　报 第 11卷
图 4　OPZ3、OPZ6、OPZ9、OPP5、OPP8、OPP20、OPK3、OPK8、OPK14、OPL13 十条引物在
二个苜蓿品种间的 DNA多态性, 1. 中苜一号苜蓿 DNA池　2.大西洋敏盐苜蓿 DNA 池　M标准分子量
Fig. 4　DNA polymo rphism betw een tw o alfalfa cultivar s with OPZ3、OPZ6、
OPZ9、OPP5、OPP8、OPP20、OPK3、OPK8、OPK14、OPL13 t en pr imer s
图 5　OPO1、OPO2、OPO6、OPO9、OPO13、OPO16、OPO20七条引物在二个苜蓿品种间的
DNA多态性, 1. 中苜一号苜蓿 DNA 池　2.大西洋敏盐苜蓿 DNA 池　M 标准分子量
F ig . 5　DNA po lymorphism betw een tw o alfalfa cultiv ar s w it h OPO1、OPO2、
OPO6、OPO9、OPO13、OPO16、OPO20 seven primers
表 2　在中苜一号和大西洋苜蓿之间产生多态性引物及扩增带数
Table 2　Polymo rphic primers and their amplication bands between Zhongmu No. 1 and A tlantic o cean alfalfa
引物名称
Primer nam e
引物序列
Prim er sequen ce
扩增总带数
Ampl ication bands
亲本间多态性带数
Polymorphic bands
betw een parents
OPK-3 CCAGCT TAGG 5 3
OPK-8 GAACACTGGG 8 2
OPK-14 CCCGCT ACAC 6 2
OPL -13 ACCGCCT GCT 8 1
OPM -7 CCGT GACTCA 3 1
OPM -8 T CTGT TCCCC 4 1
OPM -14 AGGGT CGTT C 5 3
OPM -18 CACCAT CCGT 5 2
31第 1期 杨青川等: RAPD 技术在苜蓿耐盐遗传育种中的应用
　　续表 2
引物名称
Primer nam e
引物序列
Prim er sequen ce
扩增总带数
Ampl ication bands
亲本间多态性带数
Polymorphic bands
betw een parents
OPO-1 GGCACGT AAG 5 2
OPO-2 ACGT AGCGT C 5 1
OPO-6 CCACGGGAAG 4 3
OPO-9 T CCCACGCAA 5 2
OPO-13 GTCA GAGT CC 5 1
OPO-16 T CGGCGGT TC 4 2
OPO-20 ACACACGCT G 5 2
OPP-5 CCCCGGT AAC 6 4
OPP-8 ACATCGCCCA 8 1
OPP-20 GACCCT AGTC 4 1
OPQ-3 GGTCACCTCA 6 2
OPQ-5 CCGCGT CT TG 6 3
OPQ-10 T GT GCCCGAA 7 5
OPQ-11 TCT CCGCAAC 6 2
OPQ-19 GAAGCCCT TG 6 1
OPT -2 GGAGAGACTC 6 2
OPT -3 TCCACTCCTG 8 6
OPT -9 CACCCCT GAG 4 2
OPT -11 TT CCCCGCGA 8 7
OPT -19 GTCCGT AT GG 6 4
OPV-4 CCCCT CACGA 6 2
OPV-5 TCCGAGAGGG 4 3
OPV-9 T GTACCCGTC 4 3
OPW-5 GGCGGAT AAG 7 1
OPW-8 GACT GCCT CT 7 2
OPW-9 GTGACCCAGT 7 2
OPZ-3 CAGCACCGCA 2 1
OPZ-6 GT GCCGT T CA 4 2
OPZ-9 CACCCCA GT C 6 4
总和
Total
205 88
　　经过对 280个引物的分析, 鉴定出 37个具有多
态性的引物, 多态性引物占 13. 2%。这 37个引物共
扩增出 205个位点,平均每个引物扩增 5. 5个位点,
产生的多态性位点占总扩增位点的 42. 9%, DNA
是决定生物性状的遗传物质, 由于 DNA 在某一位
点的变化,如插入、缺失或突变等, 导致物种性状的
多样性。RAPD、AFLP、SSR、RFLP 等技术可以将
DNA 的这些变化检测并表现出来。本实验所检测出
DNA 多态性是中苜一号耐盐苜蓿与大西洋敏盐苜
蓿在遗传物质上的多样性。通过 F2的进一步探测,
为确定与苜蓿耐盐性状紧密连锁的分子遗传标记的
研究奠定了基础。
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