全 文 ：文章编号: 1007-0435( 2006) 02-0124-05
高羊茅耐寒突变体的诱发与鉴定
张彦芹1, 贾炜珑3, 杨丽莉1, 郭先龙1, 吴 2,
胡鸢雷2 , 林忠平2 , 王 淼4 , 许隆君4
( 1. 山西省农业科学院旱地农业研究中心, 太原 030031; 2. 北京大学生命学院, 北京 100871;
3.天津大学理学院,天津 300072; 4.山西大学生科院, 太原 0300061)
摘要: 以高羊茅爱瑞 3号品种(Festuca arundinacea Schred. cv. A ir eaⅢ)为材料,以60Co-r 射线照射种子和分化苗。结果
表明, 在辐射当代选出耐寒突变体 ARF001-12、ARG001-17 和 ARG001-16,经电解质外渗率、自然低温条件下束缚水和
叶绿素含量测定, 其耐寒性明显优于对照 ,叶根比小于对照,单株生物量低于对照, 可作为新的耐寒种质利用; M 0、M 1代
RAPD 分析结果表明, 其 DNA 已发生变异。
关键词: 高羊茅; 辐射诱变; 突变体; 耐寒性
中图分类号: S 812 文献标识码: A
Induction and Identif ication of Cold Tolerance for Festuca Arundinacea
ZHANG Yan-qin
1
, JIA Wei-long
3
, YANG Li-li
1
, GUO Xian-long
1
, WU Qi
2
, HU Yuan-lei
2
,
L IN Zhong-ping
2
, WANG Miao
4
, XU Long-jun
4
( 1. Arid Farming Research Center, Shanxi Academy of Agricul tural S ciences, Taiyuan 030031, Chin a;
2. Life Scien ce College, Beijing University, Beijing , 100871, C hina;
3. Sch ool of science of Tianjin Un ivers ity, T ianj in, 300072;
4. School of Life Science and T echnolog y of S hanxi Univer sity, T aiyuan 030006, China)
Abstract: U sing
60
Co--ray to irradiate dry seeds and dif ferent ial seedl ing of material o f F estuca arundinacea
Schreb Airei III, 3 cold-resistance mutants ( ARF001-12, ARG001-17, and ARG001-16) w ere selected f rom the
irradiated generat ion. The 3 mutants w ith cold-resistance characters ar e apparently bet ter than F . arundinacea
Schreb Airei III in the test of elect rolyte o smo tic rat io under synthetic low temperature, and the content of
bound-w ater and chlorophyll under natur al low temper ature. The testing result of sing le plants biomass and
leaf-ro ot-ratio indicated that the 3 mutants had lower leaf-ro ot-ratio and smaller biomass, w hich w as
conduct iv e to f rigid resistance characters expression. T he results demonst rated these mutants could be used as
new co ld-resistance seeding resources. Furthermore, mutant variat ions w er e found at DNA level through the
RAPD analyzing for M0、M 1 generat ion.
Key words : Festuca ar und inacea Schreb; Induced mutat ion by radiat ion; Mutant ; Co ld tolerance
高羊茅( Festuca arundinacea Schreb. )是重要的
冷季型草坪草,具有耐低温的特征,是培育四季常绿的
首选草坪草种。因此,开展高羊茅耐寒品种选育已受到
林草育种者的关注。培育优异耐寒种质对于解决北方地
区草坪绿期短的问题具有普遍意义。实践表明,辐射诱
变在创造牧草有益突变新种质方面具有重要作用[ 1, 2, 3] ,
已诱变的早熟沙打旺突变体[ 4] ,为牧草新品种选育提供
了丰富的种质资源。草坪草在这方面的研究成果虽有报
道[ 5, 6, 7] ,但多集中于探讨辐射剂量与敏感性研究,对耐
寒性突变体诱发与鉴定研究报道甚少。因此,本试验针
对这一方向开展了利用辐射诱变改良高羊茅爱瑞 3号
的研究, 获得了 3个具有强耐寒特性的突变体, 并对其
耐寒性进行了鉴定,以期为今后在生产中的应用以及进
一步研究提供有关理论依据。
收稿日期: 2006-03-28; 修回日期: 2006-05-22
基金项目: 国家 863项目( 2001AA212161) ; 省农科院高新技术项目( YGX0501)
作者简介: 张彦芹( 1964-) , 女, 助研,主要从事草类辐射育种及农业生物技术研究, E-m ail : zyq20047@ yahoo. com. cn
第 14卷 第 2期
Vo l. 14 No . 2
草 地 学 报
ACT A AGRESTIA SIN ICA
2006年 6 月
June 2006
1 材料与方法
1. 1 供试材料
以高羊茅爱瑞 3号( Festuca arundinacea Schreb.
cv . Airei III)种子为材料。用0. 1%升汞溶液消毒灭菌
30 min后,用无菌水冲洗干净, 置于 5 mg/ L 2, 4-D 的
MS培养基上诱导愈伤,待分化成苗后, 转接到 MS 培
养基上生长 1个月,生根后作为辐照处理材料。
1. 2 辐照处理
用60Co-r 射线源,以 100和 150 GY的剂量 [ 8]辐照
种子, 以 20 GY 剂量 [ 8]辐照分化苗, 以不辐照的材料
为对照。
1. 3 建立辐照群体
2001年 8月中旬,将辐照种子及对照各 800粒播
于网室,小区为 8行区,行长 1. 5 m ,行距 0. 3 m。进行
常规管理。1个月后将苗转接到 MS 培养基的三角瓶
中,每瓶 10株,每处理 10瓶预培养 10 d后,进行辐射
处理; 将植株无菌继代两轮后移至花盆培养, 于 2002
年 4月中旬移栽至大田(行距 0. 35 m,株距 0. 33 m ) ,
与网室越冬材料一并形成选育圃(诱变群体)。
1. 4 耐寒性状株系选择
采用系圃法定向选择耐寒性状变异株系。将 2002
年入选的单株, 在 2003年 4月扩栽成株系圃,将突变
单株分开栽植, 一蘖一株, 栽植成 1 m2 ,对照种植方法
同此,进行株系选择。10月下旬- 12月上旬,观察其耐
冷能力,考查植株和叶片的枯黄进程及所耐最低气温。
1. 5 电解质外渗率测定
2004年7月9日, 对入选的 ARF001-12、ARG001-
17和ARG001-16及对照进行模拟冻害处理[ 9] : 将工业酒
精置于密闭容器中在低温冰箱( - 70℃)中过夜, 以此得到
较低温度的酒精。将其与室温的酒精按不同比例在保温筒
内混合,在0、- 3、- 6、- 9、- 12、- 15和- 18℃下进行
冻害处理: 选择长势一致, 部位相同的叶片,用去离子水冲
洗干净, 吸干表面水分后剪为 1 cm 小段, 称0. 30 g 放入
密封塑料袋中, 各重复3次。在不同温度的保温筒中处理2
h,将处理后的叶片放入三角瓶中,加入 20 ml 去离子水,
以150 r / min 的速度在摇床上震荡 30 min,用DDS-11C
型电导仪测电解质外渗率 L1, 测完后放在水浴中煮 10
min,自然冷却至室温,测煮后电解质外渗率L2, 计算细胞
伤害率( %) = 100×L1/ L2。
1. 6 束缚水含量测定
2004年 11月下旬选取 ARF001-12、ARG001-17
和 ARG001-16与对照长势一致, 部位相同的叶片, 用
去离子水冲洗干净, 吸干后剪为 1 cm 小段,每处理称
5. 00 g ,分成相等两份, 分别测自由水和组织水含量,
计算束缚水含量(束缚水含量= 组织水含量- 自由水
含量) , 各重复 3次。
1. 7 叶绿素含量测定 [ 10]
2004年 11月下旬选取 ARF001-12、ARG001-17
和 ARG001-16与对照长势一致, 部位相同的叶片, 用
去离子水冲洗干净, 吸干后剪为均匀小段,分别称取
0. 50 g ,加 10 ml提取液,稀释 5倍比色,各重复 3次。
1. 8 生物量及叶根比测定
2004年 11月下旬分别从 ARF001-12、ARG001-
17 和 ARG001-16 与对照中随机选 3 丛(每丛由 5 个
分孽生长 6个月) ,冲洗干净,吸干水分后剪成叶、根两
部份,分别测鲜、干重及鲜、干叶根比。
1. 9 M0、M1代随机 PCR 扩增[ 11]鉴定
用 CTAB 法[ 12, 13] 分 别 提 取 ARF001-12、
ARG001-17 和 ARG001-16 及对照和 M 0、M 1 代幼嫩
叶片总 DNA,并用随机引物进行 PCR 扩增。采用 25
l 的 PCR 反应体系, 含 2. 5 l 的 10×buf fer (含 20
mM ol/ L M gCL 2) , 2 l的 2. 5 mM oldNT P, 1 l的 10
Mol的引物, 0. 2 l 的 5 U/1 T aq酶, 2 l的模板
DNA 和 17. 3 l的水。在 PCR 扩增仪 PTC-100TM
(可编程热循环控制仪) ( M J Research inc USA)上扩
增。其反应条件: 94℃ 3 min- 94℃ 1 min- 40℃ 1 min
- 72℃ 1 m in- 72℃ 5 min 40个循环。用琼脂糖电泳
后,在紫外灯下观察电泳结果。
2 结果与分析
2. 1 辐照后代耐寒突变体
2. 1. 1 用系圃法定向选育性状突变株系, 2002 年选
出 15个变异株(包扩株型、叶色、耐旱和耐寒变异株) ,
经单株无性系扩栽,入选单株的无性株系(生长一年的
植株,将分蘖分开栽植)于 2003年 4月扩栽成 1 m2 株
系圃, 包括对照。10月下旬- 12月上旬,观察其耐冷
能力。此间曾有过 3次明显降温,其中 10月 21、22、23
日太原地区低气温降至- 3℃, 11 月 3 日～12 月 6
日,低温范围在- 2- 9℃; 12 月 7日最低气温骤降到
- 12℃。该时段平均最高、最低气温见表 1, 2(数据来
自中央气象台)。
125第 2期 张彦芹等:高羊茅耐寒突变体的诱发与鉴定
表 1 太原地区 10月下旬- 12 月上旬平均气温
Table 1 Average low and high temperature fr om late
October to ear ly December in Taiyuan, Shanx i
月份
T ime
平均低温(℃)
Average low tem.
平均高温(℃)
Average high tem.
10月下旬 0. 364 17. 82
11月 - 2. 87 4. 73
12月上旬 - 6. 50 3. 60
2. 1. 2 从辐照 种子的株系圃获得 2 个 株系
( ARG001-16、ARG001-17) , 从辐照分化苗株系圃获
得 1个株系( A RF001-12) , 这 3个株系明显较对照和
其它株系耐寒能力强。对照和部分株系地上部能耐-
7℃以上低温,而入选诱变株在- 9℃时只是叶片前端
略受冻害; 对照及部分株系失绿过程为逐渐干尖、泛
黄、枯白直至冻死。而入选株待 2003年12月 7日气温
骤降到- 12℃时叶片组织才死亡。保绿期(返青期-初
冬叶片被冻死时)两年间比对照前后共延长25 d。结果
表明,耐寒突变体对低温的耐受程度比对照降低- 2～
- 3℃。
2. 2 叶片膜相对透性
ARF001-12、ARG001-17和 ARG001-6的相对电
解质外渗率均低于对照, 说明膜结构破坏程度比 CK
轻。方差法检测结果表明,诱变系(包括 CK)在 0、- 3、
- 6和- 9℃4个温度下电解质外渗率间差异极显著
( P< 0. 01) ,在- 12、- 15和- 18℃ 3个温度下差异不
显著,与观察结果一致。因此,笔者认为筛选的诱变系
比对照耐寒能力有所提高,其耐寒极限温度为- 12℃
(表 3)。
表 2 叶片电解质外渗率( % )
T able 2 Relat ive permeability o f leaf( % )
处理
T reatment
温度(℃) Temp.
0 - 3 - 6 - 9 - 12 - 15 - 18
ARF001-12 5. 26** 13. 00* * 41. 12* * 51. 81** 62. 29 64. 66 82. 50
ARG001-17 6. 84** 14. 67* * 46. 67* * 54. 18** 62. 50 63. 37 82. 72
ARG001-16 7. 64** 16. 59* * 51. 52* * 58. 07** 64. 93 66. 77 86. 77
CK 10. 80 30. 67 61. 14 63. 18 71. 15 74. 34 91. 50
注: * * 差异极显著( P < 0. 01)。Note: * * repr esents sign ifican ce at the 0. 01 level, respect ively
表 3 束缚水与叶绿素含量
T able 3 The bound-water and chlor ophyll cont ent
in three mutants
处理
T reatments
束缚水含量( % )
Bound-w ater conten t
叶绿素含量( mg/ g)
Ch lorophyl l content
ARF001-12 4. 67** 1. 47* *
ARG001-17 4. 78** 1. 31* *
ARG001-6 4. 58** 1. 30* *
CK 4. 07 0. 68
注: * * 表示与对照差异极显著; Note: * * repr esents s ignif icance
at the 0. 01 level respect ively
2. 3 束缚水含量( %)
入选的 3个诱变株系在 11月下旬束缚水含量高,
说明其原生质相对粘稠,约束水分子移动能力强,使其
脱水结冰的可能性降低,在低温下,因受寒发生冻害的
可能性降低。其束缚水含量排序为 ARF001-12 >
ARG001-17> ARG001-6。抗冷性明显强于 CK ,束缚
水含量与CK 间差异极显著( P< 0. 01) (表 4)。
2. 4 叶绿素含量
在低温来临前( 11 月下旬) , 叶绿素结构被破坏,
AEA (花生四烯酰乙醇胺)活性下降, 光合效率降低,
抗寒性越差, 叶绿素含量越低,反之, 叶绿素含量越高,
抗寒性越强。3个株系叶绿素含量明显高于 CK,尤其
是 ARF001-12; 结果还表明: 突变体的细胞器对低温
反应各异。3个诱变系叶绿素含量与 CK 间差异极显
著( P< 0. 01)。
2. 5 生物量及叶根比
3个诱变体单株生物量的鲜、干重都低于对照, 其
株型变小[ 8] , 叶根比降低,易于抵抗逆境(如干旱与冷
害)。其叶、根干鲜重与 CK 间差异显著( P < 0. 05)。
ARG001-6、ARG001-17叶根干、鲜重比与 CK 间差异
显著( P< 0. 05) (表 5)。
2. 6 诱变体M0、M1代 DNA变异
用 CTAB 法提取爱瑞 3号及其诱变体幼嫩叶片的
基因组总DNA(参考Doyle 等[ 12]、王关林等方法[ 13] )。用
随机 PCR扩增法,其 M 0代用 3条引物( P5: CT G CTG
GGA C, P7: TGC GCC CTT C、P10: GGT GAC GCA
G)扩增,结果以P7的效果较好。2个耐寒诱变体: ARF
001-12、ARF001-16与对照的随机PCR扩增带是不同
的, 说明诱变体可能发生变异; 而且 ARF001-12 与
ARF001-16的扩增图谱也有较大差异, 说明是两个突变
体;同样, M 1代(诱变体的种苗)用引物( S 12: CCTT G
ACGCA )对ARF001-12、ARF001-16、ARF001-17及
其对照扩增,诱变体与对照的随机PCR 扩增带各异。结
果表明,辐射诱变的效果不仅使 M 0、M 1代的表型产生变
异,在 M0、M 1代DNA也发生质的变化(图1、2)。
126 草 地 学 报 第 14卷
表 5 单株生物量及叶根比
Table 5 T he sing le plants biomass and leaf-r oo t-ratio in thr ee mutants
处理
T reatments
鲜叶重
Fresh leaf w eight
鲜根重
Fr esh root weight
叶根鲜重比
Fresh leaf root rat io
干叶重
Dry leaf w eigh t
干根重
Dry root w eight
叶根干重比
Dry leaf root ratio
ARF001-12 56. 43* 4. 87* 11. 66 14. 42* 1. 61* 9. 34
ARG001-17 57. 84* 4. 94* 11. 77* 15. 32* 1. 96* 7. 93*
ARG001-16 39. 65* 3. 59* 10. 98* 11. 99* 1. 74* 6. 86*
CK 135. 62 10. 98 13. 32 35. 32 3. 94 10. 24
注: * 表示差异显著(P < 0. 05) ; Note: * Repres ents that at the 0. 05 level the d iffer ence is rem ark able
图 1 引物 P5、P7、P10 对 2 个株系扩增结果
Fig. 1 PCR amplified patterns by P5、P7、P10 Pr imer in
different mutant o f A ir er II I
注: M , DL2000 marker; P5-CK、P7-CK、P10-CK 为未辐射的爱瑞 3
号; 1和 2是 2 个耐寒突变系; Note: M , DL2000 marker; P5-CK、P7-
CK、P10-CK, unradiant Ai rer III, 1、2 tw o mutants[ f rigidity resistance
is very clear. ]
图 2 引物 S12 对M0 代 3 个株系扩增结果
F ig . 2 PCR amplified patterns by S 12 P rimer in
different mutant o f A ir er II I
注: M , marker; S12-CK 为未辐射的爱瑞 3号; 1, 2, 3是 3个耐寒诱
变系 ARF001-12, ARF001-16, ARF001-17; Note: M , m ark er; S12-
CK, unradiant Airer III; 1, 2, 3 are 3 mutan ts ARF001-12, ARF001-16,
ARF001-17[ f rigidity res istance is very clear. ]
3 讨 论
3. 1 在国外抗寒育种的成功例子多集中在狗牙根。
Tif ton 实验站于 1970年对三倍体狗牙根进行改良获
得耐寒诱变体[ 14] ;而国内有关草坪草耐寒育种研究报
道甚少, 一般通过施用细菌制剂及其复合肥实现[ 15] ;
郭爱桂等 [ 5]用 r 射线对狗牙根进行辐射处理, 结果表
明:高剂量对狗牙根数量性状能产生较稳定的理想变
异。本研究也获得叶根比小且具有耐寒性状的变异体,
说明用60Co-r 射线诱变培育我国急需的适应特殊生境
的草坪草种是可能的。
3. 2 目前我国草坪草研究主要停留在引种上, 而引进
的品种多数耐寒性差, 加之,草坪草花穗都很小, 常规
杂交育种技术应用困难。笔者发现 [ 8]通过射线辐照容
易改变株型和叶型等农艺性状, 便于获得株型矮化、叶
型细小的耐旱、寒突变体。在选择过程中, 仅通过表型
的变化和抗寒性鉴定筛选耐寒突变体,需要的周期长,
而且有很多假突变体难以及时去除, 影响选择效果。
RAPD( PCR 扩增)技术, 是从 DNA 水平快速鉴定是
否变异的有效方法。因此,本试验在自然和胁迫冷害条
件下,进行表型变异及抗寒性选择和鉴定的同时,结合
应用 RAPD技术,证实了在 M 0、M1 代突变体从 DNA
水平已发生质的变化, 快速分析和鉴定突变材料的
DNA 水平的变异,加快了获得高羊茅耐寒新种质资源
的研究进程。另外,本试验用分化苗做辐射材料,性状
突变也有可能是组织培养的结果。
3. 3 抗寒鉴定相关研究已证实[ 16 ] : 细胞膜是低温伤
害发生的最初部位, 膜结构的改变与适应寒冷的过程
相关。植物体内束缚水含量与其抗寒性呈正相关。本
文的耐寒突变体, 在模拟冷害条件下 ,随着温度的降
低,叶片膜相对透性增大,在各处理温度下的相对电解
质外渗率均低于对照; 在自然低温条件下, 3个诱变系
束缚水含量、叶绿素含量明显高于对照; 与 10月下
旬- 12月上旬观察结果一致, 说明选择突变体的抗冷
性明显强于对照。总之,诱变获得的辐照高羊茅突变
体,在田间的生理抗寒方面,都明显优于对照,在几个
寒冷地区建植结果的突变体表现较好。
4 结 论
4. 1 以高羊茅爱瑞 3号种子及分化苗为材料, 用 60
Co-射线以 100和 150 GY 剂量 [ 8]辐照种子,以 20 GY
剂量[ 8]照射分化苗。在辐射当代选出 3个高羊茅耐寒
突变体 ARF001-12、ARG001-17和ARG001-16。
4. 2 在模拟冷害条件下对 3个诱变系的耐寒性进行鉴
127第 2期 张彦芹等:高羊茅耐寒突变体的诱发与鉴定
定: 随着温度的降低,叶片膜相对透性增大, 在处理温度
下的相对电解质外渗率均低于对照; 在自然低温条件
下, 3个诱变系束缚水含量、叶绿素含量明显高于对照;
与 10月下旬-12月上旬之间观察结果一致, 证实辐照
高羊茅突变体的抗冷性明显强于对照。
4. 3 3个突变体形态学上已发生变化,其鲜重和干重
均低于对照,株型变小[ 8] , 而且叶根比也降低, 这一形
态上的变化, 易于抵抗逆境(如干旱与冷害)。M 0、M 1
代 RAPD分析结果表明这些诱变体在 DNA 水平上发
生了变异。
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(责任编辑 孟昭仪)
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(责任编辑 才 杰)
128 草 地 学 报 第 14卷