全 文 ：第20卷 第6期
Vol.20 No.6
草 地 学 报
ACTA AGRESTIA SINICA
2012年 11月
Nov. 2012
Ca2+和钙调素拮抗剂 W7对PEG胁迫下不同
耐旱型紫花苜蓿抗氧化系统的影响
张春梅1,谢晓蓉1∗,刘金荣1,2,闫 芳3
(1.河西学院农业与生物技术学院,甘肃 张掖 734000;2.兰州大学草地农业科技学院,甘肃 兰州 730000;
3.河西生态与绿洲农业研究院,甘肃 张掖 734000)
摘要:以陇东苜蓿(抗旱型)、BL-02-329(干旱敏感型)2种抗旱性强弱差异较大的紫花苜蓿(MedicagosativaL.)
为试材,采用水培法研究Ca2+和钙调素拮抗剂 W7[N-(6-aminohexyl)-5-chloro-1-naphthalenesulfonamide]预处理
对干旱胁迫下紫花苜蓿根系抗氧化系统的影响。结果表明:钙调素拮抗剂 W7浸种处理显著提高了不同耐旱型紫
花苜蓿丙二醛(MDA)、H2O2 含量和O2-·产生速率,抑制了超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶(POD)活性,加剧
了抗坏血酸(AsA)和还原型谷胱甘肽(GSH)的破坏;而Ca2+处理显著降低了PEG胁迫下紫花苜蓿 MDA、H2O2含
量和O2-·产生速率,提高了SOD和POD活性,减轻了干旱胁迫对AsA和GSH的破坏。相同处理条件下,抗旱型
品种陇东较干旱敏感型品种BL-02-329伤害程度轻,Ca2+-CaM信号系统可缓解干旱胁迫对紫花苜蓿的伤害。
关键词:Ca2+处理;钙调素拮抗剂 W7;干旱胁迫;紫花苜蓿;抗氧化系统
中图分类号:Q945.78 文献标识码:A 文章编号:1007-0435(2012)06-1072-05
EffectsofCalciumandCalmodulinAntagonistW7onAntioxidant
SystemsofRootsofAlfalfaRootsunderPEGStress
ZHANGChun-mei1,XIEXiao-rong1∗,LIUJin-rong1,2,YANFang3
(1.ColegeofAgricultureandBiologyTechnology,HexiUniversity,Zhangye,GansuProvince734000,China;
2.ColegeofPastoralAgricultureScienceandTechnology,LanzhouUniversity,Lanzhou,GansuProvince730000,China;
3.HexiEcological&OasisAgriculturalRsearchInstitute,Zhangye,GansuProvince734000,China)
Abstract:TheeffectofCa2+andcalmodulinantagonistW7onantioxidantsystemsofalfalfaunderdrought
stressinducedby10% polyethyleneglycol(PEG6000)wasstudiedusinghydroponicsculture.Results
showedthatalfalfaseedlingspretreatedwithcalmodulinantagonistW7underPEGstresshadlowerSOD
andPODactivities,andhigherproductionrateofO2-·,MDAandH2O2,andtheaggravateddamageof
AsAandGSH.Onthecontrary,Ca2+treatmentenabledalfalfatokeeprelativelyhigheractivitiesofSOD
andPOD,lowerproductionrateofO2-·andMDAcontent,atthesametime,aleviatedtheaccumulationof
AsAandGSH.TheseresultsindicatedthatCa2+-CaMsignaltransductionmightregulatetheresistanceof
alfalfatoPEGstressbyaffectingtheactivityofsomeantioxidantenzymesandthecontentofantioxidant
substance.TheexperimentshowedthatCa2+-CaMsignalsystemplayedanimportantregulatingroleinal-
leviatingPEGstress.
Keywords:Ca2+;CalmodulinantagonistW7;PEGstress;Alfalfa;Antioxidatantsystem
干旱胁迫对植物生长发育的影响越来越突
出[1]。Ca2+作为生物膜稳定剂,参与植物细胞对逆
境胁迫信号转导[2],也可能作为第2信使对干旱[3]、
低温[4]、高温[5-6]、盐害[7]等环境胁迫信号转导起重
要作用。Ca2+ 的受体蛋白钙调素(Calmodulin,
CaM)参与许多 Ca2+ 调节的生理生化反应[8]。
Ca2+-CaM信使系统中,Ca2+通过与CaM结合而激活
一系列的靶酶和非酶蛋白,从而调控生理代谢及基因
表 达[2]。CaM 拮 抗 剂 W7[N-(6-aminohexy1)-
5-chloro-1-naphthalenesulfonamide]可导致Ca2+-CaM
收稿日期:2012-7-10;修回日期:2012-09-24
基金项目:甘肃省科技支撑项目(1011NKCG064)资助
作者简介:张春梅(1978-),女,甘肃酒泉人,博士,副教授,主要从事植物逆境生理研究,E-mail:zazcm197828@163.com;∗通信作者 Au-
thorforcorrespondence,E-mail:xr@hxu.edu.cn
第6期 张春梅等:Ca2+和钙调素拮抗剂 W7对PEG胁迫下不同耐旱型紫花苜蓿抗氧化系统的影响
信使系统功能发生障碍,与 CPZ (氯丙嗪)、TFP
(三氟拉嗪)等其他CaM拮抗剂相比,W7不影响细
胞膜的结构和流动性[9-10]。因此,利用 W7和Ca2+
处理阻碍和增强Ca2+-CaM 信使系统是目前探索活
体植物Ca2+-CaM信使功能的重要手段。
苜蓿产业化正在我国干旱及半干旱地区迅速崛
起。干旱是紫花苜蓿(MedicagosativaL.)出苗及
成苗的限制因子之一[11]。目前国内外尚未见有关
Ca2+和CaM拮抗剂对干旱胁迫下不同耐旱型紫花
苜蓿抗氧化系统的报道。本试验采用向营养液中加
入聚乙二醇(PEG-6000)模拟干旱胁迫的方法,利用
钙调素拮抗剂 W7和 Ca2+ 浸种处理,研究 Ca2+-
CaM 信号对不同耐旱型品种紫花苜蓿抗氧化系统
的影响,从阻碍和增强Ca2+-CaM 信号转导2个角
度,探讨Ca2+-CaM信号在紫花苜蓿耐旱生理中的
作用机理。
1 材料与方法
1.1 供试材料
选择2种抗旱性强弱差异较大的紫花苜蓿:‘陇
东苜蓿’(抗旱型)和‘BL-02-329’(干旱敏感型)为试
验材料[11]。
1.2 试验处理
种子经45℃温水消毒10min后分成3份,分别
设150μmol·L-1 W7(Sigma公司生产)、2%
CaCl2[12]和重蒸馏水(对照)浸种3个处理,浸种24
h后将种子置于铺有滤纸的培养皿中,25℃催芽72
h后,选取发芽一致的饱满种子点播在带孔的营养
钵中育苗,培养室中控制昼温为22~28℃,夜温为
12~15℃。光照强度为110μmol·m-2·s-1,每天
光照8h,挑选整齐一致的幼苗定植到水培槽中,调
节营养液的pH 为6.5±0.5,营养液浓度(EC)为
1.8~2.2ms·cm-1,用通气泵间歇通气供氧(30
min·h-1),每隔7d更换一次营养液,幼苗长到六
叶时进行预培养。预培养7d后进行处理,营养液
中添加10%PEG-6000[12]。处理后,分别于0,1,3,
5,7d采集叶片,在根际不同方位取样,用清水冲
洗,吸干、称重,用液氮速冻后,贮存于-72℃下备
用。
1.3 测定项目及方法
O2-·产生速率、MDA含量,及SOD,POD,CAT
活性测定参照Jiang等[13]的方法测定,H2O2 含量
参照Uchida等[14]的方法测定,对O2-·方法略做改
进,将氧化产物 NO2-在对氨基苯磺酸和α-萘胺中
显色后的偶氮染料转移到等体积的三氯甲烷中,测
定水相液OD530。抗坏血酸(AsA)和还原型谷胱甘
肽(GSH)含量测定参照 Ma和Cheng[15-16]的方法,
试验中 MDA,H2O2,AsA,GSH含量均为单位鲜重
含量。试验所用试剂 GSH,AsA和烟酰胺腺嘌呤
二核苷酸磷酸(NADPH)等购自Sigma公司。
每个处理60株苗,每处理每次取样5株,3次
重复,酶活性比色测定采用UV-1700分光光度计。
1.4 数据统计分析
采用Excel2007和DPS7.05软件进行数据处
理和F检验,以平均值±标准差反应每个处理各指
标的大小。
2 结果与分析
2.1 Ca2+和 W7对PEG胁迫下不同耐旱型紫花苜
蓿品种叶中 MDA含量的影响
由图1可知,不同处理下不同耐旱型紫花苜蓿
品种叶片中过氧化产物 MDA含量存在一定差异。
W7处理下,陇东苜蓿(抗旱型)和BL-02-329(干旱
敏感型)MDA含量始终明显高于对照,在胁迫5d
时分别比对照增加21.5%和13.1%。与 W7和对
照相比,Ca2+处理显著降低了2个品种叶中 MDA
含量。在胁迫7d时,陇东苜蓿和BL-02-329Ca2+
处理叶片MDA含量分别比W7处理降低14.3%和
25.8%。表明 W7通过抑制Ca2+-CaM 的形成使植
物体内 MDA含量增加,加剧了紫花苜蓿细胞膜的
损伤,而Ca2+处理则通过促进Ca2+-CaM 的产生,
缓解了PEG胁迫对紫花苜蓿的伤害。
2.2 Ca2+和 W7对PEG胁迫下不同耐旱型紫花苜
蓿品种叶中O2-·产生速率和H2O2 含量的影响
由图2可知,PEG胁迫1d后,W7处理与对照
相比,显著加剧了 O2-·产生速率,提高了 H2O2 含
量;而Ca2+处理后,O2-·产生速率和 H2O2 含量明
显低于对照。BL-02-329(干旱敏感型)的O2-·产生
速率和H2O2 含量变化趋势与陇东苜蓿(抗旱型)相
似。表明 W7处理加剧了紫花苜蓿细胞膜的伤害,
而Ca2+处理可以延缓这种伤害。
3701
草 地 学 报 第20卷
图1 Ca2+和 W7预处理对不同耐旱型紫花苜蓿品种叶中 MDA含量的影响
Fig.1 EffectofCa2+andW7treatmentsofseedsonMDAcontentsofalfalfaunderPEGstress
注:图中不同小写字母表示差异显著(P<0.05),下同
Note:Differentsmallettersindicatesignificantdifference(P<0.05),thesameasbelow
图2 Ca2+和 W7预处理对PEG胁迫下不同耐旱型紫花苜蓿品种O2-·产生速率和H2O2 含量的影响
Fig.2 EffectofCa2+andW7treatmentsofseedsonO2-·productionratesandH2O2ofalfalfaunderPEGstress
2.3 Ca2+和 W7对PEG胁迫下不同耐旱型紫花苜
蓿品种叶中保护酶活性的影响
较高的SOD活性是植物抵抗逆境胁迫的生理
基础。由图3可知,陇东苜蓿(抗旱型)和BL-02-
329(干旱敏感型)SOD和POD活性于胁迫5d上
升至峰值。随胁迫时间的延长,W7处理的SOD和
POD活性显著低于Ca2+处理和对照。在胁迫5d
时,陇东苜蓿(抗旱型)Ca2+处理的POD活性分别
比 W7处理和对照升高25.8%和10.2%,BL-02-
329(干旱敏感型)Ca2+处理的POD活性分别比W7
处理和对照升高32.5%和14.6%。相同处理条件
下,BL-02-329的SOD和POD活性下降程度高于
陇东苜蓿。说明 W7通过抑制Ca2+-CaM的形成降
低了 SOD 和 POD 活性,Ca2+ 处理能显著促进
Ca2+-CaM的形成并提高SOD和POD活性。
2.4 Ca2+和 W7对PEG胁迫下不同耐旱性紫花苜
蓿品种叶中AsA和GSH含量的影响
抗坏血酸AsA和GSH是植物组织中重要的抗
氧化剂和氧化还原势调节剂,直接清除H2O2,修复
4701
第6期 张春梅等:Ca2+和钙调素拮抗剂 W7对PEG胁迫下不同耐旱型紫花苜蓿抗氧化系统的影响
图3 Ca2+和 W7预处理对PEG胁迫下不同耐旱型紫花苜蓿品种叶中SOD和POD活性的影响
Fig.3 EffectofCa2+andW7treatmentsofseedsontheSODandPODactivitiesofalfalfaunderPEGstress
自由基造成的伤害,防止逆境造成的膜脂过氧化伤
害[17]。PEG胁迫下,陇东苜蓿(抗旱型)和BL-02-329
(干旱敏感型)在 W7处理下AsA和GSH含量始终保
持下降趋势,对照GSH含量变化不大,而Ca2+处理与
对照相比则保持上升趋势,PEG胁迫7d,陇东苜蓿和
BL-02-329的 AsA含量分别上升41.7%和25.6%,
GSH含量分别上升39.5%和23.1%(图4)。表明外源
Ca2+处理能提高PEG胁迫下AsA和GSH的含量。
图4 Ca2+和 W7预处理对PEG胁迫下不同耐旱型紫花苜蓿品种叶中AsA和GSH含量的影响
Fig.4 EffectofCa2+andW7treatmentsofseedsonAsAandGSHcontentsofalfalfaunderPEGstress
5701
草 地 学 报 第20卷
3 讨论与结论
植物抗氧化系统受Ca2+-CaM信号的诱导和调
控。当遭受逆境胁迫时,Ca2+浓度上升,与钙受体
蛋白CaM结合激活一系列的靶酶和非酶蛋白,调控
植物生命代谢及基因表达[18-20]。Ca2+通过其浓度
的变化来稳定双脂层的基本结构,防止膜损伤、膜渗
透和维持膜的完整性[21]。研究表明,Ca2+浸种能提
高低温胁迫下茄子(Solanummelongena)幼苗的
SOD和CAT活性,降低 MDA 的积累,提高茄子幼
苗耐寒性[22];Ca2+浸种预处理可显著提高玉米(Zea
mays)幼苗的SOD和 APX活性,从而提高玉米幼
苗的耐热性[6]。对紫花苜蓿种子进行PEG引发试
验,结果表明PEG引发可提高其种子的发芽势和发
芽指数,通过提高相关酶活性来提高抗逆性[12]。本
试验结果表明,Ca2+通过调节PEG胁迫下不同耐
旱型紫花苜蓿保护酶SOD和POD的活性、O2-·的
产生速率以及 MDA在紫花苜蓿体内的积累,延缓
了PEG胁迫对紫花苜蓿造成的伤害。
Ca2+处理提高了高温胁迫时茄子幼苗GSH含
量[23],抑制热胁迫对辣椒(Capsicumannuun)叶片
GSH 的破坏[24]。本试验表明,Ca2+处理使干旱胁
迫下紫花苜蓿的AsA和GSH含量下降减缓,由于
Ca2+对谷胱甘肽还原酶(GR)活性有直接的调控作
用,GR可促进氧化型谷胱甘肽(GSSG)向还原型谷
胱甘肽(GSH)的转化[25],表明Ca2+处理能增强干
旱胁迫下紫花苜蓿抗氧化酶活性,钙信使可能参与
了干旱胁迫下紫花苜蓿GSH的降解。
综上所述,Ca2+-CaM 信号传导途径受阻会加
重对紫花苜蓿的伤害,CaM参与了干旱逆境胁迫下
幼苗抗氧化系统的调节。相同处理条件下,陇东苜
蓿(抗旱型)较BL-02-329(干旱敏感型)伤害程度
轻。Ca2+-CaM 信使作用机理有待进一步研究。
参考文献
[1] BohnertHJ,JensenRG.Strategiesforengineeringwater
stresstoleranceinplants[J].TrendsinBiotechnology,1996,
14(3):89-97
[2] XiongLM,SchumakerKS,ZhuJK.Celsignalingduring
cold,drought,andsaltstress[J].ThePlantCel,2002,14
(S):165-183
[3] 贾虎森,蔡世英,李德全,等.土壤干旱胁迫下钙处理对芒果幼
苗光合作用的影响[J].果树科学,2000,17(1):52-56
[4] NayyarH,KaushalSK.Chilinginducedoxidativestressin
germinatingwheatgrainsasaffectedbywaterstressandcalci-
um[J].BiologiaPlantarum,2002,45(4):601-604
[5] GongM,vanderLiutA,KnightMR,etal.Heat-shockin-
ducedchangesinintracelularCa2+levelintobaccoseedlingsin
relationtothermotolerance[J].PlantPhysiology,1998,116
(1):429-437
[6] GongM,ChenSN,SongYQ,etal.Effectofcalciumand
calmodulinonintrinsicheattoleranceinrelationtoantioxidant
systemsinmaizeseedlings[J].AustralianJournalofPlant
Physiology,1997,24(3):371-379
[7] 马淑英,赵明.钙对拟南芥耐盐性的调节[J].作物学报,2006,
32(11):1706-1711
[8] BushDS.Regulationofcytosoliccalciuminplants[J].Plant
Physiology,1993,103(1):7-9
[9] HiroyoshiHidaka,YasuharuSasaki,ToshioTanaka,etal.
N-(6-aminohexyl)-5-Chloro-l-naphthalenesulfonamide,acalm-
odulinantagonist,inhibitscelproliferation[J].Proceedingsof
theNationalAcademyofSciencesofUSA,1981,78(7):4354-
4357
[10]梁颖,王三根.Ca2+对低温下水稻幼苗膜的保护作用[J].作
物学报,2001,27(1):59-64
[11]韩瑞宏,卢欣石,高桂娟,等.紫花苜蓿抗旱性主成分及隶属函
数分析[J].草地学报,2006,14(2):142-146
[12]梁帅克,樊宏,张文明,等.无机盐溶液引发对紫花苜蓿种子活
力及幼苗抗逆性的影响[J].草原与草坪,2010,30(3):61-65
[13]JiangMY,ZhangJH.Effectofabscisicacidonactiveoxygen
species,antioxidativedefencesystemandoxidativedamagein
leavesofmaizeseedlings[J].PlantCelPhysiology,2001,42
(11):1265-1273
[14]UchidaA,AndreTI,TakashiH.Effectsofhydrogenperox-
ideandnitricoxideonbothsaltandheatstresstoleranceinrice
[J].PlantScience,2002,163(3):515-523
[15]MaFW,ChengLL.Thesun-exposedpeelofapplefruithas
higherxanthophylcycle-dependentthermaldissipationandan-
tioxidantsoftheascorbate-glutathionepathwaythantheshade
peel[J].PlantScience,2003,165(4):819-827
[16]MaF W,ChengLL.Exposureoftheshadedsideofapple
fruittofulsunleadstoup-regulationofbothxanthophylcy-
cleandtheascorbate-glutathionecycle[J].PlantScience,
2004,166(6):1479-1486
[17]龚吉蕊,赵爱芬,张立新,等.干旱胁迫下几种荒漠化植物抗氧
化能力的比较研究[J].西北植物学报,2004,24(9):1570-
1577
[18]SandersD,BrownIC,HarperJF.Communicatingwithcalci-
um[J].PlantCel,1999,11(4):691-706
[19]RuddJJ,FranklingTVE.Unravelingresponse-specificityin
Ca2+signalingpathwaysinplantcels[J].NewPhytologist,
2001,151(1):7-33
[20]SneddenW A,Fromm H.Calmodulinasaversatilecalcium
signaltransducerinplants[J].NewPhytologist,2001,151
(1):35-66
[21]雷江丽,杜永臣,朱德蔚,等.低温胁迫下不同耐冷性番茄品种
幼叶细胞Ca2+分布变化的差异[J].园艺学报,2000,27(4):
269-275
[22]高洪波,陈贵林.钙调素拮抗剂与钙对茄子幼苗抗冷性的影响
[J].园艺学报,2002,29(3):243-246
[23]陈贵林,贾开志.钙和钙调素拮抗剂对高温胁迫下茄子幼苗抗
氧化系统的影响[J].中国农业科学,2005,38(1):197-202
[24]张宗申,利容千,王建波.外源Ca2+预处理对高温胁迫下辣椒
叶片细胞膜透性和 GSH、AsA 含量及Ca2+分布的影响[J].
植物生态学报,2001,25(2):230-234
[25]郭丽红,陈善娜,龚明.钙对玉米幼苗谷胱甘肽还原酶活性的
影响[J].植物生理学通讯,2002,38(2):115-117
(责任编辑 李美娟)
6701