全 文 ：文章编号: 1007-0435( 2004) 04-0303-06
多年生黑麦草叶片长度数量性状位点( QT Ls)研究
米福贵1 , BARRE Philippe2,瞿礼嘉3 , GHESQUIERE Marc2
( 1. 内蒙古农业大学,呼和浩特, 010018;
2. INRA , Unit†de G†n†tique et dAm†lio ration des P lantes Four rag†res, 86600 Lusignan, F rance;
3.北京大学植物基因工程国家重点实验室,北京, 100871)
摘要: 选择固定有益等位基因,研究多年生黑麦草叶片长度数量性状位点, 结果表明:与叶长最为相关的 3 个标记所表
达的变异占表型总变异的 50. 9% ( r2) ;在选择中如能将这 3 个标记最优化地组合在一起, 其综合共同作用有望使叶片长
度延长和缩短 26 mm; 鉴于供试材料在最初 3 个世代的群体选择中所估测到叶片长度的遗传力为 0. 32, 这样在今后的
选择工作中, 即使只使用现有的两个标记,其效果亦优于传统的表型选择法。
关键词: 多年生黑麦草;叶片长度; 数量性状位点( QTLs) ;遗传图; 分子标记
中图分类号: Q943. 2　　　文献标识码: A
Quantitative Trait Loci of Lamina Length in Perennial Ryegrass
MI Fu-gui1, BARRE Philippe2, QU Li-jia3, GHESQUIERE Marc2
( 1. Agricu lture Un ivers ity of Inner Mongolia, Huhhot , 010018, China;
2. INRA, Unite de Genet ique et dAmelioration des Plan tes Fourrageres, 86600 Lu signan, France;
3. Nation al Laboratory of Plant Genet ic En gineering, Pek ing U nivers ity, Beijing, 100871,C hina)
Abstract: Quant itat ive t rait loci ( QTLs) of the lam ina length of L olium p erenne have been studied to better
understand the genet ic contro l of g row th in gr asses and to help the fix at ion of favo rable alleles. T hus, a
mapping population w as built by cro ssing a‘long-leave g enotype and a‘shor t-leaf one. Genet ic maps were
constr ucted at LOD= 5. 5 by the mean o f 178 molecular mar kers, including 167 AFLP, 6 RAPD and 5 iso-
enzyme loci. Lamina length w as measured f irst in the g reenhouse at the early germination stage, and later in
the f ield at the late germination stag e. Over all , 10 markers significant ly associated w ith lam ina length were
found, it s mean sing le g enet ic effect ranging f rom 6 mm to 19. 1 mm . Only 3 markers appeared to be QTLs of
lamina leng th at the early stage , the other 7 w ere related to the lamina leng th measur ed in the f ield. T o avo id
redundancy of QT Ls found in each parent , a mult iple regression analysis w ith all significant markers
( ANOVA, P< 0. 005) fr om both par ents w as then carried out on the aver age lamina length in the f ield. T hr ee
markers closely r elated to the lam ina length explained 50. 9% ( r2 ) of the total phenotypic variance o f w hich a
marker is expected to respond. T he interaction of the most favor able combinat ion of these markers could extend
or shorten the lamina leng th by 26 mm. As the r ealized her itabil ity ov er the 3 cycles o f mass select ion for
lamina length w as est imated to be 0. 32, it is suggested that select ion of even only 2 markers could be more
eff icient than pheno typic select ion.
Key words : L ol ium perenne; Lam ina length; Quantitat iv e t rait loci; Genetic mapping ; M olecular markers
　　禾本科牧草栽培利用的目的是为家畜提供优质高
产的饲草, 因此在禾草的遗传改良中,人们常把与产
量和质量性状密切相关的一些表型特征,如株高、分蘖
数、叶片长度等作为主要的育种目标。
收稿日期: 2003-08-20;修回日期: 2004-09-09
作者简介:米福贵( 1959-) ,男,博士,教授,主要从事牧草遗传育种及生物技术方面研究,发表论文 60余篇,参编教材及专著 5部
致　　谢:本研究得到法国农业科学研究院 INRA 的大力支持,特向参与研究工作的 J. F. Bour cier , D . Cadier , L . Hazard , C . Lar geaud 和 P.
L eQuil liec 致谢;同时感谢北京大学的崔维维在论文的修改、制图、打印和校对过程中提供的帮助
第 12 卷　第 4 期
　Vol. 12　　No . 4
草　地　学　报
ACTA AGREST IA SINICA
　2004 年　12月
　Dec. 　2004
　　多年生黑麦草( L ol ium p erenne L. , 2n= 2x= 14) ,
是一种生长迅速、营养价值高、为家畜喜食的禾草, 它
耐牧能力较强,种子产量高,在西欧、北欧、新西兰等地
的人工草地建设中属首选草种。据报道,多年生黑麦草
干物质产量主要取决于叶片长度和分蘖数,且叶片长
度的遗传力很高,密植或稀植条件下叶片长度的相关
性均很好[ 1, 2]。Hazard 等人( 1995)发现,在对多年生黑
麦草的叶片长度实施严格的选择后, 频度刈割下长叶
片基因型干物质产量较高, 而短叶片基因型在更为频
繁的刈割条件下, 干物质产量会更高[ 3]。显而易见, 叶
片长度对多年生黑麦草干物质产量的构成及其利用制
度的确定具有重要影响。从表型水平上看, 对叶片长度
实施选择亦是有效的, 但叶片长度属典型的数量性状,
受微效多基因控制,内在的遗传机理非常复杂, 用经典
的遗传育种方法对此加以分析有一定难度,而依靠以
表型特征为基础的传统选择法对其进行选择,不仅费
时、费工、效率也有限。
近年来, 分子生物学的发展非常迅速。各种不同类
型的 DNA 分子标记技术的出现使人们有可能对涉及
植物产量、抗性性状等的许多数量因子进行遗传分析。
特别是结合分子标记的数量性状位点( QT Ls)分析技
术在植物中的应用, 为遗传育种研究提供了一种强有
力的工具;有关 QTLs 所处的位置及数量等的信息可
大大加速育种进程 [ 4]。
本研究选用经 3个世代歧化选择后所获得长叶片
型多年生黑麦草与短叶片型多年生黑麦草杂交的 F1
群体为材料, 借助于扩增片段多态( AFLP)、随机扩增
多态 DNA ( RAPD)等标记技术分析多年生黑麦草叶
片长度的数量性状位点,以期为叶片长度遗传机制的
研究以及叶片长度选择效率的提高提供必要的依据。
1　材料和方法
1. 1　供试材料
1998年,法国农业科学研究院( 1NRA )饲用植物
遗传育种研究所将经过 3个世代歧化选择后所获得的
多年生黑麦草长叶片型与短叶片型杂交种, 185 粒杂
种种子。同年 10月将亲本与杂种种子于培养皿中萌
发,出苗后以单株方式移植于温室。1998年 11月 13
日, 1999年1月 15日以及3月 24日进行了 3次刈割,
刈割高度 2 cm。刈前测定各植株的叶片长度,刈割后
为每株添加了 3U 的氮肥( NH3NO) ; 1999 年 4月 27
日分株处理,每株均被一分为三,以随机排列方式呈 3
次重复移植到大田。从 1999年 10月进行相同方式的
刈割与测定。
1. 2　叶片长度测定
1. 2. 1　温室　第一次 1999年 11 月 12日:因植株较
小,只测定每株主分蘖上1个成熟叶片的长度。第二次
1999年 1月 15日: 每株均测定 3个分蘖上成熟叶片
的长度。
1. 2. 2　大田　 第一次 1999年 10月 4日: 每次均测
定 5个分蘖上新成熟的叶片的长度。第二次 2000年 4
月 11～12日:每次均测定 5个分蘖上新成熟叶片的长
度。试验田两次测定值的总平均值记为 Mean。
1. 3　分子标记与酶标记的制备与鉴定
从每各供试植株选取约 350 mg 新鲜叶片, 冻干
后粉碎成粉末状(或在液 N 中研磨成粉末状) ,采用
CTAB 法从中提取DNA。DNA 总量经标定及定量稀
释后用于AFLP 和 RAPD试验。
1. 3. 1　AFLP 操作全部采用 GIBCO BRL Life
Techno-lo gies 的试剂盒进行　基因组 DNA 的用量为
250 ng, 共使用了 12对双酶切( EcoRI/ M seI)引物, 分
别 是 AAG/ CAG、AAG/ CAT、AAG/ CTG、AAG/
CTT、ACT/ CAA、ACT / CAG、AGC/ CAA、AGC/
CAT、AGG/ CAA、AGG/ CAT、AGG/ CT A。消化连接
与预扩增处理后,反应液均分别稀释10倍。正式扩增后
的 PCR产物以 1∶1的比例加入缓冲液( 98%的甲酰
胺, 10 mg / mL EDTA, 0. 05 mM 二甲苯青和溴酚蓝)。
然后取 4 LL 上述溶液经加热变性( 95℃ 4 min)及速降
温(直接放冷至冰上)处理,加到 6%聚丙烯酰胺变性凝
胶( 1 X TBE, 7 mg/ mL 尿素)上, 在 1 X T BE 缓冲液
中以 85 W 的功率( 1500～2000 V)电泳至二甲苯移至
凝胶下方5 cm 时为止[ 5]。凝胶经银染、拍照后,用梯度
为 100～330bp 的KDNA 标定 AFLP 产物。
1. 3. 2　RAPD操作　在 Perkin Elmer 480型PCR 仪
上进行　反应混合液的总体积为 25 LL,其中包括 2. 5
LL 1 mg / mL dNT P, 5 LL 10bp的引物、扩增缓冲液、
无菌水、1U Taq聚合酶及 40ng 基因组 DNA。扩增程
序为:预扩增 94℃ 5 min;扩增反应 94℃ 1 min, 37℃ 1
min, 72℃ 2 min,共 35个循环,然后再在 72℃下延伸
5 min,放冷至 4℃。取 10 LL PCR产物, 加 5 LL 缓冲
液(甘油、溴酚蓝) , 在 1. 4%的琼脂糖凝胶电泳上分离
( 100V)。RAPD 图谱经溴化乙锭( 1 mg / L )染色后, 在
紫外光下检查。
1. 3. 3　研究所用的同工酶标记, 如谷草转氨酶
GOT EC 2. 6. 1. 1, 磷酸激酶 ACPEC 3. 1. 3. 2, 以及
PGI 和 DIA 等均参照 Hayw ar d等人( 1995)的方法制
备[ 6]。
304 草　地　学　报 第 12卷
1. 4　数据分析
供试植株叶片长度的测定数据由 SAS 软件处
理[ 7, 8]。方差及线型分析涉及温室及试验田各两次测定
值的基因型效应,不同测定日期间的差异以及测定日
期×基因型的互作等。
AFLP、RAPD谱带及同工酶谱资料, 首先需作多
态性分析。多态性标记的标定标准为:
1. 4. 1　条带在两个亲本中的存在与缺失互为反相关,
即同一条带如果在一个亲本出现,则在另一个亲本中
必然缺失,反之亦然;
1. 4. 2　条带在杂种群体中存在与缺失的分离比例基
本上接近 1∶1;
1. 4. 3　方差分析的差异显著性水平应在 5%以上。属
于多态性的标记, 有带记为 1, 无带记为 0, 最终构成个
由 1、0排列组合的二元数据矩阵。在此基础上, 采用
Jo inmap 2. 0191软件分别构建两个亲本的连锁遗传
图。
1. 5　QTLs分析
用 SAS 软件对两个亲本所拥有的全部标记进行
方差分析, 找出差异显著性水平在 5%上的有关标记,
并将它们与前面已作过方差分析的温室、大田叶片长
度测定数据一同结合起来, 建立多元线型回归。具体的
数据处理过程中,两个亲本各自所拥有的标记先分别
回归, 然后它们二者的标记合并, 再与表型变量回归。
所有呈线型回归的标记位点便为多年生黑麦草叶片长
度的数量性状位点, 它们在基因组中所处的位置及其
在遗传上的重要性最终可标定在连锁遗传图上。
2　结果与分析
2. 1　遗传作图
通过对不同类型谱带资料的鉴定分析,本研究共
找到 178个多态型标记, 其中 167个为 AFLP 标记, 6
个为 RAPD 标记, 另外 5个为同工酶标记。在不同
LOD 水平下对所有这些标记构成的连锁群的数目进
行分析比较后, 确定 LOD= 5. 5,据此构建起两个连锁
图(图 lA 和 1B)。
由 89个标记构建的长叶片型亲本( FL42)的遗传
图具 14个连锁群, 遗传距离达 615. 8 cM , 而由 78 个
标记构成的另一短叶片型亲本( FC61)的遗传图具 15
个连锁群,遗传距离为 560. 1 cM。呈不连锁状的标记
数目较少,仅为11个。图中的遗传距离依 K氏公式 [ 10]
计算,单位为厘摩( cM )。连锁群最大的重组值为0. 49。
2. 2　QTLs分析
与两亲本相比,不同时期、不同生长条件下测定的
杂种后代叶片长度呈线型变异(图 2) ,为一典型的数
量性状。两种试验条件下测定数据方差分析的结果表
明,温室内第一次测定值基因型间的差异不显著,第二
次测定值的基因型效应较强,可表达近 30%的表型变
异;大田条件下,不同测定日期及基因型间的作用较
强,但它们之间的互作不明显。在此情况下,对不同日
期的测定值分别统计分析后, 再用二者的平均值找
QT Ls。
QTLs 分析结果可参见图 1。图中标出与叶片长
度有关的 10个主要标记位点在基因组中所处的位置。
对各变量(如试验条件、测定日期)而言,它们既拥有各
自独特的标记位点,也有共享的标记位点。这其中来自
两个亲本、且对大田两次测定数据的平均值( M ean)影
响较大的位点,与其它变量共享的程度较高(表 1)。特
别值得指出的是,尽管温室第一次测定值基因型间的
差异不显著, 但笔者从中也找出了一些同样存在于
Mean 中的标记位点, 如 AGCCCAll4, GOT 等。这表
明控制叶片长度的数量性状位点在供试的多年生黑麦
草杂种群体中是真实存在的。各标记位点所能表达的
表型遗传变异的大小,因测定日期及亲本来源不同而
异,其中源自短叶片型亲本的标记与大田第二次测定
值间的相关程度相对较高。
如对两个亲本全部的数量性状位点作进一步的多
元回归 分析, 笔 者发现主 要有 5 个 标记位 点
( A GCCAA114, Go t2, AGCCAG345, AGCCAG370,
AGCCAA 90)与叶片长度的遗传密切相关, 其简单的
遗传效应高者为 21. 4 mm, 低者为 7. 9 mm (表 2)。3
个最优标记位点结合起来所能表达的变异可占大田平
均测试值表型变异的 50. 9%( r2)。若这 3个位点同时
存在于某一后代植株, 从理论上讲,它们的综合遗传效
应不仅会使该植株叶片长度伸长 51. 9 mm, 而且还可
将叶片长度的狭义遗传力( h2 )提高0. 60。在不考虑它
们各自遗传重要性的情况下, 每一有益等位基因位点
平均的遗传效应因此可以记为 17. 3 mm。对于供试的
全部杂种植株而言, 不具任何有益等位基因植株的叶
片长度为 214 mm, 具 3个有益等位基因位点植株的
叶片长度可达 262 mm, 而杂种群体所有植株叶片的
平均长度为 240 mm。故此,上述理论估计值与实测数
据几乎是完全吻合的。
305第 4期 米福贵等:多年生黑麦草叶片长度数量性状位点( QT Ls)研究
表 1　亲本来源和显著性标记对叶片长度的影响
T able 1　Parent or ig in and significant ( ANOVA , P< 0. 005) effect of ma rker s on lamina lengt h obser v ed at t wo dat es in
a mapping population r esulting from a cro ss betw een a sho rt -lea ve×long-leave geno type of L olium p er enne
引物或同工酶位点
Pr imer or Is ozymic loci
亲本 Paren t
叶片长度 Lamina length( mm )
大田 Field 温室 Greenhouse
mean Date 1 Date 2 Date 1 Date 2
AGCCAG345 短叶 short-leave 12. 5 12. 7 12. 6
AAGCT G262 短叶 short-leave 11. 6 12. 9
AGCCAAnn 短叶 short-leave 14. 9 19. 1 15. 0
AAGCAC222 短叶 short-leave 13. 0 18. 7
AGCCAAg0 短叶 short-leave 13. 4 19. 2
AAGCAC280 短叶 short-leave 12. 2 16. 2
AGCCAG370 长叶 l on g-leave 12. 2 12. 3 13. 3
Got2 长叶 l on g-leave 14. 2 16. 8 12. 7
AGCCAT 248 长叶 l on g-leave 13. 0 14. 8
ACT CAAm 长叶 l on g-leave 17. 4 22. 8
图 1　双亲遗传图谱和叶片数量性状位点
Fig . 1　The genetic maps and lamina leng th QTLsin bo th parent
A. FC61图谱叶片长度数量性状位点; B. FL42图谱叶片长度数量性状位点;
A . Lamina length QT Ls on FC 61 map; B. Lamina length QT Ls on FL42 map
306 草　地　学　报 第 12卷
表 2　多元回归分析估计标记对双亲平均叶片长度的影响
Table 2　Effect of markers on m ean lamina length estimated by multiple r egr ession analy sis on both parents
标记 Mark er
引物或同
工酶位点 Primer or
Is ozymic loci
亲本 Parent 观察值
Observed E ffect
估计值
Est imated ef fect
绝对值
Absolute(mm)
绝对值
Absolute( mm )
标准差
S tand ardiz ed
r 2 h2
C50 GCCAAll4 短叶 sh or t-leave 14. 9 21. 4 1. 02 0. 254 0. 25
L5 Got2 长叶 long-leave 14. 2 18. 1 0. 86 0. 183 0. 21
C76 GCCAG345 短叶 sh or t-leave 12. 5 11. 3 0. 54 0. 072 0. 13
L87 GCCAG370 长叶 long-leave 12. 2 7. 9 0. 37 0. 035 0. 09
C10 GCCAA90 短叶 sh or t-leave 13. 4 7. 9 0. 37 0. 035 0. 09
50+ L5+ C76 48. 0 51. 9 2. 46 0. 509 0. 60
C50+ L5 31. 0 39. 5 1. 87 0. 437 0. 45
图 2　变异分布
Fig. 2　Distribution of v ariables
3　讨　论
近年来发展迅速的分子标记技术为植物数量性状
的遗传学研究提供了强有力的工具[ 11]。借助于分子标
记连锁遗传图及数量性状位点的研究, 人们不仅可估
测控制数量性状遗传变异的位点数目, 而且在一定程
序上还可对这些位点的遗传效应进行定性分析。该技
术引入到数量遗传学研究领域以来, 人们已对许多作
物的不同性状进行了大量 QTLs研究[ 12, 13]。
与亲缘关系相近的其它一些禾谷类作物,如小麦、
水稻、五米等相比,多年生黑麦草分子水平上的研究还
处于起步阶段。首次报道的有关黑麦草质的遗传图是
以种间杂种群体为材料, 采用 RAPD、RFLP 和同工酶
标记构建的[ 14]。最近也有利用AFLP 技术构建多年生
黑麦草高密度标记连锁遗传图的尝试, 但借助于各种
标记对某一或某些农艺性状进行数量性状位点研究,
在多年生黑麦草以及大多数其它禾草中还鲜有报道。
多年生黑麦草是一个二倍体物种, 与多倍体物种
相比, 其染色体配对机制及分子标记的连锁方式较为
简单,因而比较适宜遗传作图及数量性状位点的研究,
本研究只用了 89个标记便找出了长叶片型亲本 14个
完整的连锁群。
直至目前,有关 QT Ls 研究所用的形态学观察资
料大多数均来自于同一环境条件,即 QT Ls的重要性
会因环境的改变而变化 [ 16]。本项研究虽设置了两种不
同的试验条件, 但并未发现环境条件对 QTLs 的影
响。因为在大田条件下找到的一些较为重要的 QTLs,
在温室条件下也存在。至于大田两次测定值的差异, 则
可归因于植株大小的不同。依据叶片长度的总平均值
( M ean)来看, 基因型的作用显然远大于测定日期×基
因型、试验条件×基因型的互作, 这也说明不同生境、
不同日期间的基因型差异是较为稳定的。
至于叶片长度 QTLs 的遗传效应, 在结果与分析
中已作较为详细讨论,鉴于供试材料的原始亲本在最
初 3个世代群体选择中所估测到的叶片长度的遗传力
为 0. 3213,而本研究中仅两个最优的标记优点的遗传
力便达 0. 46(表 2) , QT Ls 在选择中的作用确实非同
一般。据此,我们可以得出如下结论:在应用 QT Ls 技
术对多年黑麦草的叶片长度进行选择时, 即使只用两
个标记位点, 其选择效果亦优于传统的表型选择法。
最后值得指出的是, 本文所涉及的 QT Ls 研究,
仅是从分子水平上对饲用植物数量遗传性状进行研究
分析所做的初步尝试。其中的一些结果表明,对多年生
黑麦草进行进一步的分子生物学研究是十分必要的。
首先应将两亲本的连锁图合二为一, 并在添加新的显
性或协显性标记的前提下构建该物种饱和的分子标记
遗传图。植株叶片的生长与环境因素,如温度、光照、水
分等密切相关,如能将这些环境因子的生理学效应与
叶片长度情况结合起来,寻找有关植物叶片长度、分蘖
密度等的 QT Ls,结果将更加真实可靠。此外,为研究
QT Ls 在后代的遗传,有必要在杂种 F2中继续 QT Ls
的研究。尤为重要的是应尽快将现有的 QT Ls 与传统
的表型选择方法结合起来, 应用于育种实践,以提高选
择效率。 (下转 321页)
307第 4期 米福贵等:多年生黑麦草叶片长度数量性状位点( QT Ls)研究
3　结论
3. 1　牧特利在通辽地区种植不能抽穗,叶面积指数大
且生长后期仍保持较高水平,是其高产的主要原因。其
高产栽培不同于粮食作物, 后期施肥、灌水是必要的措
施。
3. 2　牧特利分蘖能力强, 分蘖期长达 57 d, 应降低栽
培密度,以充分发挥其分蘖优势。
3. 3　刈割留茬以 15 cm 为宜,高留茬不仅可以保证安
全再生,而且较多地保留了小蘖, 再生生长速度较快。
随刈割时间的后移,再生率不断下降,青刈利用在拔节
前为宜。
3. 4　牧特利品质随生长时间延长而下降。粗蛋白质含
量与株高极显著负相关,粗纤维含量、茎叶比与株高呈
极显著正相关。
3. 5　牧特利刈割 1次,鲜、干草产量均最高,刈割 3次
最低;但从品质来看,以刈割 3次最好,刈割 1次最差。
因此,以青干草或青贮为目的宜 1次刈割; 以青刈为目
的宜 2次刈割。
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321第 4期 杨恒山等:杂交狼尾草“牧特利”生物学特性及刈割次数对产草量和品质的影响