全 文 ：武汉植物学研究 2007，25(1)：19～23
Journa／of Wuhan Botanical Research
RAPD在三色堇(Viola witrockiana)自交系遗传关系研究
及杂种优势预测中的应用
王 健 2，包满珠
(1．华中农业大学园艺林学学院，园艺植物生物学教育部重点实验室，武汉 430070；
2．华南热带农业大学园艺学院，热带园艺作物资源教育部重点实验室，海南儋州 571737)
摘 要：用RAPD技术分析了18个三色堇(Viola wittrockiana)自交系的遗传多样性。21个随机引物扩增了167条
带，其中127条具多态性，显示自交系间存在较大的遗传变异。用UPGMA法可将自交系聚为五大类，其分类结果
与花径和材料来源地基本一致。以其中的5个自交系进行双列杂交试验，研究了RAPD遗传距离与三色堇杂交后
代 10个性状杂种优势的关系，实验结果表明：RAPD遗传距离仅与花数达到0．1的显著水平，而与其它8个性状杂
种优势的相关性不显著；用 RPAD遗传距离预测三色堇的花数杂种优势具有一定的可靠性，但用于对其它性状杂
种优势的预测目前是不可行的。
关键词：三色堇；RAPD；遗传关系；杂种优势
中图分类号：Q943；$681．9 文献标识码：A 文章编号 ：1000．470X(2007)O1．0019．05
Application of RAPD on Analysis of Genetic Relationships between Inbred
Lines and Prediction of Heterosis in Pansy(Viola witrockiana)
WANG Jian ．BAO Man—Zhu ’
(1．J Laboratory ofHorticultural Plant Biology，Ministry ofEducation，Colege ofHorticulture and Forestry Sciences，Huazlwng gr 如lmf Uniter-
sitr，Wuhan 430070，China；2．HorticulturalDepartment，South China c E，e，s ofTmp~alAgr~ulmre，Danzhou，Hainan 571737，China)
Abstract：RAPD was used to analyse the genetic diversity between 1 8 inbred lines of pansy．and 5 inbred
lines were selected for a diallel analysis to study the correlations betw een the genetic distances based on
RAPD an d the heterosis of 10 traits of pan sy．Twenty—one random primers were selected an d 127 polymor-
phic bands out of total 167 were obtained，and UPGMA cluster analysis was performed，to obtain 5 main
groups，which were consistent with the flower size types an d the original places of the inbred lines．No sig—
nifican t correlations were observed between the RAPD distance an d heterosis in all traits except for the
flower numbers at 0．1 leve1．The results indicated that it is unsuitable to predict heterosis of these traits
expect for the flower number using RAPD genetic distance in pansy at present．
Key words：Viola wittrockiana；RAPD；Genetic relationship；Heterosis
三色堇(V／oht witrockiana)，又名蝴蝶花、鬼脸
花，是冬春重要的盆栽花卉。目前三色堇品种十分
繁多，各品种类群问的遗传关系十分复杂，要进一步
培育新品种，弄清各品种类群问的遗传关系是十分
必要的。传统上常通过外部形态特征来研究品种问
的遗传关系，但形态特征易受环境的影响而使结果
出现偏 差。RAPD (random amplifed polymorphie
DNA)，即随机扩增多态性 DNAu．2 技术，能从 DNA
水平上分析不同个体之间的差异，不受栽培环境等
因素的影响，目前已在园林植物的亲缘关系研究方
面有了一些应用 J。在堇菜属 RAPD研究方面，
Lee用 RAPD技术标记 了韩 国堇菜 属的 3个亚
属 ，Oh曾用 RAPD技术来区分堇菜属中的不同
种 ；但用 RAPD研究不同三色堇品种或 自交系问
的遗传关系则尚未见报道。
基于分子标记的遗传距离用于杂种优势的预测
在园艺作物上已有了较多的应用[8 】。本试验拟采
用RAPD技术，研究 18个三色堇自交系的遗传关
系，为杂交新品种的培育提供必要的遗传资料。同
时研究三色堇 RAPD遗传距离与多个观赏性状的杂
收稿日期：2006 06-21。修回日期：2006-09一ll。
基金项 目：农业部基金项目(2003-7-36)资助。
作者简介：王健(1977一)，男，湖北神农架人，博士，从事园林植物遗传育种研究。
· 通讯作者(Author for correspondence．E-mail：mzbao@mail．hzau．edu．cn)。
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武 汉 植 物 学 研 究 第 25卷
种优势、性状值和配合力之间的相关关系，以期为三
色堇杂种优势预测提供理论依据。
1 材料与方法
1．1 材料
RAPD扩增试验用的三色堇(V／oht witrockiana)
l8份自交系均 由本实验室 2000—2004年 自交得
到，其编号、来源与主要观赏特点见表1。田间试验
选用其中5个性状已比较稳定的 F。或 F 代 自交系
3、8、9、12、18，来源分别是欧洲(3、8、9)、中国(12)
与美国(18)，具有一定的代表性。
表 1 三色堇 18个自交系的材料与来源地
Table 1 Original accessions and places of
eighteen inbred lines of pansy
·3个主要类型。s：小花型；M：中花型；L：大花型。
· Three main types 0fflower size：S for muhitlora．M for
medium，and Lforlarge．
1．2 田间试验
采用 Grifilng双列杂交方法2进行杂交试验，自
交系于2004年 3月杂交得到 F 代种子，2004年 9
月将亲本与 F 播种于穴盘，l0月中旬定植于直径
17 cm的瓦盆，随机区组设计，3次重复。2005年 3
月 16日(盛花期)进行 l0个性状的测量与统计。
这 l0个性状分别是：花径，以花心为中心，分别测花
的横径与纵径，取二者平均值；花数，每植株所具有
已开放的花朵总数；花葶长，从花葶基部到花朵基部
的长度；分枝数，每植株所具有的长度大于 5 cm的
分枝总数；株高，自植株基部至顶端的自然高度；株
幅，植株最宽幅度与最窄幅度的平均值；高／幅，即株
高与株幅之比；叶型指数，叶长与叶宽之比；开花指
数，由公式：花数 ×(花，径／株幅) 计算而来 叫¨：叶
面积，由椭圆叶片计算公式：(1／4)百(叶长×叶宽)
计算而来。
1．3 三色堇总 DNA提取与 RAPD扩增
三色堇总 DNA提取参照项艳等 ¨的方法。
RAPD反应在PTC一100基因扩增仪上进行。所用引
物为 Operon、Sangon及 Bioasia公司产品，均为 l0碱
基随机引物。扩增反应体系为：10 mmol·L～Tris—
HC1(pH 9．0)，50 mmol·L～KC1，每种 0．2 mmol·
L。。dNTP，2．5 mmol·L MgCl2，0．4 traol·L 引
物，40 ng模板 DNA，1．2 U Taq DNA聚合酶(大连宝
生)，反应体积为 20 。扩增反应程序为：94℃预
变性 2 min，然后按程序：94℃ 30 s，36oC 30s，72oC
1．5 min扩增 4O个循环，最后在 72℃延伸 10 min。
扩增产物在 1．4％ 琼脂糖凝胶中电泳 1．5—2．0 h，
电泳液为 1×TAE，在凝胶中加入 0．5 I．Lg·mL
EB。电泳后在紫外灯下观察照相。
1．4 数据统计与计算
RAPD扩增谱带按有(1)和无(0)记录，根据
Nei相似系数计算任意两样品间的相似系数 F =
2ⅣxY／(Nx+ⅣY)，ⅣxY为品种 x和 Y经 RAPD扩增
反应分子量相同的谱带总和，Ⅳx、ⅣY分别代表品种
x、品种 Y经 RAPD扩增反应的谱带总数 ，遗传距离
GD=1一F，再根据遗传距离利用UPGMA法构建遗
传聚类图，bootstrap自展 500次，计算运用 FREE—
TREE软件进行。
双列杂交资料按刘来福等 ¨的方法进行方差
分析，并估算一般配合力与特殊配合力效应值。杂
种优势根据下列公式计算：中亲优势 胛 =F ／MP一
1；超亲优势MP=F ／ ’一1。其中 为 F 代杂种性
状值，MP为中亲值，且MP=(P +P )／2，P 、Pz分
别为亲本 1与2的性状值，卯 为优亲值。用 SAS
软件计算 RAPD遗传距离与杂种表型值、杂种优势
和特殊配合力的相关系数。
2 结果与分析
2．1 RAPD分析
21个引物共扩增出167条带，多态性带127条，多
态性比例为76．05％，说明不同的自交系间有丰富的
遗传多样性。引物与基因组DNA随机结合，最多扩
增出l3条带，最少有2条带，21个引物平均扩增的条
带数为7．95，扩增产物的分子量集中在0．2—2．0 kb
之间。图 1是引物 M14的 RAPD扩增图谱。
根据 Nei的计算公式，计算出 l8个 自交系间的
遗传距离矩阵，其 中自交系间最大的遗传距离是
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第 1期 王 健等：IL,~．PD在三色堇(Viola r。c m)白交系遗传关系研究及杂种优势预测中的应用
妹道1—18(从左{ 矗j依擞代表ts+自主系．诛道M为DNA标记
L 1 l8(from lett tu right located m DNAs of】8 iahred
l ne日 m Ⅺ (inb rtd】{慨 used areli~edin Table1)；
IHT M is DNA ma 盯
图 1 引物 M H扩增的18个三色堇自交系的RAPD图谱
Fig l The profile ofRAPD of18inbredlines of
wittrockh~naⅢ 【 甜 with M14
0．32，最小的仅有0．02，说明这些自交系间的遗传
差异变化范围较大。根据遗传距离值，用系统聚类
法对 18个 自交系进行聚类分析，得到UPCMA树状
聚类图(图2)。从图中可以看出，18个 自交系可以
分为5大类，自交系 1、14较为特殊，是与其它材料
有明显区别的小花类型，分别列为一类，且白交系 l
得到了 100％的bootstrap自展值支持，说明这一分
类是相当可靠的；C类群基本都由来 自欧洲的品系
组成，而 D类群则由来 自美国的品系组成，但它们
的bootstrap值都不高；自交系 3与 13单独聚为一
类，但未得到高度的 bootstrap值支持。从 自交系的
自交来源来看，来自同一原始材料的自交系往往聚
在一起，而且有高的自展值支持，如自交系6和 7，
白交系lO和 1I，自交系 l5、16和 I7，说明 R．M)D在
鉴别三色堇的亲缘关系时是比较可靠的。
图内数据指每一节点的bootstrap支持值(低于10的没有列出)．
^～E： 娄分析得到的5太类群
The numhem mpreaented pement bootstrap p n of each node
(values bek,~lO％ are not ven)．A—E：] e 5 groupsfmm UPG—
MA analysi s
圈 2 三色堇 18个自交系基于 RAPD数据的
UPGMA 聚粪围
Fig．2 The UPGMA dendmgram of 18 inbred liaes of
wlaroekiana based On lhe results RAPD d8ta
2 2 杂种优势分析
10个性状的杂种优势值见表 2。花部肚状中，
花径各杂交组合均呈正向优势，其中组合 12×18杂
种优势值最大，优势塌为显著，其次8×12，9 x 18也
有较大的优势，而 3 x 8、3 x12的优势则较小；花数
从总体来看．杂种花数相对于优亲是下降的，但不同
组合杂交优势表现差异很大．如 12×18高达 I．10
(MP)，显示了强烈的优势，而 3×12则为 一0 23，有
较强的负向优势；花瓣厚多数杂交组合呈正值，表现
出一定的杂种优势；开花指数多数杂交组台呈负值，
但组台8 X12、12×I 8有较大的优势，说明这两个组
合的观赏性有较大的提高 营养性状中，株幅的中
亲优势均为正值，且优势较大，但具有亲本 l2的杂
交组台其超亲优势较小或为负值，如3×l2，8×12，
是因为自交系 12本身具有较大的株幅；株高的超亲
优势很小，说明杂种后代株高趋向高亲 不同杂交
组台Ⅱf-面积的杂种优势一般较小或为微弱负值．而
分枝数则普遍有大的优势
总体来看．多数性状都有正向的杂种优势，而且
株幅、分枝数等营养性状都有较大的优势，表明在三
色堇的杂种后代中杂种优势是一个较为普遍的现
象，这与齐鸣 的研究结果类似。杂交组台 8×
I2、l2 x 18在花径、花数、开花指数 、花瓣厚等主要
观赏性状上都有较大正向优势 ．可作为优良的杂交
组台扩大繁殖。
2．3 基于 RAPD的遗传距离与杂种优 势的关系
对双列杂交后资料进行配合力方差分析。由于
杂交组合9×18缺失，因此在分析中剔除了自交系
9及其杂交后代 结果显示在调查豹性状中，株幅
与花数的一般配合力方差达到显著水平．而其余的
均未达显著水平；花径与花数的特殊配台力方差达
到显著水平，而其余的均未达显著水平(数据未列
出)。因此在相关分析中只分析了株幅与花数的一
般配合力和花径与花数的特殊配合力与RAPD遗传
距离及杂种优势的相关性。
根据 KAPD数据计算 Grifing试验中5个自交
系亲本的遗传距离矩阵 5个 自交系之间的遗传距
离都较小(平均 0．223)，其 中3与 12的距离最大
(0．255)．8与9或9与 l2的距离最小(0．191) 自
交系UPGMA聚类树见图3，可见8与9遗传距离最
小．而 3与其它 自交系亲缘关系较远。遗传距离与
杂种表型值、杂种中亲优势、杂种超亲优势、一般配
合力和特殊配合力的相关系数见表 3．其中亲本的
平均遗传距离用该亲本的所有组合双亲问遗传距离
平均值表示，用于与亲本的一般配合力的分析
由表3可知，由RAPD计算得到的遗传距离与
绝大多数性状的相关性不显著，表明不能用RAPD遗
A H C D E
i ； ￡l9 ”_二．r
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22 武 汉 植 物 学 研 究 第 25卷
注：GD，RAPD遗传距离； ，FI表型值；HM，中亲优势；lib，超亲优势；GCA，一般配合力 ；SCA，特殊配合力。·。··分别表示达到0．1，
O．O1显著水平。括号内数据表示决定系数(R2)。
Notes：GD，genetic distance；F1，Fl phenotypic value；HM，heteresis over mid-parent；lib，heterosis over beter parent；GCA，general combination
ability；SCA，special combination ability．·，·· for significant level at Q 1，O．01，respectively．Data in parenthesis aIe R2
．
3
18
12
8
9
图 3 双列杂交亲本基于 RAPD遗传距离的 UPGMA
聚类图(图内数据指每一节点的 l~ootstrap支持值)
Fig．3 The UPGMA dendrogram based on RAPD genetic
distance ofparental lines in dialel trails．Th e numbers
represented percent bootstrap support of each node
传距离可靠地预测三色堇的杂种优势。但是值得注
意的是，BAPD距离与花数的F 代表现值、中亲优
势、超亲优势的相关系数均达到0．1的显著水平(P
值分别为0．092、0．069、0．058)，且决定系数分别为
0．55、0．40、0．42，说明 RAPD遗传距离在花数的形
成中占有较大的比例，因而用 RAPD遗传距离预测
花数的杂种优势具有一定的可靠性。
特殊配合力与中亲优势、超亲优势的相关关系
达到极显著的水平，而且决定系数也较高(表 4)，说
明三色堇中用特殊配合力预测杂种优势的可靠性很
高。但RAPD距离与一般配合力、特殊配合力的相
关关系不显著，说明用 RAPD距离也不能有效的预
测配合力。
3 讨论
3．1 RAPD用于三色堇自交系遗传关系的确定
三色堇传统上一般按花径大小分为巨大花系、
大花系、中花系与小花系，又可按花色斑的有无分为
纯色类、杂色类 ，还可按用途分 为盆花类 和切花
类u引。从本试验的结果来看，这 l8个三色堇 自交
系的分类与花径的关系较大，小花与大花的类型基
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第 1期 王 健等：RAPD在三色堇(Viola wittrockiana)自交系遗传关系研究及杂种优势预测中的应用
本上被分开，与地理来源也较一致，因此可根据这两
方面的资料初步判断三色堇的遗传差异，这与上述
花径的分类标准较为一致。但色斑有无与 RAPD分
类不太吻合 ，如无色斑的自交系 10、11没有与自交
系9聚为一类，它们与其它有色斑的自交系也没有
孑然分开，可能是因为这一性状只由少数的基因或
主效基因控制 引¨，在 RAPD数据中难以起到主要的
作用。
聚类结果与各 自交系的来源也有一些差异，如
自交系3来自品种‘Swiss Giant Evening Glow’，却与
其它‘Swiss Giant’系列的自交系划分开来；自交系2
来 自 ‘Swiss Giant Red Wing’，却 与来 自 ‘Joker
Orange’的自交系 4聚为一类。造成这一现象的原
因则可能是因为三色堇育种时期较长，育种地区也
很广泛，它的异交习性和长期的人工杂交选育使不
同品种间的血缘关系甚为复杂，因而有可能出现品
系内的遗传距离反而比品系外大的现象。但值得注
意的是它们都是来 自欧洲的品种，与美国亲缘的自
交系明显分开 ，显示了地理差距在亲缘关系分化中
的作用。
3．2 RAPD遗传距离与杂种优势预测的关系
分子标记用于杂种优势的预测已有了较多的研
究，但多数研究的预测效果因实验材料、研究手段的
变化而不同甚至相反 ¨墙】，表明用分子标记的遗传
距离预测杂种优势离实际应用还很远。Bemado从
理论上分析了分子标记预测杂种优势的效果 ¨，认
为要有效地预测杂种优势必须满足以下条件：①显
性作用较强；②亲本自交系问位点杂合；③性状遗传
力高；④平均亲本所有位点的频率变化范围窄；⑤至
少 30％ 一50％的 QTL与分子标记连锁；⑥不超过
20％ 一30％的分子标记随机分布或与 QTL无关。
可见，用分子标记准确地预测杂种优势较困难。从
本实验结果来看，三色堇的 RAPD遗传距离与各性
状的杂种优势相关性很弱，仅与花数有达到0．1水
平的相关性，说明简单地用RAPD遗传距离预测三
色堇的杂种优势是不适当的。可能的原因是：①扩
增的RAPD位点偏少，不足以覆盖全部基因组，降低
了遗传距离计算的精度；②RAPD标记包含了与相
应性状不相关的大量位点；(~)RAPD本身存在的一
些缺点，如易产生假带，重复性较差，以及产生共迁
移现象，使其反应的遗传信息出现了偏差，从而导致
了遗传距离计算上的偏差l加】。Zhang等[2¨在水稻
中的研究表明：亲本问基于全部分子标记的一般杂
合性与 F。表现和杂种优势相关程度低，而基于与特
定性状连锁的标记的特殊杂合性，则与中亲优势显
著相关 ，在统计上达到了用于预测杂种优势的水平。
因此只有在选用更多更有代表性的自交系、筛选出
与调查性状杂种优势特异相关 的引物或位点后，
RAPD技术才能较为准确地预测三色堇杂种优势。
参考文献：
Wiliams J G K，Kubelik A R，Livak K J．DNA polymorphisms
amplifed by arbitrary primers are useful as a genetic markers
[J]．Nuc／e／c Ac／ds Res，1990，18(22)：6531-6535．
Wdsh J．Meleland M．Fingerprinting genomes using PCR with at-
bitrary primers[J]．Nudeh~Adds Res，1990，18(24)：7213—
7218．
王亚玲，李勇，张寿洲，崔铁成．几种玉兰亚属植物的 RAPD
亲缘关系分析[J]．园艺学报，2003，30(3)：299—302．
苏友波，林春，毛静，莫锡君，杨明．香石竹品种的 RAPD标记
[J]．园艺学报，2004，31(1)：109一l11．
秦贺兰，游捷，高俊平．菊花 18个品种的RAPD分析[J]．园
艺学报，2002，zg(5)：488—490．
Lee C H，V／o／a native to Korea[J]．．，Kor F／ower Res Soc，1993，
2：13—22．
Oh B J，Ko M K，Lee C H．Identification of the series—specifc
random amplifed polymorphie DNA markers of Viola species[J]．
Plant B,~ iag，1998，117：295—296．
Shieh G J，Thseng F S．Genetic diversity of Tainan-white maime
inbred lines and prediction of single ero~s hybrid performance
using RAPD markers[J]．Euphytica，2002，124：307—313．
夏立新，陈德富，哈玉洁，杨瑞环，付海鹏 ，陈喜文，李修庆．黄
瓜亲本间分子遗传距离与杂种优势的相关性[J]．南开大学
学报(自然科学)，2001，34(2)：92—94．
陈俊愉，王四清，王香春．花卉育种中的几个关键环节【J]．园
艺学报，1995，22(4)：372—376．
项艳，朱苏文，程备久．板栗基因组 DNA几种提取方法比较
研究[J]．安徽农业大学学报，2001，28(1)：36—39．
刘来福，毛盛远，黄远樟．作物数量遗传[M]．北京：农业出版
社。1984．
齐鸣．三色堇杂交 1代优势研究初报[J]．浙江农业科学，
2003。6：309—3l1．
陈俊愉．中国农业百科全书(观赏园艺卷)[M]．北京：农业
出版社，1996．
程金水，园林植物遗传育种学[M]．北京：中国林业出版社，
2Ooo．
Smith O S，Smith J S C，Bowen S L．Similarities among a group of
elite maize as measured by heteresis and RFLPs[J]．Theor Appl
Genet，1990，80：833 — 840．
Cema F J，Cianzio S R，Rafalski A。Tingey S，Dye R．Relationship
be tween seed yield heteresis and molecular marker heterozygosity
in sobybean[J]．TheorAppl Genet。1997。95(3)：360—367．
吴敏生 ，王守才 ，戴景瑞．RAPD分子标记与玉米杂种产量优
势预测的研究[J]．遗传学报，1999，26(5)：578—584．
Bematdo R．Relationship betwen single．elx~S performance and
molecular nu~er heterozysity[J]．Theor appt Genet。1992，83：
628—634．
郑成木．植物分子标记原理与方法[M]．长沙：湖南科学技术
出版社，2003．
Zhang Q F，Gao Y J，~ang S H．A dialel analysis of heterosis in
dite hybrid rice based on RFLPs and mierosatel1lites[J]．Theor
APpZ C ，1994，89：185—192．
] i ] ] ] ] ] ] j j ； ] ] r=1 纠 引 I=1 I=1 Ⅲ 例 川 例 I三1 驯
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