全 文 ：第 16 卷
第 6 期

Vol. 16
No . 6
草
地
学
报
ACTA AGRESTIA SINICA


2008 年
11 月

Nov.
2008
海雀稗幼穗离体培养植株再生
梁流芳1 , 佘建明2* , 吴瑛瑛1 , 张保龙2 , 董民强1 , 倪万潮2
( 1. 新昌白云草业工程技术研究开发中心, 浙江 新昌
312500;
2. 江苏省农业科学院农业生物技术研究所, 江苏 南京
210014)
摘要 : 本研究旨在离体培养条件下建立起海雀稗植株再生的技术体系,为开展海雀稗细胞和分子生物学育种工作创
造条件。以 Adalay 海雀稗(Paspalum vaginatum Sw. cv. Adalay)的幼穗为外植体材料, 在附加 2, 4
D 2. 0~ 4. 0 mg/ L
稍作修改的 MS 培养基上, 愈伤组织诱导率达 90%以上。不同发育时期的幼穗影响其愈伤组织的诱导发生频率:
1. 0~ 2. 0 cm 长的幼穗, 愈伤组织诱导率达 80%以上; 2. 0 cm 以上的幼穗, 诱导率降至 60% 以下。在添加 2, 4
D
2. 0 mg/ L和 BAP 0. 05 mg / L 的愈伤组织诱导培养基上, 诱导产生的颗粒状愈伤组织占愈伤组织总数的 40% 以
上。愈伤组织继代培养基中琼脂的用量提高到 16 g/ L 时, 愈伤组织在继代培养过程中保持颗粒状结构。颗粒状
愈伤组织经连续继代培养 3 次后转移到附加 BAP 2. 0 mg / L 的分化培养基上, 植株再生频率达 98%。通过提高愈
伤组织继代培养基的渗透压,海雀稗幼穗诱导产生的颗粒状愈伤组织在继代培养过程中能够保持颗粒状的结构和
高频率植株再生的能力。
关键词: 海雀稗; 幼穗;离体培养; 颗粒状愈伤组织;植株再生
中图分类号: Q813. 1; S812




文献标识码: A




文章编号: 1007
0435( 2008) 06
0590
04
In Vitro Plant Regeneration from Immature Infloreses of Sea
Dallisgrass (Paspalum vaginatum Sw. )
LIANG Liu
fang 1 , SHE Jian
ming2* , WU Ying
ying1 , ZHA NG Bao
long2 ,
DONG Min
qiang1 , NI Wan
chao2
( 1. Resear ch and Development Cen ter of Xin chang Baiyun Pratacultural Engineering T echnology, Xin chang, Zhejian g Province 312500, China;
2. Inst itute of Biotechnology, Jian gsu Academy of Agricu ltural S cien ces, Nanjing, Jiangsu Province 210014, China)
Abstract: Sea dallisgrass ( Paspalum v aginatum Sw . ) is a pr ospect ive candidate for use on go lf courses,
athlet ic fields, and landscape areas in w arm climat ic environment w or ldw ide. P lant regenerat ion is the bas

ic technique for the genetic improvement through biotechno logy. T his paper described an establishment
pro cedure of the plant reg eneration system in v it ro . T he immature inf loresces of P. v aginatum Sw . cv.
Adalay w ere used for the explant materials. In the modified MS medium supplemented w ith 2. 0~ 4. 0 mg

L - 12, 4
D, the rate o f callus induct ion w as up to 90%. The dif ferent development stag es of immatur e in

f lor esces affected on the f requency of callus induct ion. T he r ate of callus induct ion w as above 80% for the
inf lorescence w ith 1. 0- 2. 0 cm leng th and below 60% fo r over 2. 0 cm. T he rate of pellet callus w as up to
40% in the callus induct ion medium plus 2. 0 mg
L- 1 2, 4
D and 0. 05 mg / L BAP. During callus subcul

ture, callus maintained the pellet status in the same medium supplemented w ith 16 g
L - 1 agar. A fter
three subcutur es of the pellet callus, the frequency o f shoot regenerat ion w as 98% in the differ ent iat ion
medium w ith 2. 0 mg
L- 1 BAP. Pellet structure and high shoot regenerat ion fr equency of P . v aginatum
pellet callus w ere maintained by incr easing the o smo t ic pressure of callus induct ion medium.
Key words: Sea dallisgrass ( Paspalum vaginatum Sw . ) ; Immature inflor esce; I n vit ro ; Pel let callus;
Plant regenerat ion
收稿日期: 2007
01
15;修回日期: 2008
10
06
基金项目:绍兴市科技局科研项目( 2006A32009)
作者简介:梁流芳( 1966
) ,男,浙江新昌人,工程师,硕士, 主要从事草业研究和管理, E
mail: hzb ycy@ 163. com; * 通讯作者 Author for
cor resp on dence, E
m ail: Sh ejm101@ yahoo. com. cn
第 6期 梁流芳等:海雀稗幼穗离体培养植株再生


海雀稗( Paspalum v aginatum Sw . )具有较高
的耐盐、耐干旱、耐涝和耐磨损性,作为草坪草在世
界热带与亚热带地区广为种植, 是继狗牙根( Cyn

odon dacty lon( L. ) Pars. )、结缕草( Zoy sia japonica)
和假俭草( Fieinochloa ophiuroides L. )等暖季型禾
草之后兴起的后起之秀[ 1]。海雀稗在我国主要分布
于台湾、云南、广东和海南等省[ 2, 3] 。多年引种试验
结果显示,海雀稗在杭州和南京两地都能安全越冬,
但绿期与当地的狗牙根和结缕草相比偏短。
三倍体的海雀稗因花粉败育、自交不亲和等障
碍,给常规育种工作带来困难[ 4]。植物体细胞突变
体筛选和转基因技术的日趋成熟为改良草坪草开辟
细胞和分子生物学育种新途径。
迄今为止, 国内外有关海雀稗组织培养植株再
生和体细胞无性系变异仅有 1篇报道[ 5]。本研究以
海雀稗的幼穗为外植体材料, 旨在获得颗粒状胚性
愈伤组织,建立高频率植株再生的技术体系, 为开展
海雀稗细胞和分子生物学育种工作创造条件。
1
材料与方法
1. 1
供试材料
1. 1. 1
以深圳观澜湖高尔夫球场提供的
Adalay

( P. v aginatum Sw . cv. Adalay )品种为供试材料。
1. 1. 2
以颖花分花发育期幼穗为外植体材料。
1. 2
培养基
基本培养基由 MS 大量元素、微量元素[ 6] , B5
维生素 [ 7]组成,蔗糖 30 g / L。各种培养基在高压灭
菌前调整 pH 值至 5. 8。
1. 2. 1
愈伤组织诱导和继代培养基
附加 2, 4
D
2. 0 ~ 4. 0 mg / L , BAP 0. 05 mg/ L;愈伤组织诱导
培养基的琼脂糖为 8 g/ L , 愈伤组织继代培养基的
琼脂糖为 16 g / L。
1.2. 2
愈伤组织分化培养基
添加BAP 2. 0 mg/ L,
培养基的琼脂糖为 8 g/ L。
1. 3
培养方法
取不同颖花分花发育期幼穗, 在超净工作台上
用 70%的酒精彻底擦拭其叶鞘和茎, 剥出幼穗, 分
别切成 2~ 3 mm 段块, 接种在愈伤组织诱导培养
基上。
培养室温度为 26
2
。愈伤组织诱导和继代
培养在散射光下进行, 25 d 统计愈伤组织诱导率。
选择颗粒状愈伤组织进行继代培养, 20 d为 1周期。
将连续 3次继代培养的愈伤组织转移到分化培养基
上,在光照条件下培养, 25 d统计绿苗分化率。
2
结果与分析
2. 1
2, 4
D浓度对幼穗诱导愈伤组织的影响
取 1. 0 ~ 2. 0 cm 幼穗为外植体材料, 2, 4
D浓
度设置 2. 0 mg / L、4. 0 mg/ L 两组,愈伤组织的诱导
频率均达 90%以上(表 1)。
2. 2
幼穗发育期对愈伤组织诱导的影响
2, 4
D浓度为 2. 0 mg / L ,分别取 1. 0~ 1. 5 cm、
1. 5~ 2. 0 cm 和 2. 0~ 2. 5 cm 长的幼穗为外植体材
料,愈伤组织的诱导频率呈现出依次递减的趋势。
幼穗的长度低于 1. 5 cm 时,愈伤组织的诱导率高达
100%; 幼穗的长度超过 2. 0 cm 时,愈伤组织的诱导
率低于 60%(表 2)。试验结果显示, 海雀稗幼穗离
体培养诱导愈伤组织, 取材的最佳时期为 1. 0~
2. 0 cm长的幼穗。
2. 3
BAP对颗粒状愈伤组织诱导发生的影响
在愈伤组织诱导培养基中增添低浓度的 BAP,
愈伤组织总的诱导频率与单独附加 2, 4
D的效果基
本相当,均在 90%以上, 但其中颗粒状愈伤组织的
比率则有明显提高,从 26%上升到 42% (表 3)。试
验结果表明, 在愈伤组织诱导培养基中附加 2, 4
D
2. 0 mg / L 和 BA P 0. 05 mg / L 既能保持高频率的愈
伤组织诱导率,又能提高颗粒状愈伤组织的比例。
2. 4
琼脂对颗粒状愈伤组织及植株再生能力的影响
从愈伤组织诱导培养基上挑选出颗粒状愈伤组
表 1
2, 4
D浓度对愈伤组织诱导率的影响
Table 1
Effect o f 2, 4
D concentr ation on the r at e o f callus induction
2, 4
D 浓度( mg/ L)
2, 4
D con cent rat ion( mg
L- 1 )
接种穗的段数
No. of inf lorescence
产生愈伤组织的穗段数
No. of inf lorescence w ith callus
愈伤组织诱导率( % )
Rate of callu s induct ion
2. 0 136 131 96. 32
4. 0 130 119 91. 54
591
草
地
学
报 第 16卷
表 2
幼穗发育期对愈伤组织诱导率的影响
T able 2
Effect of development stage o f immature inflor esces on the rate of callus induction
幼穗长度( cm)
Length of inflorescence( m)
接种的穗段数
No. of inf lorescence
产生愈伤组织的穗段数
No. of inf lorescence w ith callus
愈伤组织诱导率( % )
Rate of callus induct ion
1. 0~ 1. 5 98 98 100. 00
1. 5~ 2. 0 112 94 83. 93
2. 0~ 2. 5 104 62 59. 62
表 3
BAP 对颗粒状愈伤组织诱导的影响
Table 3
Effect o f BAP on induction of pellet callus
激素种类及浓度( mg/ L)
Type & concent rat ion of hormone( mg
L- 1 )
愈伤组织总数
No. of total callus
颗粒状愈伤组织数
No. of pel let callus
颗粒状愈伤组织的比例( % )
Percentage of pellet cal lus
2, 4
D2. 0 143 38 26. 57
2, 4
D2. 0; BAP0. 05 105 45 42. 86
织,在愈伤组织诱导培养基上进行继代增殖培养(培
养基的固化剂
琼脂糖的用量为 8 g/ L)时,有相当比
例的黄色、干燥、颗粒状愈伤组织逆转为半透明、湿
润、粘状愈伤组织;而转移到愈伤组织继代培养基上
进行增殖培养时, 即琼脂糖的用量为 16 g / L 时, 在
1~ 5代继代培养过程中,愈伤组织始终保持颗粒状
的结构(图 1)。
图 1
颗粒状愈伤组织
F ig . 1
Pellet calli
经过连续 3次继代培养后的黄色、干燥、颗粒状
愈伤组织转移到愈伤组织分化培养基上, 15 d 左右
分化出绿苗(图 2) ,绿苗分化率达 98%。半透明、湿
润、粘状愈伤组织的绿苗分化率明显偏低,此类愈伤
组织经过连续 3次继代培养后彻底丧失植株再生的
图 2
颗粒状愈伤组织分化绿苗
F ig. 2
Shoo ts reg enerat ed fr om pellet calli
能力(表 4)。由此可见,在愈伤组织继代培养基中
提高琼脂的用量有利于保持愈伤组织的颗粒状结构
和高频率植株再生的能力。
绿苗转到新鲜的愈伤组织培养基上, 15 d左右
长成具有根、茎、叶完整的再生小植株(图 3)。带根
再生小植株的移栽成活率高达 100%(图 4)。
图 3
再生小植株
F ig. 3
Regener ated plantlets
图 4
植株移栽
F ig. 4
T ransplanted plants
592
第 6期 梁流芳等:海雀稗幼穗离体培养植株再生
表 4
愈伤组织继代培养 3次后的绿苗分化率
Table 4
Rate of shoo t reg enerat ion from the third subcutur ed callus
愈伤组织类型
Callu s type
愈伤组织总数
No. of total callus
绿苗愈伤组织数
No. of shoot cal lus
绿苗分化率( % )
Rate of sh oot regenerat ion
颗粒状愈伤 Pel let callus 100 98 98
粘状愈伤 S ticky cal lus 93 0 0
3
讨论
迄今为止, 有关海雀稗体细胞突变体筛选和基
因转化研究尚未见报道, 其主要原因是难以获得颗
粒状的胚性愈伤组织。在植物组织培养中,半透明、
湿润、粘状胚性愈伤组织在继代培养过程中逐渐丧
失绿苗分化的能力,尤其是在人工筛选的选择压下
和通过农杆菌介导后彻底丧失植株再生的能力, 从
而阻碍体细胞突变体筛选和农杆菌介导法基因转化
工作的进行。
Akashi R和 Adachi T .以毛花雀稗的幼穗为外
植体材料,在附加2, 4
D 2. 0~ 10. 0 mg / L 的培养基
上得到了胚性愈伤组织[ 8]。本研究以海雀稗处于颖
花分花时期的幼穗为外植体材料, 在附加2, 4
D 2. 0
mg/ L 和 BAP 0. 05 mg / L 的愈伤组织诱导培养基
上,诱导产生的浅黄色、干燥、颗粒状愈伤组织占愈
伤组织诱导总数的 40%以上。笔者曾通过调控植
物外源激素和愈伤组织诱导培养基的渗透压, 从草
地早熟禾的成熟种子诱导产生高频率的颗粒状愈伤
组织[ 9~ 11 ]。试验结果表明, 通过调控植物外源激素
和提高愈伤组织继代培养基的渗透压, 从海雀稗幼
穗诱导产生高比例的颗粒状愈伤组织, 颗粒状愈伤
组织在继代培养过程中能保持颗粒状的结构和高频
率植株再生的能力。颗粒状胚性愈伤组织适用于体
细胞突变体筛选和农杆菌介导法基因转化,为开展海
雀稗细胞和分子生物学育种研究工作提供基础条件。
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(责任编辑
才
杰)
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