全 文 ：第 41卷 第 8期
19 87 年 8月
园 艺 学 报
A C TA HO R Tc lU LU T R人E SI NICA
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3
I Q 87
〔研 究 简 报〕
长期继代培养的柳橙胚愈伤组织
再分化能力和遗传性研究 `
张进仁 吴安仁 高 峰
(中国农业科学院柑桔研究所 )
长期继代培养的愈伤组织 , 不仅是建立细胞无性繁殖系和作为种质资源保存的一种
材料 , 也是细胞突变育种的理想试材 。 这主要是材料一致 , 容易处理 , 不受季节和植物
发育阶段的限制 , 任何时候都可 以进行试验 , 给研究工作提供了很多方便 , 避免了对种
子和接穗作辐射诱变和化学诱变时容易形成的大量嵌合体 , 提高了诱变频率 。
但是 , 除必须提高长期继代培养愈伤组织的增殖能力外 , 还要解决愈伤组织再生植
株的分化率 , 以及植株的染色体倍性和其它遗传性状是否发生变化的问题 。 本试验试图
通过对长期继代培养的柳橙 ( 自 t终 ; ; `en sn is o s b郎 k ) 胚的愈伤组织进行研究 , 以对
上述间题进行探讨 。 _
材 料 与 方 法
用于本试验的愈伤组织来源于 「1 9了6年 4 月新培养的柳橙胚 。 最初在 M T + IB A ( 0 . 5
m s1/ ) 培养基上产生愈伤组织 , 随后分别在该培养基和M T + G A ( 1 m g 1/ ) 培 养 基
上 , 每隔 10 一 12 周交替继代培养 , 已达 8年半 , 共 38 代 。
长期继代培养的柳橙胚愈伤组织的增殖和再分化植株的研究 : 将上述 3 8代的愈伤组
织切割成小块 , 称重并接种于表 1 所示的各种培养基上进行培养 , 加入的生长调节剂和
生理活性物质有各种浓度的N 6一节胺嚷吟 ( B A ) 、 6一糠基氨基漂吟 ( K T ) , 赤霉素
( G A )
、 吼噪丁酸 ( BI A ) 、 酪蛋白水解物 ( C H ) 、 腺嗦伶 ( A d) 和酵母提取液 ( Y E )
等 。 G A用 0 . 45 协的微孔滤膜过滤除菌 。 培养基经 1 . I k g c/ nI Z热压消毒 15 分钟 。 消毒前调
整 p H为 5 . 8。 各处理 10 一 13 管 。 培养条件按继代培养的要求进行 , 培养 室 温 度 为 2 8士
2 七 , 每日光照 14 小时 , 光强 2 0 0 L x ( 荧光灯 ) 。 培养 6 周以后 , 调查 愈 伤组织的重
量和胚状体的数目 , 以各种培养基中愈伤组织的生长率来衡量培养基的适宜程度 。 实验
重复 2 次 , 取其平均值 。
根尖染色体计数 : 取试管中小植株的根尖 , 用对一二氯苯预处理 , 1
乙醇固定 。 在 60 ℃下用 IN H CI 水解后用醋酸地衣红染色 , 镜检并摄影 。
: 3 的 醋酸 /
为了解长期继代培养愈伤组织的结构 , 将愈伤组织用 F A A固定液固定 , 按常规石
腊切片法制成 8 ~ 10 , m厚的切片 , 用铁矾苏木精染色 。
为了研究再分化植株的遗传性 , 还对 5 株再分化植株和 2 株柳橙种子萌发苗的叶形
指数 、 叶的过氧化物 :酶和醋酶同工酶等进行了分析研究 。 每一植株随机取 10 张叶片, 计
. 本文于 19 8 5年 12月收到 , 1 9 86年 1 1月收到修改稿 。
幻 4园 艺 学 报一一— - - -一一二 ~一一一一一 1 4卷算出叶形指数 (长 /宽 )及标准误 (S .E ) 。 并用 7 %和 4%聚丙烯酞胺 凝胶 电泳分别检验过氧化物酶和醋酶同工酶 。 样品的制备 , 电泳条件及染色方法均如前述 。结 果 与 讨 论在 8年半的继代培养过程中. , 柳橙胚的愈伤组织在 2 号培养基上 , 少数培养物从老
的愈伤组织表面产生了外表光滑嫩绿的胚状体。 与此同时 , , 在部分胚状体基部周围又发
生一些白色的愈伤组织 , 这些愈伤组织在继代培养过程中仍保持其胚性特点 。 在 6号培
养基中 , 还可能使心形胚及子叶胚先发生根 , 然后分化出茎叶 , 与种子的正常萌发过程
相同 。
在供试的 16 种培养基上 , 长期继代培养的柳橙胚愈伤组织 , 除 13 号培养基外均能增
殖 , 增殖的速度不同而生长状态相 同 , 愈伤组织非常疏松 , 呈淡黄色颗粒状 , 含有较大
的淀粉粒 。 产生胚状体的胚性细胞一般是由愈伤组织中某些细胞特化的结果 , 这些愈伤
组织 由淡黄色变为淡褐色 , 然后逐步分化成胚状体 。 值得指出的是 , 在 13 号培养基上 ,
由于大剂量的K T抑制了愈伤组织和胚状体的生长 , 并使其萎缩 。 从生长速度看 , 分别
含 C H 、 Y E 、 A d 、 不同浓度的 B A 和中等浓变的G A 培养基效果较好 , 其 中尤以含 C H
的培养基效果最佳 , 平均每管愈伤组织的增重量为原重量的 1 8 . 4倍 , 而乳糖及D一果糖
培养基愈伤组织的增殖比对照 ( M T , 5 %蔗糖 ) 差 ( 表 1 ) 。
表 1 培养墓对长期继代培养的柳橙肛愈伤组织淆从和
胚状体形成的影响
培养基成 分
( m g / l )
平
转
均 每
编号 令爽鲜g ) 管 } 笋手旦
_娜质士重
1
均喂毕夏 平均每管愈的增重盆为原重量的倩数 每 10
o m g愈形
成胚状体的数
目
1
2
8
4
6
6
7
8
9
10
11
1 2
13
14
M T (5 %蔗糖十 。 . 7%琼脂 )
M T (弓%蔗搪 十 。 . 7 %琼脂 ) + BI A o . 5
M T (5 %蔗搪 + 。 . 了%琼脂 ) + BI A i
M T (5 % 蔗糖 + 。 . 7%凉脂 ) + IB A S
1一 4 8 0
1一 72 6
1 。 5 8 1
1 5
1 6
M T (5 %蔗搪 + 。 . 7%琼脂 ) 十 G A 0 . 5
M T (5 % 蔗搪 + 。 。 7%琼脂 ) 十 G A I
M T (5 %蔗搪 十 。 . 7%琼脂 ) + G A S
y T (5 %蔗糖 + 0 . 了%琼脂 ) + B A 0 . 5
M (T 5 %蔗糖 十 。 . 7%碑脂 ) 十 B A I
M T ( 5 %蔗搪 + 0 . 7%琼脂 ) + B A S
M T ( 5 %蔗搪 + 0 . 7%琼脂 ) + CH 5 0 0
M T ( 5% 蔗糖 + 0 . 7%琼脂 ) + A d s o
M T (5 % 蔗糖 + 。 . 7% 琼脂 ) 十 K T S。
M T ( 5% 蔗糖 + 0 . 7 %琼脂 ) + Y E l o o
M T (5 % 乳搪 十 。 。 7% 琼脂 )
M T (5 % 蔗糖 十 。 . 7% 琼脂 )
0 。 1 0 3
0 。 1 1 6
0 . 12 1
0一 08 3
0 . 1 3 1
0 . 13 2
0一 1 16
0 . 0 9 1
0 。 0 9 5
0 。 0 7 1
0 . 11 0
0 一 1 1 6
0 。 10 9
0。 0 7 6
1 一 2 3 3
1 。 8 2 1
2 。 0 9 3
1 。 0 65
1 . 6 2日
1一 4 7 9
1一 2 16
2 。 12 9
1一 7 4 6
0 . 0 8 5
1。 2 5 3
1
一
4 1 5
1 3一 4
13 . 9
12 一 1
13 。 9
12
。
9
1 4 。 9
8 。 2
16 一 9
14 一 6
1 6
一
1
18一 4
14一 1
一 4 . 5
1 5一 5
9 1 一 4
2 5一 0
4 9 . 7
2 。 4
32 . 7
1一 1
2 2一 1
8 . 3
3
一
2
1 1 0 . 4
3 1 2 。 8
0 6 。 9
0
5 0一 4
0 。 12 9
0 。 6 9 4
1 0一 0
5一 9
2 5 4 一 7
柑桔上关于长期继代培养愈伤组织仍然保持分化植株能力的研究 , 已由K co h b a等
和 C h “ t “ r y “ d i等完成 。 前者从长期继代培养的沙莫蒂甜橙胚珠愈伤组织中选择到 “ 驯
化 ” 的株系 , 在没有外源激素的条件下 , 通过胚状体的方式增殖和分化 , 并指出生长调
节剂对胚状体的形成有妨碍作用 , 半乳糖和乳糖有明显的促进作用 , 后者用玉米素代替
B A
, 将长期培养的抽的茎切段所产生的 B型愈伤组织分化出胚状体。 而我们 所取 的柳
橙胚愈伤组织 , 在含 I B A 和 G A的培养基上 , 不用生长调节剂 , 只用生理活性物质 C H ,
3期 张进仁等 :长期继代培养的柳橙胚愈伤组织的再分化能 灯及脸传性研究
或以乳糖代替蔗糖 , 可以 “ 激活 ” 其再分化能力 , 大大提高了产生胚状体的数量 ( 表
1 )
。 说明生长调节剂未必是影响胚状体形成的主要因素 , 这 与K oc h b a 的试验结果是
一致的。
综上所述 , 说明 C H 不仅对长期继代培养的柳橙胚愈伤组织的增殖 、 而且对其胚状
体的形成均有显著的作用 , 而乳糖仅对胚状体的形成具有特别明显的效果 。 这样 , 愈伤
组织的增殖和胚状体的形成可以通过选择培养基的方法加以控制 。
将胚性愈伤组织 ( e m br y o g e in c c al hi s ) 再分化的胚状体 ,转移入 6 号培养基上 ,
经过 60 天后 , 胚状体可形成具有完整根茎的小植株 ; 而转移入 10 号培养基中 , 则增加了
小苗 的出苗率 。 R a n ga 。 等 1 969 年报道 , 表 2 再生 植株 向及与种子萌发植株
C H 对不成熟胚的发芽有明显的作用 , 当
我们在 6 号和 10 号 培 养 基中 , 分别加入
C H ( 10 0 m g l/ ) 后 , 成苗率 大 大 提 高
了 。 试管苗生长 良好 , 其外部形态发育正
常 。 再生植株间及与种子萌发植株的叶形
指数进行比较 , 没有差异 ( 表 2 ) 。 过氧
化物酶和醋酶同工酶酶谱分析表明 , 无论
那种酶 , 再分化的植株之间 , 或者与种子
叶形指数 ( 长 /宽 ) 的比较
植 株
{
1 叶形指数掀 .E一
种子萌发植株 1
种子 萌发植株 2
2
。
3 6 土 0 。 04
2
。
3 2 士 0 。 0 4 `
2 。 3 6 士 0 。 0 4
2
。
3 6 士 0 。 0 2
2 。 3 2 士 O 。 0 6
2 。 2 9 士 0 。 0 4
2
。
3 4 士 0 一 0 4
嘴上2346株植生再
的萌发苗之间 , 主要谱带完全相同。 S , 、 S : 以及 C , 、 C: 、 C 3 、 . C ` 、 C 6等过氧化物酶同工
酶从负极到正极都分别呈现 8条谱带 , 醋酶同工酶分别具有 7条谱带 。 各植株每条相应
谱带的迁移率均相同 , 其活性也是一致的 。 . 初步说明长期继代培养的柳橙胚愈伤组织的
主要遗传性状是较一致和稳定的 。
在植物长期离体培养细胞过程中 , 目前至少有 60 种植物经离体培养后发生 了染色体
变异 , 也有不少植物的组织和细胞长期培养 , 其染色体未发生变异 。 然而 , 关于研究柑
桔在长期离体培养细胞过程中的遗传变异间题至今未见报道 。 我们观察了20 个根尖细胞
的染色体 , 都是 Z n = 1 8 , 表明没有发生染色体倍性的变化 。 这进一步 证明在长期继代培
养过程中 , 柳橙胚的愈伤组织是较稳定的 , 以此作为种质资源保存是有价值的 。
长期继代培养的柳橙胚愈伤组织 , 再分化成小植株的方式有两种 , 一是通过器官发
生 ( O r ga n 。罗 n e s i s ) 的途径 , 它可以通过顺序改变培养基的成分 , 调节外源激素的种
类和浓度 , 以诱导出不定芽再形成小植株 ; 二是通过体细胞胚胎发生 ( S o m at ic e m -
b r yo ge en
s i s ) 的途径来完成 , 由胚状体长成植株 。 本试验是经后一途径完成的 。有许多
作物的胚性愈伤组织经继代培养后 , 大多丧失分化胚状体的能力。 然而 , 像柳橙胚愈伤
组织和王大元等 9] 7 年所培养的抽 ( C . g r a n id s O s be c k ) 胚乳的愈伤组织 , 经 长 期
继代培养后 , 仍很容易产生胚状体的现象 , 除胡萝 卜等作物外 , 并不多见 。 这说明柑桔
的胚性愈伤组织能长期保持体细胞胚胎发生的特性 。 通过体细胞胚胎发生繁殖的胚状体
数量多 、 速度快和结构完整 , 是一种有效的无性繁殖方式 。 还可以利用此胚性愈伤组织
进一步建立胚性细胞悬浮培养物 ( E m b r y o g e in c s su p e sn i o n ), 为原生质体 培养开辟
另一途径 。
21色 研 究 简 报 4 1卷
ST UO !E SN T H O EP C AB A I LT ! Y OF R ED F !F ER EN丫 T !A旧 N AND
T H N E !H ER !T N A C E OF T H E LN O G
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。
《 园 艺 学 报 》 征 订 启 事
园艺学报是中国园艺学会编委会编辑的园艺科学学术刊物 , 主要报道我
域中基础理论和应用技术研究方面的学术论文 、 专题研究报告 、 研究简报 、 国
科学领
文献述
回黯
评 、 书报评论以及新方法 、 新技术的研究成果。 读者对象是从事本学科的研究工作者 、
大专院校师生及具有同等水平的专业干部。
本刊为季刊 , 每期72 页。 国内外公开发行 , 国内发行每册定价 0 . 95 元 , 全国各地邮
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